Том 9, № 1 (2019)

За последние 2–3 десятилетия благодаря использованию новых технологий было значительно расширено представление о спектре функциональных возможностей нейтрофильных гранулоцитов. Детально изучен их эффекторный потенциал в отношении инфекционных агентов, включающий фагоцитоз, продукцию активных форм кислорода и азота, дегрануляцию с высвобождением многочисленных ферментов и антимикробных пептидов, образование внеклеточных ловушек. При этом установлено, что многие их тех факторов, которые нейтрофилы используют для прямого уничтожения патогенов, оказывают регулирующее влияние в отношении других клеток иммунной системы и самих нейтрофилов. Кроме того, при активации нейтрофилы способны синтезировать ряд биологически активных молекул de novo. Реализация иммунорегуляторного влияния нейтрофилов в отношении макрофагов, дендритных клеток, Т-лимфоцитов и В-лимфоцитов может происходить как путем прямого межклеточного контакта, так и опосредовано через продукцию цитокинов и других биологически активных медиаторов. Амбивалентное — как хелперное, так и супрессорное — воздействие нейтрофилов на клетки иммунной системы свидетельствует об их важной роли как в условиях гомеостаза, так и при различных видах патологии, в частности при развитии злокачественных опухолей. Способность нейтрофильных гранулоцитов проявлять разнообразные, порой даже антагонистические варианты воздействия на иммунные клетки и клетки других тканей, свидетельствует об их функциональной пластичности и, вероятно, гетерогенности. При этом вектор активности, проявляемой нейтрофилами, во многом зависит от того микроокружения, в котором они оказываются, выходя из периферического кровотока. Традиционно считаясь индукторами воспалительной реакции, нейтрофилы демонстрируют способность параллельно включать механизмы, способствующие ограничению и разрешению воспаления. Благодаря интравитальной микроскопии в моделях на животных установлена способность нейтрофилов возвращаться в кровоток после выхода во внесосудистое пространство, что бросает вызов классической концепции однонаправленности миграции нейтрофилов из сосудистого русла в ткани. Также получены доказательства, что в определенных условиях нейтрофилы могут проявлять себя как антиген-презентирующие клетки по отношению к Т-лимфоцитам и рекрутироваться из сайтов воспаления в дренирующие лимфатические узлы. И хотя многие данные получены в условиях in vitro или в моделях на животных и поэтому требуют дополнительного изучения и подтверждения, однозначно можно констатировать, что влияние нейтрофилов не ограничивается рамками системы врожденного иммунитета.

Инфекционные  заболевания вирусной этиологии являются одной из важнейших проблем здравоохранения. В России ежегодно регистрируется около 50 млн случаев инфекционных заболеваний, до 90% из которых приходится на долю острых респираторных вирусных инфекций. В неэпидемические по гриппу сезоны в качестве основных возбудителей ОРВИ выступают аденовирусы, респираторно-синцитиальный  вирус, вирусы парагриппа и др. Инфекционные  заболевания, вызванные аденовирусами, характеризуется полиморфизмом проявлений, что делает их интересными для изучения и в то же время сложными для клинической диагностики. Применение быстрых, чувствительных и специфичных тестов является актуальным для рутинной клинической лабораторной практики. Для дифференциальной диагностики аденовирусных инфекций в России широко применяются иммуноферментный и иммунофлуоресцентный анализ с применением поликлональных специфичных сывороток, характер и спектр реагирования которых зависит от особенностей иммунного ответа животного-продуцента и состава вырабатываемых антител. Включение в состав современных иммунологических тестов моноклональных антител, направленных к определенным антигенным детерминантам в составе вируса, определяет высокую чувствительность, специфичность и необходимый уровень стандартизации препаратов. Гексон аденовирусов содержит родоспецифические антигены и обладает достаточно консервативной аминокислотной последовательностью среди аденовирусов разных типов. Кроме того, этот белок синтезируется в инфицированных клетках в больших количествах и может быть получен в нативной форме, что определило его использование в качестве иммуногена для получения моноклональных антител, способных выявлять аденовирусы различных типов. Получена панель моноклональных антител к гексону аденовируса. Изучены их биологические и диагностические свойства. По результатам вестерн блоттинга можно заключить, что все моноклональные антитела связываются с олигомерами гексона в составе аденовируса. Специфическая активность новых моноклональных антител в отношении аденовирусов разных типов исследована методами иммуноферментного и непрямого иммунофлуоресцентного анализа. Наибольшей специфической активностью в иммуноферментном анализе обладают моноклональные антитела 4B7 и 6B12, титр антител составил 10^–6. Наибольшей активностью в отношении различных типов аденовирусов в непрямом иммунофлуоресцентном анализе обладали моноклональные антитела 6В12, при использовании которых в инфицированных аденовирусами 3, 4, 6 и 19 типов клетках наблюдалась яркая гранулярная флуоресценция преимущественно ядерной локализации. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования новых моноклональных антител 4B7 и 6В12 для конструирования современных диагностических тест-систем.

