METHOD OF SELECTIVE ISOLACION OF ACINETOBACTER BAYLYI FROM RIVER WATER


Cite item

Full Text

Abstract

The aim of the study is to increase the selectivity of the isolation of Acinetobacter baylyi from river water. We used 5 strains of A. baylyi for developing a selective medium, 4 of them were isolated from the water of the river Neva, 1 - from clinical substance. A. baylyi strains were identified by a combination of phenotypic features and/or using the mass spectrometric method (MALDI-TOF MS). In preliminary studies we found that the bacteria A. baylyi does not utilize L-phenylalanine as the only source of carbon and nitrogen, as well as the only source of carbon in a medium with mineral nitrogen sources, but utilizes L-phenylalanine as the only source of nitrogen only if it is supplemented with ethanol as the only source of carbon. Based on this property of A. baylyi, a selective medium was developed for the isolation of these bacteria from river water. Composition and preparation of liquid selective medium: in 1 liter of distilled water we added L-phenylalanine (CAS 63-91-2) 2.0 (g/l); NaCI 5.0; Na2SO4  2.0; KH2PO4 1.0; K2HPO4 2.5; MgSO4 0.1; dissolved by heating, boiled for 5 minutes, 4 ml of 96-degree ethanol was added to a warm medium, pH 7.2 ± 0.2 was checked; 40 ml were poured into sterile vials. Dense selective medium: the same ingredients and an additional 15.0 g of agar are added to 1 liter of distilled water; the preparation is the same, the medium is poured into sterile Petri dishes. Method of application of selective nutrient medium for isolation of A. baylyi from river water: water from river Neva is seeded in a volume of 10 ml into a vial with 40 ml of liquid selective medium, incubated in aerobic conditions at 28 ° C 48 h, then the enriched material from the flower is transplanted with a bacteriological loop onto the surface of a dense selective medium of the same composition in two bowls; incubated crops in aerobic conditions at 28о С 48 h . 10 isolated colonies are selected for subsequent identification, they are transplanted into sectors of nutrient agar, incubated at 28o 24 h and isolates are identified by a complex of phenotypic characteristic of A. baylyi, and/or by the MALDI-TOF MS method. In this example 19 isolates from 20 were A. baylyi (95% of isolates). A study using this technique of three more water samples from the river Neva showed the results of the same narrowly selective orientation – 90-95% of the isolates were bacteria A. baylyi

Full Text

МЕТОД   СЕЛЕКТИВНОГО   ВЫДЕЛЕНИЯ   ACINETOBACTER            BAYLYI ИЗ РЕЧНОЙ ВОДЫ

Введение

Бактерии Acinetobacter baylyi были выделены совместно с шестью другими новыми видами рода Acinetobacter в 2003 году в Австралии из активированного ила, однако, методика их выделения не сообщалась [3]. Было установлено, что штаммы A. baylyi обладают высокой способностью к естественной генетической трансформации. Исключительная легкость естественной трансформации сделали штаммы A. baylyi модельным объектом для исследования механизмов естественной трансформации, создания новых методов генной инженерии, оптимизации генома бактерий [6]. Изучение бактерий A. baylyi, выделенных в условиях окружающей среды, перспективно для поиска новых биоремедиаторов загрязнений природной среды и продуцентов полезных веществ, изучения экологии ацинетобактеров, в том числе в северных широтах. Бактерии A. baylyi редко выделяют из клинического материала [1], однако, описана вспышка внутрибольничной инфекции A. baylyi [4] и бактериальное осложнение после операции на головном мозге [7], которые указывают на их значимость как возбудителей инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи.