Случаи заболевания людей птичьими вирусами гриппа А (H5N1) характеризуются тяжелыми клиническими проявлениями и высоким уровнем летальности. Основная проблема вакцин Н5N1 заключается в их низкой иммуногенности для людей. Прайм-буст иммунизация считается эффективным  подходом к усилению иммуногенности вакцин. Целью данной работы было сравнение иммунного ответа и защитной эффективности  при использовании следующих схем прайм-буст иммунизации мышей: 1) праймирование и бустирование живой грипозной вакциной (ЖГВ) А/17/Turkey/Turkey/05/133 (H5N2); 2) праймирование ЖГВ А/17/Turkey/Turkey/05/133 (H5N2) и бустирование инактивированной  гриппозной вакциной  (ИГВ) «Орнифлю» (H5N1). Оба способа характеризовались усилением продукции сывороточных антител к гомологичным и гетерологичным штаммам вируса гриппа А. Достоверное увеличение титров антител к гомологичному штамму по данным РТГА обнаруживалось только при двукратной вакцинации ЖГВ. Более чувствительный метод ИФА выявил достоверное увеличение титров специфичных к вирусу сывороточных IgG как при обоих способах прайм-буст иммунизации, так и при однократном введении мышам ЖГВ или ИГВ. Бустирование как ЖГВ, так и ИГВ достоверно повышало титры сывороточных IgG к другим генетическим линиям вирусов A (H5N1): в большей степени к гомологичному A/NIBRG-23 (clade 2.2), штамму A/Indonesia (clade 2.1) и в меньшей степени к более генетически удаленному A/Vietnam (clade 1), а также к гетерологичному А/New York (H1N1). Однократная вакцинация ЖГВ также вызывала достоверный прирост антител ко всем использованным вирусам, хотя количественно меньший, чем при любой прайм-буст иммунизации. По способности стимулировать специфичные к гомологичному штамму CD8+ Т-лимфоциты селезенки, оптимальной схемой оказалась прайм-буст иммунизация ЖГВ/ИГВ, которая привела к достоверному увеличению этих клеток по сравнению с контрольной группой, в отличие от всех остальных случаев. Обе бустирующие вакцины (ЖГВ и ИГВ) показали высокий уровень защиты при летальном челлендже вирусом А (H1N1) и снижение титров вируса в легких по сравнению с отрицательным контролем. Оба способа прайм-буст иммунизации приводили к практически полному клиренсу вирусов А (H5N1) в легких и носовых ходах мышей, вне зависимости от штамма. Полученные результаты свидетельствуют о формировании перекрестного иммунитета к вирусам A (H5N1), относящимся к различным кладам и о целесообразности прайм-буст вакцинации для формирования иммунитета к птичьим вирусам А (H5N1).