Методы узко-селективного выделения бактерий A. baylyi из объектов внешней среды и клинического материала не известны. В отечественных лабораториях выделяют ацинетобактеры на этанол-аммонийной среде (ЭАС). По нашим данным среда ЭАС обеспечивает рост многих видов ацинетобактеров (A. baumannii, A. pittii, A. nosocomialis, A. baylyi, A. johnsonii и других), а также бактерий Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae и подавляет рост прочих бактерий. Известен метод выделения бактерий Acinetobacter из естественных почвенных и водных экосистем с использованием обогащения в минимальной минеральной среде с добавлением 0,1% ацетата натрия в качестве единственного источника углерода [5]. Метод обеспечивал выделение многих видов ацинетобактеров и других бактерий. Известен также метод выделения и идентификации бактерий комплекса Acinetobacter calcoaceticus – Acinetobacter baumannii с применением селективной синтетической питательной среды «Ацинетобактер фенилаланин агар» [1]. Селективность этой среды обеспечена трофической селекцией ацинетобактеров L-фенилаланином в качестве единственного источника углерода и азота, а также дополнительной селекцией триметопримом. На указанной среде растут преимущественно ацинетобактеры группы A. baumannii, однако, известен случай выделения одного штамма A. baylyi из клинического материала [1].

Цель исследования – повышение селективности выделения бактерий A. baylyi из внешней среды (речной воды).

Материалы и методы

Штаммы бактерий. Для разработки селективной среды использовали 4 штамма A. baylyi (№ 1 - 4), выделенных из воды реки Невы, и 1 штамм A. baylyi № 223, выделенный из клинического материала (мокроты) в бактериологической лаборатории Военно-медицинской академии имени С. М. Кирова. Для контроля питательных сред применяли штаммы Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 и Escherichia coli ATCC 25922. Видовая принадлежность штаммов, а также штаммов бактерий, выделяемых в ходе исследований, была подтверждена методом MALDI-TOF масс-спектрометрии. Указанные штаммы находятся в рабочей коллекции культур Е. П. Сиволодского на кафедре микробиологии Военно-медицинской академии.

Питательные среды и реактивы. Для культивирования бактерий использовали Колумбийский агар (НИЦФ, Санкт-Петербург). Этанол-аммонийная среда жидкая (ЭАС-1). К 100 мл дистиллированной волы добавляют фосфат натрий-аммоний 0,15 г; фосфат калия однозамещенного 0,04 г; сульфат калия 0,02 г; хлорид магния 0,02. После стерилизации при 0,5 атм. в течение 15 мин добавляют 1,2 мл этилового 96-градусного спирта и разливают асептично по 10 мл в пробирки. Этанол-аммонийная среда плотная (ЭАС-2). Основной состав среды тот же, но до стерилизации добавляют 1,5 г сухого питательного агара 1,8 г и 0,5 мл 1,6 –процентного щелочного раствора бромтимолового синего, разливают в стерильные чашки Петри.

Состав и методика приготовления синтетической селективной питательной среды для выделения A. baylyi из речной воды. Жидкая питательная среда. В 1 л дистиллированной воды вносят (г/л): L-фенилаланин (CAS 63-91-2) 2,0; NaCI 5,0; Na2SO4 2,0; KH2PO4 1,0; K2HPO4 2,5; MgSO4 0,1;  растворяют при нагревании, кипятят в течение 5 мин, добавляют в теплую среду 4 мл 96-градусного этанола, проверяют рН 7,2±0,2, разливают по 40 мл в стерильные флаконы. Плотная питательная среда. Содержит на 1 л дистиллированной воды те же компоненты и дополнительно 15,0 г агара. Все компоненты растворяют при нагревании, кипятят в течение 5 мин, затем добавляют в теплую среду 4 мл этанола, проверяют рН (7,2±0,2), разливают в стерильные чашки Петри. Бактериологический контроль качества среды проводят при изготовлении среды: суточные бульонные культуры контрольных штаммов  A. baylyi (позитивный контроль) и P. aeruginosa ATCC 27853, E. coli ATCC 25922 (негативный контроль) засевают по одной петле  радиальным штрихом на поверхность плотной среды в чашке Петри, инкубируют в аэробных условиях при +28оС в течение 24 часов, учитывают результат: питательная среда пригодна к использованию, если имеется рост бактерий  A. baylyi  и нет роста штаммов P. aeruginosa ATCC 27853, E. coli ATCC 25922. Срок хранения готовых сред 15 суток при температуре от 4оС до 8оС.

Методика постановки тестов идентификации A. baylyi. Отношение бактерий к окраске по Граму, морфологию и подвижность выявляли микроскопией чистых культур. Рост бактерий при +26оС, +37оС, +41оС, +44оС определяли аэробным культивированием посевов суточных бульонных культур на Колумбийском агаре с учетом через 48 часов. Гемолитическую активность бактерий исследовали на Колумбийском агаре с кровью барана при +37оС с учетом через 24 часа. Наличие каталазы устанавливали тестом с 3% раствором перекиси водорода. Цитохромоксидазу бактерий выявляли тестом с 1% водным раствором тетраметилпарафенилендиамина по появлению синей окраски бактерий в течение 20 секунд. Нитратредуктазу определяли микрообъемным методом в питательной среде с 0,1% KNO3. Состав среды: пептон ферментативный 0,5 г; NaCI 0,5 г; KNO3 0,1г; вода дистиллированная 100 мл, стерилизация при +121оС 20 минут. По 0,1 мл среды вносят в лунки планшета, затем засевают в лунки по полной петле суточной агаровой культуры исследуемых бактерий, одну лунку не засевают (контроль среды). Посевы инкубируют при +37оС аэробно 3 часа, после чего вносят в каждую лунку реактивы на нитриты – 0,05 мл 0,2% водный раствор риванола, затем 0,05 мл 12% раствор соляной кислоты (приготовленный из концентрированной 36,5% соляной кислоты). Мгновенное появление красной окраски среды в лунке с посевом указывает на наличие нитратредуктазы бактерий, желтая окраска указывает на отсутствие нитратредуктазы; в контрольной среде без посева сохраняется желтая окраска реактива. Выявление уреазы быстрой активности осуществляли, используя среду с мочевиной из микрообъемной тест-системы «Рапид-Энтеро 200» (НИИЭМ им. Пастера, Санкт-Петербург). В лунки планшета вносили по 0,1 мл среды с мочевиной, затем засевали в лунки по одной петле суточной агаровой культуры исследуемых бактерий (одна лунка без посева- контроль среды). Вазелиновое масло не вносили во все лунки. Посевы инкубировали при +37оС в течение 3 часов. Появление красной окраски среды в лунке с посевом при сохранении исходной окраски в контрольной лунке указывает на наличие уреазы быстрой активности.

Утилизацию субстратов в качестве единственного источника углерода осуществляли на минимальной минеральной среде. Состав среды (г/л): NH4CI 5,0; NH4NO3 1,0; Na2SO4 2,0; K2HPO4 3,0; KH2PO4 1,0; MgSO4 0,1; агар 15,0; 1,6%-ный водный раствор бромтимолового синего 4 мл, дистиллированная вода 1 л; рН 7,2; стерилизация при +121оС 20 минут. Каждый субстрат вносили по 0,1 г в отдельную колбу с 50 мл стерильной горячей среды, устанавливали рН 7,2; в одну колбу субстрат не вносили (контроль среды), разливали в чашки Петри. Использовали субстраты: D-глюкоза, L-фенилаланин, L-арабиноза, путресцин (Merck, Германия). Суточные агаровые культуры бактерий по полной петле суспендировали в 0,2 мл стерильного 0,85% раствора NaCI в лунках полимерного планшета. Засевали исследуемые культуры по полной петле взвеси бактерий из лунки радиальным штрихом на сектор чашки с субстратом и контролем. Посевы выращивали при +37оС в течение 3 суток, просматривая ежедневно. Положительным результатом утилизации субстрата считали наличие четко выраженного газона бактерий по следу посева при отсутствии роста бактерий на контрольной среде без субстрата.

Идентификация видов бактерий методом MALDI-TOF MS.  Использовали масс-спектрометр Microflex с базой данных MALDI Biotyper (Bruker Daltonics Inc., Germany) в соответствии с инструкцией по применению.