В работе представлены результаты сравнительного исследования созревания дендритных клеток, выделенных из мононуклеаров периферической крови, здоровых добровольцев и пациентов с хроническим остеомиелитом. У всех пациентов был выделен Staphylococcus aureus. Для созревания дендритные клетки культивировали при стандартных условиях в ростовой среде (RPMI-1640, антибиотики, L-глутамин, 15% телячья эмбриональная сыворотка) в присутствии интерлейкина-4 и гранулоцитарно-макрофогального колониестимулирующего фактора с последующим добавлением коктейля стимуляторов, включавшего интерлейкин-1β, фактор  некроза  опухоли-α,  интерлейкин-6,  простагландин  Е2.  Визуальные характеристики  дендритных клеток в процессе созревания определяли с помощью инвертированного микроскопа  Zeiss ODSERVER.Z1 с программой визуализации изображений AxioVision Rel.4.8, используя световую и фазовоконтрастную микроскопию при увеличении ×40, ×100, ×200, ×400, ×630. Определение иммунофенотипа дендритных клеток проводили с использованием панели моноклональных антител: CD80FITC,  CD86 (B7–2)PE, HLA-DR  PC7 (Beckman Coulter, США), CD14PerCP-Cy5.5, CD83APC, CD40PE-Cy7 (Becton Dickinson, США) с соответствующими изотипическими контролями на цитофлуориметре FACS Canto II (Becton Dickinson, США). Показано, что в процессе созревания дендритные клетки пациентов, так и у условно здоровых доноров, увеличиваются в размерах и приобретают отростчатую форму. Экспрессия CD86, CD83, CD80, CD40 у пациентов с хроническим остеомиелитом выражена ниже, чем экспрессия соответствующих маркеров у условно здоровых добровольцев. После стимуляции дендритных клеток пациентов с остеомиелитом достоверно увеличивается процент клеток CD83+  и клеток, несущих костимулирующие молекулы CD86, CD80, СD40. По мере созревания различия, выявленные при исследовании незрелых клеток здоровых добровольцев и пациентов с остеомиелитом, исчезают, и на 10 сут уровень экспрессии ключевых маркеров оказывается на близких по значениям уровнях. При этом экспрессия основного маркера дифференцировки СD83 и костимулирующей молекулы CD80 у пациентов с остеомиелитом увеличивается интенсивнее, чем у здоровых. Таким образом, способность дендритных клеток, выделенных из моноцитов периферической крови, пациентов с хроническим остеомиелитом, вызванным Staphylococcus aureus, к созреванию под влиянием активаторов in vitro не нарушена. Полученные результаты открывают возможность использования дендритных клеток в качестве естественного, замещающего адъювант компонента при разработке вакцин для лечения хронического остеомиелита.

В настоящем исследовании рассматривается разработка метода определения уровня антирабических антител в иммунных сыворотках и препарате иммуноглобулина с использованием проточной цитометрии. Метод основан на измерении уровня флуоресценции в клетках Vero, инкубированных в питательной среде с добавлением смеси разведений антирабических сывороток или препарата иммуноглобулина и аттенуированного штамма вируса бешенства «Москва 3253», адаптированного к репродукции на перевиваемых клеточных линиях. Для определения уровня антител образцы антирабических сывороток и иммуноглобулина следует разводить в солевом растворе соответственно в 20 и 200 раз. При этом рекомендуемая доза вируса должна составлять 0,1 ИД50 на 1 клетку. Для фиксации и пермеабилизации клеточной мембраны применяли реагент Cytoperm/Cytofix (BD Pharmingen, США), содержащий формальдегид. Этот компонент способен инактивировать вирус бешенства, что позволяет считать предлагаемый метод соответствующим принципам биологической безопасности. Для окрашивания предлагается использовать конъюгат антирабического иммуноглобулина с ФИТЦ (ФГБУ ВНИИЗЖ, Россия). Данное обстоятельство не ограничивает примененние аналогичных препаратов, предназначенных для этой цели. Цитометрические исследования осуществляли на проточном цитометре, снаряженным аргоновым лазером мощностью 20 МВт, при длине волны эмиссии 488 нм со скоростью 500 клеток в секунду. Инфицированными  считали те клетки, значения интенсивности флуоресценции которых составили более 10 условных единиц. Использование проточной цитометрии позволяет определить точное количество инфицированных клеток в исследуемой суспензии, а также степень их инфицирования по интенсивности флуоресценции. Уровень содержания антител в исследуемых образцах учитывают по калибровочному графику, построенному на основании данных исследования стандартного образца активности антирабического иммуноглобулина, имеющего активность 30 МЕ в 1 мл (NIBSC, Великобритания). Установлена высокая степень корреляции результатов, полученных с помощью предлагаемого метода в сравнении с результатами, полученных и других методов определения активности антирабических препаратов — биологической реакции нейтрализации вируса на белых мышах (0,92) и модифицированного метода FAVN (0,98). При этом сравнение результатов анализа уровня антирабических антител, полученных с применением проточной цитометрии, и результатов, полученными в тестах in vivo, проведено впервые. Возможность быстрого получения результата, а также точного определения степени инфицирования клеток по интенсивности флуоресценции позволит использовать предлагаемый метод на этапах контроля в производстве разрабатываемых и выпускаемых иммунобиологических антирабических препаратов.