Результаты исследования

Известно, что бактерии A. baylyi не используют L-фенилаланин для роста в качестве единственного источника углерода на минимальных солевых средах с минеральными источниками азота [3, 5]. Нами в эксперименте показано, что они также не используют L-фенилаланин в качестве единственного источника углерода и азота на минимальной солевой среде (таблица 1). Впервые нами установлено экспериментально, что бактерии A. baylyi могут утилизировать для роста L-фенилаланин в качестве единственного источника только азота при участии этанола как единственного источника углерода (табл. 1). На основе этого свойства A. baylyi была создана селективная среда для выделения бактерий A. baylyi из речной воды, состав и приготовление которой изложены в разделе «Материалы и методы».

 

Таблица 1

 

Методика применения селективной синтетической питательной среды для выделения бактерий A. baylyi из речной воды. Исследуемый материал – воду реки Невы засевают в объеме 10 мл во флакон с 40 мл жидкой питательной среды предлагаемого метода, инкубируют в аэробных условиях при +28оС в течение 48 часов, затем пересевают  бактериологической петлей обогащенный материал из флакона на поверхность плотной питательной среды такого же состава в двух чашках Петри. Инкубируют  посевы в аэробных условиях при 28оС в течение 48 часов, отбирают для последующей видовой идентификации по 10 изолированных колоний, характерных для ацинетобактеров, пересевают их на секторы питательного агара, инкубируют  в аэробных условиях при +28оС в течение 24 часов и идентифицируют видовую принадлежность изолятов по комплексу фенотипических признаков  и/или методом MALDI-TOF  MS. Бактерии  A. baylyi – грамотрицательные кокко-бактерии, неподвижные; колонии диаметром 2 мм, выпуклые, светлосерые, мутные; оксидазоотрицательные, каталазоположительные; не ферментируют, но окисляют глюкозу; не имеют нитратредуктазу; имеют быструю уреазу; утилизируют  в качестве единственного источника углерода глюкозу; не утилизируют L-фенилаланин, L-арабинозу, путресцин.

Сочетание  L-фенилаланина и этанола в питательной среде неожиданно выявило необычный узко-селективный эффект обильного выделения бактерий  A. baylyi из речной воды – 95% всех  изолятов бактерий (19 из 20 изученных колоний), выделенных из одной пробы воды Невы, являлись видом A. baylyi  (табл. 2).

 

Таблица 2

 

При сравнительном изучении этой же пробы воды с использованием этанол-аммонийной среды не было выявлено бактерий A. baylyi, однако были обнаружены бактерии прочих видов ацинетобактеров и изоляты других родов бактерий (табл. 2). При повторных исследованиях трех проб воды реки Невы были получены результаты одинаковой направленности – предлагаемым методом выделялись преимущественно бактерии A. baylyi (90-95% изолятов).

Обсуждение результатов исследования

Механизм выявленного  узкоселективного выделения бактерий  A. baylyi из речной воды состоит в том, что известный источник углерода этанол, имеющий широкий спектр трофического селективного действия для большинства видов ацинетобактеров, при  дополнении его  L-фенилаланином, который является для A. baylyi источником только азота, создают более специфические селективные условия, чем  универсальные  минеральные источники азота  (NH4CI, NH4NO3)  или  аминокислоты, как источники углерода и азота. При этом свойство A. baylyi использовать L-фенилаланин как источник только азота непосредственно определяет достижение поставленной цели повышения селективности выделения бактерий A. baylyi из речной воды. Комплекс минеральных солей среды обеспечивает метаболизм бактерий и направляет его на усвоение этанола и L-фенилаланина. Температура +28оС является оптимальной для культивирования A. baylyi. Этап предварительного обогащения речной воды в жидкой питательной среде и время инкубации 48 часов обусловлены разнообразием и малой концентрацией бактерий в воде. Разработанный метод обеспечивает выделение из речной воды неограниченного количества штаммов бактерий A. baylyi, что будет способствовать поиску новых биоремедиаторов загрязнений природной среды, изучению экологии ацинетобактеров и эпидемиологии ацинетобактерных инфекций.