Поражения слизистой оболочки рта занимают одно из ведущих мест в структуре стоматологических заболеваний. Наиболее актуальным среди дерматозов слизистой оболочки рта и красной каймы губ является красный плоский лишай, который рассматривают как мультифакторное заболевание. В литературе обсуждаются различные концепции патогенеза красного плоского лишая — это иммуноаллергическая, вирусная, наследственная и мембранодеструктивная. Многие авторы указывают на ведущую роль иммунной системы в развитии заболевания. Несмотря на свидетельство включения иммунных механизмов, сложности взаимоотношения патологического процесса и нормальных защитных реакций и возросший интерес к этому заболеванию, многие аспекты иммунологического конфликта при красном плоском лишае остаются неясными. Мало данных о конкретных изменениях в иммунной системе в зависимости от клинической формы заболевания, что определило цель настоящего исследования: определение иммунологического статуса у больных с различными клиническими формами красного плоского лишая слизистой оболочки рта. Обследована периферическая кровь у 286 пациентов (248 лиц женского пола и 38 мужского) в возрасте от 27 до 84 лет с красным плоским лишаем слизистой оболочки рта. Все пациенты были разделены на 6 групп в зависимости от клинической формы заболевания. Для оценки иммунологического статуса у больных с различными клиническими формами красного плоского лишая слизистой оболочки рта: типичной, экссудативно-гиперемической, эрозивно-язвенной, гиперкератотической, атипичной, буллезной были использованы методы для определения неспецифических механизмов защиты, гуморального и клеточного звеньев иммунитета. Проведенными  иммунологическими  исследованиями  установлен комплекс  иммунопатологических реакций, характеризующихся подавлением поглотительной и метаболической активности фагоцитов, дисиммуноглобулинемией, изменениями соотношений основных популяций и субпопуляций иммунокомпетентных клеток. Высокий уровень Т-хелперов — индукторов (CD4+) у больных с типичной,  гиперкератотической, экссудативно-гиперемической,  атипичной и эрозивно-язвенной  формами заболевания характеризуется как самоподдерживающийся иммунный ответ, обусловленный подавлением элиминации  патогенных агентов и, как следствие, приводящий к формированию аутоиммунного процесса. При оценке иммунного статуса у больных красным плоским лишаем слизистой оболочки рта установлена взаимосвязь между проявлениями синдрома «дисфагоцитоза», нарушениями в системе гуморального и клеточного звеньев иммунитета с различными клиническими формами заболевания, что позволяет сделать заключение о патогенетической роли дисбаланса в системе механизмов, обеспечивающих элиминацию патогенов, в том числе инфекционной природы в развитии заболевания.

В настоящее время исследователи предполагают участие TTV и HGV в формировании различных острых и хронических процессов (заболеваний печени, дыхательных путей, онкологических, болезней крови, гематологических нарушений и др.). Распространению HGV- и TTV-инфекций способствует использование инфицированной  крови и ее продуктов. Изучение роли HGV и TTV в этиологической структуре поражения печени у детей с острым лимфобластным лейкозом, взаимосвязи данных инфекций с развитием токсического поражения печени на фоне проводимой терапии представляет особый интерес. Целью настоящего исследования явилась оценка внутрибольничного инфицирования вирусами HGV и TTV и их возможного влияния на частоту и тяжесть поражения печени у детей с острым лимфобластным лейкозом. Основанием для проведения исследования на НGV- и TTV-инфекции среди больных с острым лимфобластным лейкозом было выявление у детей гепатитов неясной этиологии при исключении вирусных гепатитов В и С. Объектами исследования являлись пациенты гематологического отделения и препараты донорской крови, перелитые в период лечения. Было обследовано 99 пациентов, 286 образцов различных препаратов крови. Использовался комплекс методов: эпидемиологические методы исследования (ретроспективный и оперативный эпидемиологический анализ, метод проспективного наблюдения), микробиологический мониторинг, метод иммуноферментного анализа, метод полимеразной цепной реакции, метод вариационной статистики. За 6-летний период наблюдения выявлен 51 ребенок с впервые установленным диагнозом «Острый лимфобластный лейкоз», с преобладанием детей в возрасте от 2-х до 4-х лет (47,1%). При обследовании в динамике в соответствии с установленными периодами, связанными с этапами специфического лечения, количество детей с острым лимфобластным лейкозом, инфицированных HGV, в процессе лечения неуклонно нарастало с 9,8% (15 день лечения) до 45,1% (на этапе поддерживающей терапии). На фоне лечения в 100% случаев отмечалось инфицирование вирусом TTV изначально ДНК TTV-негативных пациентов, при этом у данной категории детей частота выявления TTV-инфекции в динамике достоверно нарастала. Таким образом, в процессе исследования было установлено, что 48% детей с острым лимфобластным лейкозом были инфицированы HGV и 77% детей инфицированы  TTV на начальном этапе лечения (период индукции ремиссии), и в это же время больные получали максимальную парентеральную, в том числе гемотрансфузионную терапию. Проведены исследования препаратов донорской крови выявили наличие РНК НGV в 6,6±1,46%, а ДНК TTV — в 19,3±2,9% случаев.

Цель исследования — изучение влияния современных климатических изменений на природный очаг КГЛ на юге Европейской части Российской Федерации и заболеваемость населения этой инфекцией. Материалы и методы. В работе использованы итоговые годовые отчеты по заболеваемости КГЛ, предоставленные Управлениями Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека в субъектах Южного и Северо-Кавказского федеральных округов, результаты эпизоотологического мониторинга за возбудителем КГЛ на территории Волгоградской, Ростовской областей и Ставропольского края. Гидрометеорологические данные были получены из базы данных ФГБУ «ВНИИГМИ-МЦД», архивов метеостанций, а также из Государственных докладов «О состоянии окружающей среды и природопользовании в Ставропольском крае» за 2011—2016 гг. Результаты. Впервые определено влияние климатических факторов на развитие каждой фазы жизненного цикла иксодовых клещей H. marginatum — основного переносчика вируса ККГЛ на юге Европейской части Российской Федерации. Показана прямая корреляция значений сезонных аномалий температуры воздуха, определяющей численность иксодовых клещей, и уровня заболеваемости населения КГЛ. Установлено комплексное влияние температуры воздуха и количества выпавших осадков на формирование популяций H. marginatum (на примере Ставропольского края). Продемонстрирована корреляция периодов подъема заболеваемости КГЛ с температурными условиями, благоприятными для развития иксодовых клещей. Отрицательные значения аномалий температуры воздуха зафиксированы в годы, предшествующие снижению числа больных КГЛ. Отмечена связь между уровнем заболеваемости КГЛ и степенью увлажнения весенне-летнего и осеннего периодов предшествующего года, оказывающей влияние на жизнедеятельность, процесс метаморфоза преимагинальных фаз клещей и численность популяций H. marginatum последующей генерации. Установлена тенденция к расширению ареала возбудителя КГЛ со смещением границы в северном направлении, обусловленная влиянием климатических изменений. Обнаружение вирусофорных иксодовых клещей на территории районов Волгоградской области, граничащих с Приволжским федеральным округом, свидетельствует о риске распространения вируса ККГЛ за пределы южных регионов Российской Федерации.

Целью настоящей работы стало изучение распространенности манифестного и оккультного вирусного гепатита В (HBV) у ВИЧ-позитивных лиц в Дальневосточном федеральном округе (ДФО), а также изучение молекулярно-эпидемиологической  характеристики циркулирующих в регионе штаммов вируса гепатита В. В работе были применены  серологический и молекулярно-генетический  методы выявления  возбудителя HBV с последующим филогенетическим анализом полученных последовательностей. По признаку наличия анти-HBcAg было установлено, что ВИЧ-позитивные  пациенты более подвержены риску заражения HBV по сравнению с условно «здоровыми» лицами: 35,02% (ДИ 95: 29,59–40,45%) и 22,22% (ДИ 95: 17,87–26,57%) соответственно. Распространенность маркеров текущей HBV-инфекции среди ВИЧ-позитивных лиц так же оказалась более высокой по сравнению с условно «здоровым» населением — 6,73% (ДИ 95: 3,88–9,58%) и 0,85% (ДИ 95: 0–1,81%) соответственно. При этом, HBsAg-негативная форма при манифестном течении HBV выявлена в 1,01% (ДИ 95: 0–2,15%) случаев среди ВИЧ-позитивных лиц, в то время как среди условно «здорового» населения она определена в 0,28% (ДИ 95: 0–0,84%). Установлена более частая выявляемость серологических маркеров сочетанного инфицирования  вирусными гепатитами С и D в группе ВИЧ-HBV-позитивных  лиц по сравнению с пациентами с хронической формой HBV, но без ВИЧ-инфекции:  показатели инфицированности HCV составили 50% (ДИ 95: 27,46–77,46%) и 4,65% (ДИ 95: 0–10,94%), HDV — 40% (ДИ 95: 17,97–62,03%) и 4,65% (ДИ 95: 0–10,94%), соответственно. Наиболее распространенным генотипом HBV оказался генотип D с превалированием субтипа D2, при этом был зарегистрирован случай инфицирования  генотипом С HBV(С2). Полученные результаты указывают на необходимость углубленного обследования ВИЧ-позитивных пациентов на наличие маркеров парентеральных вирусных гепатитов для снижения риска развития угрожающих жизни осложнений, а также с целью профилактики распространения инфекционных агентов в популяции.

Возможность завоза в Российскую Федерацию экзотических инфекций, в том числе и мелиоидоза, лабораторно подтвержденные случаи которого регулярно регистрируются в неэндемичных регионах мира, обуславливает необходимость разработки и совершенствования методов их ускоренной диагностики. Наличие перекрестной реактивности между филогенетически близкими видами рода Burkholderia затрудняет диагностику мелиоидоза методами экспресс-анализа, предусматривающими применение препаратов на основе моноклональных антител к эпитопам экзополисахарида возбудителя. Исследования, направленные на поиск антигенов-мишеней для создания группо- и видоспецифических иммунодиагностических препаратов нового поколения, позволяющих выявлять Burkholderia pseudomallei, не теряют актуальности. Цель работы заключалась в клонировании полных кодирующих последовательностей дифференцирующих поверхностных биополимеров Burkholderia pseudomallei с последующей оптимизацией схемы очистки рекомбинантных антигенов. В результате сравнительного in silico исследования в качестве целевых биомолекул были выбраны обладающие высокой иммуногенностью протеины внешней мембраны B. pseudomallei Omp38 и OmpA/МotB. В ПЦР были получены необходимые для клонирования специфические ампликоны генов omp38 и ompA/motB, которые лигировали с линейным экспрессирующим вектором RIC-Ready pPAL7. Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E. coli C-Мах5α для накопления рекомбинантных плазмидных молекул, после чего их выделяли и вводили в E. сoli BL21(DE3) для высокоэффективной экспрессии рекомбинантных протеинов. По-видимому, из-за мультимерной организации белков стандартная процедура их очистки из нативного клеточного дезинтеграта оказалась неэффективной. Модификация методики очистки привела к повышению концентрации рекомбинантного белка в элюате. Однако ввиду привнесенных денатурирующих условий на промежуточных этапах очистки произошел гидролиз пептидных связей в молекулах целевых протеинов. Предполагаемым местом разрыва являлась ковалентная связь между аминокислотами пролин и аспарагин. В элюатах содержались N-концевые фрагменты, посредством которых рекомбинантные белки были связаны с неподвижной фазой хроматографической колонки. Аминокислотные последовательности N-концевых участков, соответствующих молекулярным массам элюированных пептидов, были оценены на предмет содержания линейных эпитопов. По результатам in silico анализа на исследуемых полипептидах было установлено присутствие ряда участков, обладающих выраженной антигенной активностью. Сконструированные штаммы E. coli BL21(DE3) BpsOmp39 и E. coli BL21(DE3) BpsOmpА являютя продуцентами поверхностных протеинов Omp38 и ОmpA/МotB возбудителя мелиоидоза, очищенные формы которых могут быть использованы в качестве основы разрабатываемых диагностических тест-систем.

.