Заключение

Разработан метод селективного выделения бактерий A. baylyi из речной воды, позволяющий избирательно выделять из проб воды преимущественно бактерии A. baylyi. На способ получен патент Российской Федерации на изобретение № 2769434 [2].

Благодарности

Авторы благодарят старшего лаборанта кафедры микробиологии       Военно-медицинской академии имени С. М. Кирова Белогурову Т. Б. за помощь в отборе проб воды из реки Невы.

×

About the authors

Evgeny Petrovich Sivolodskii

Email: es279@yandex.ru

Lyudmila Kraeva

ФБУН НИИЭМ имени Пастера, Военно-медицинская академия им. С.М.Кирова

Author for correspondence.
Email: lykraeva@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-9115-3250
SPIN-code: 4863-4001
Scopus Author ID: 23473821900
ResearcherId: H-1786-2012

зав. лабораторией медицинской бактериологии ФБУН НИИЭМ имени Пастера, профессор кафедры микробиологии ВМедА им.С.М.Кирова

Russian Federation

Elena Vladimirovna Melnicova

Email: lykraeva@yandex.ru

References

  1. Сиволодский Е.П., Горелова Г.В., Богословская С.П., Зуева Е.В. Селективная синтетическая питательная среда «Ацинетобактер фенилаланин агар» для выделения и идентификации бактерий комплекса Acinetobacter calcoaceticus –Acinetobacter baumannii // Инфекция и иммунитет. 2020.Т. 10, № 5. С. 591-596.
  2. Патент № 2769434 Российская Федерация. МПК C12N 1/20 (2006.01), C12Q 1/04 (2006.01), C12R 1/01 (2006). Способ выделения бактерий вида Acinetobacter baylyi из речной воды; № 2021130073, заявлено 2021.10.14, опубликовано 2022.03.31/ Сиволодский Е.П. Патентообладатель: Сиволодский Евгений Петрович, 6 с.
  3. Carr E.L, Kampfer P., Patel B.K.C., Gurtler V., Seviour R.J. Seven novel spesies of Acinetobacter isolated from activated sludge. Int. J. Syst. Evol. Microbiol.,2003, vol. 53, no. 4, pp. 953-963
  4. Chen T.L., Siu L.K., Lee Y.t., Chen CH,p., Huang l.Y., Wu R.Ch.Ch., Cho W.L., Fung Ch.P. Acinetobacter baylyi as a pathogen for opportunistic infection. J. Clin. Microbiol. Sept. 2008, vol. 46, no. 9, pp. 2938-2944
  5. Krizova l., Maixnerova M., Sedo O., Nemec A. sAcinetobacter albensi sp. nov., isolated from natural soil and water ecosystems. Int. J Syst. Evol. Microbiol., 2015, vol. 65, no.11, pp. 3905-3915
  6. Suarez G.A., Dugan K.R., Renda B,A., Leonard S.P., Gangavarapu L.S., Barrick J.E. Rapid and assured genetic engineering methods applid to Acinetobacter baylyi ADPI genome streamlining. Nucleic Acids Research, 2020, vol. 48, no.8, pp. 4505-4600
  7. Zhou Z, Du X, Wang L, Yang Q, Fu Y, Yu Y. Clinical carbapenem-resistant Acinetobacter baylyi strain coharboring blaSIM-1 and blaOXA-23 from China. Antimicrob Agents Chemother. 2011 Nov;55(11):5347-9. doi: 10.1128/AAC.00425-11. Epub 2011 Aug 29. PMID: 21876057; PMCID: PMC3195060

Supplementary files

There are no supplementary files to display.


Copyright (c) Sivolodskii E.P., Kraeva L., Melnicova E.V.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 64788 от 02.02.2016.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies