Метод селективного выделения Acinetobacter baylyi из речной воды

Полный текст

Введение

Бактерии Acinetobacter baylyi были выделены совместно с шестью другими новыми видами рода Acinetobacter в 2003 г. в Австралии из активированного ила, однако методика их выделения не сообщалась [3]. Было установлено, что штаммы A. baylyi обладают высокой способностью к естественной генетической трансформации. Исключительная легкость естественной трансформации сделали штаммы A. baylyi модельным объектом для исследования механизмов естественной трансформации, создания новых методов генной инженерии, оптимизации генома бактерий [6]. Изучение бактерий A. baylyi, выделенных в условиях окружающей среды, перспективно для поиска новых биоремедиаторов загрязнений природной среды и продуцентов полезных веществ, изучения экологии ацинетобактеров, в том числе в северных широтах. Бактерии A. baylyi редко выделяют из клинического материала [2], однако описана вспышка внутрибольничной инфекции A. baylyi [4] и бактериальное осложнение после операции на головном мозге [7], которые указывают на их значимость как возбудителей инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи.

Методы узкоселективного выделения бактерий A. baylyi из объектов внешней среды и клинического материала неизвестны. В отечественных лабораториях выделяют ацинетобактеры на этанол-аммонийной среде (ЭАС). По нашим данным среда ЭАС обеспечивает рост многих видов ацинетобактеров (A. baumannii, A. pittii, A. nosocomialis, A. baylyi, A. johnsonii и других), а также бактерий Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae, и подавляет рост прочих бактерий. Известен метод выделения бактерий Acinetobacter из естественных почвенных и водных экосистем с использованием обогащения в минимальной минеральной среде с добавлением 0,1% ацетата натрия в качестве единственного источника углерода [5]. Метод обеспечивал выделение многих видов ацинетобактеров и других бактерий. Известен также метод выделения и идентификации бактерий комплекса Acinetobacter calcoaceticus – Acinetobacter baumannii с применением селективной синтетической питательной среды «Ацинетобактер фенилаланин агар» [2]. Селективность этой среды обеспечена трофической селекцией ацинетобактеров L-фенилаланином в качестве единственного источника углерода и азота, а также дополнительной селекцией триметопримом. На указанной среде растут преимущественно ацинетобактеры группы A. baumannii, однако известен случай выделения одного штамма A. baylyi из клинического материала [2].

Цель исследования — повышение селективности выделения бактерий A. baylyi из внешней среды (речной воды).

Материалы и методы

Штаммы бактерий. Для разработки селективной среды использовали 4 штамма A. baylyi (№ 1–4), выделенных из воды реки Невы, и 1 штамм A. baylyi № 223, выделенный из клинического материала (мокроты) в бактериологической лаборатории Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова. Для контроля питательных сред применяли штаммы Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 и Escherichia coli ATCC 25922. Видовая принадлежность бактерий, выделяемых в ходе исследований, была подтверждена методом MALDI-ToF масс-спектрометрии. Указанные штаммы находятся в рабочей коллекции культур Е.П. Сиволодского на кафедре микробиологии Военно-медицинской академии.

Питательные среды и реактивы. Для культивирования бактерий использовали Колумбийский агар (НИЦФ, Санкт-Петербург). Этанол-аммонийная среда жидкая (ЭАС-1). К 100 мл дистиллированной волы добавляют фосфат натрий-аммоний 0,15 г; фосфат калия однозамещенного 0,04 г; сульфат калия 0,02 г; хлорид магния 0,02. После стерилизации при 0,5 атм в течение 15 мин добавляют 1,2 мл этилового 96-градусного спирта и разливают асептично по 10 мл в пробирки. Этанол-аммонийная среда плотная (ЭАС-2). Основной состав среды тот же, но до стерилизации добавляют 1,5 г сухого питательного агара 1,8 г и 0,5 мл 1,6% щелочного раствора бромтимолового синего, разливают в стерильные чашки Петри.

Состав и методика приготовления синтетической селективной питательной среды для выделения A. baylyi из речной воды. Жидкая питательная среда. В 1 л дистиллированной воды вносят (г/л): L-фенилаланин (CAS 63-91-2) 2,0; NaCI 5,0; Na₂SO₄ 2,0; KH₂PO₄ 1,0; K₂HPO₄ 2,5; MgSO₄ 0,1; растворяют при нагревании, кипятят в течение 5 мин, добавляют в теплую среду 4 мл 96-градусного этанола, проверяют рН 7,2±0,2, разливают по 40 мл в стерильные флаконы. Плотная питательная среда. Содержит на 1 л дистиллированной воды те же компоненты и дополнительно 15,0 г агара. Все компоненты растворяют при нагревании, кипятят в течение 5 мин, затем добавляют в теплую среду 4 мл этанола, проверяют рН (7,2±0,2), разливают в стерильные чашки Петри. Бактериологический контроль качества среды проводят при изготовлении среды: суточные бульонные культуры контрольных штаммов A. baylyi (позитивный контроль) и P. aeruginosa ATCC 27853, E. coli ATCC 25922 (негативный контроль) засевают по одной петле радиальным штрихом на поверхность плотной среды в чашке Петри, инкубируют в аэробных условиях при +28°С в течение 24 ч, учитывают результат: питательная среда пригодна к использованию, если имеется рост бактерий A. baylyi и нет роста штаммов P. aeruginosa ATCC 27853, E. coli ATCC 25922. Срок хранения готовых сред 15 суток при температуре от 4°С до 8°С.

Методика постановки тестов идентификации A. baylyi. Отношение бактерий к окраске по Граму, морфологию и подвижность выявляли микроскопией чистых культур. Рост бактерий при +26°С, +37°С, +41°С, +44°С определяли аэробным культивированием посевов суточных бульонных культур на Колумбийском агаре с учетом через 48 ч. Гемолитическую активность бактерий исследовали на Колумбийском агаре с кровью барана при +37°С с учетом через 24 ч. Наличие каталазы устанавливали тестом с 3% раствором перекиси водорода. Цитохромоксидазу бактерий выявляли тестом с 1% водным раствором тетраметилпарафенилендиамина по появлению синей окраски бактерий в течение 20 с. Нитратредуктазу определяли микрообъемным методом в питательной среде с 0,1% KNO₃. Состав среды: пептон ферментативный 0,5 г; NaCI 0,5 г; KNO₃ 0,1 г; вода дистиллированная 100 мл, стерилизация при +121°С 20 мин. По 0,1 мл среды вносят в лунки планшета, затем засевают в лунки по полной петле суточной агаровой культуры исследуемых бактерий, одну лунку не засевают (контроль среды). Посевы инкубируют при +37°С аэробно 3 ч, после чего вносят в каждую лунку реактивы на нитриты — 0,05 мл 0,2% водный раствор риванола, затем 0,05 мл 12% раствор соляной кислоты (приготовленный из концентрированной 36,5% соляной кислоты). Мгновенное появление красной окраски среды в лунке с посевом указывает на наличие нитратредуктазы бактерий, желтая окраска указывает на отсутствие нитратредуктазы; в контрольной среде без посева сохраняется желтая окраска реактива. Выявление уреазы быстрой активности осуществляли, используя среду с мочевиной из микрообъемной тест-системы «Рапид-Энтеро 200» (НИИЭМ им. Пастера, Санкт-Петербург). В лунки планшета вносили по 0,1 мл среды с мочевиной, затем засевали в лунки по одной петле суточной агаровой культуры исследуемых бактерий (одна лунка без посева — контроль среды). Посевы инкубировали при +37°С в течение 3 ч. Появление красной окраски среды в лунке с посевом при сохранении исходной окраски в контрольной лунке указывает на наличие уреазы быстрой активности.

Утилизацию субстратов в качестве единственного источника углерода осуществляли на минимальной минеральной среде. Состав среды (г/л): NH₄CI 5,0; NH₄NO₃ 1,0; Na₂SO₄ 2,0; K₂HPO₄ 3,0; KH₂PO₄ 1,0; MgSO₄ 0,1; агар 15,0; 1,6%-ный водный раствор бромтимолового синего 4 мл, дистиллированная вода 1 л; рН 7,2; стерилизация при +121°С 20 мин. Каждый субстрат вносили по 0,1 г в отдельную колбу с 50 мл стерильной горячей среды, устанавливали рН 7,2; в одну колбу субстрат не вносили (контроль среды), разливали в чашки Петри. Использовали субстраты: D-глюкоза, L-фенилаланин, L-арабиноза, путресцин (Merck, Германия). Суточные агаровые культуры бактерий по полной петле суспендировали в 0,2 мл стерильного 0,85% раствора NaCI в лунках полимерного планшета. Засевали исследуемые культуры по полной петле взвеси бактерий из лунки радиальным штрихом на сектор чашки с субстратом и контролем. Посевы выращивали при +37°С в течение 3 суток, просматривая ежедневно. Положительным результатом утилизации субстрата считали наличие четко выраженного газона бактерий по следу посева при отсутствии роста бактерий на контрольной среде без субстрата.

Идентификация видов бактерий методом MALDI-ToF MS. Использовали масс-спектрометр Microflex с базой данных MALDI Biotyper (Bruker Daltonics Inc., Германия) в соответствии с инструкцией по применению.

Результаты

Известно, что бактерии A. baylyi не используют L-фенилаланин для роста в качестве единственного источника углерода на минимальных солевых средах с минеральными источниками азота [3, 5]. Нами в эксперименте показано, что они также не используют L-фенилаланин в качестве единственного источника углерода и азота на минимальной солевой среде (табл. 1). Впервые нами установлено экспериментально, что бактерии A. baylyi могут утилизировать для роста L-фенилаланин в качестве единственного источника только азота при участии этанола как единственного источника углерода (табл. 1). На основе этого свойства A. baylyi была создана селективная среда для выделения бактерий A. baylyi из речной воды, состав и приготовление которой изложены в разделе «Материалы и методы».

 

Таблица 1. L-фенилаланин как единственный источник азота для роста бактерий Acinetobacter baylyi при участии этанола как единственного источника углерода

Table 1. L-phenylalanine as the sole nitrogen source for growth of bacteria Acinetobacter baylyi supplemented with ethanol as the sole carbon source

Исследуемые штаммы бактерий Investigated bacterial strains	Минеральная солевая основа среды без азота и углерода* Nitrogen/carbon-free mineral salt based medium*	L-фенилаланин (2 г/л), минеральная солевая основа среды без азота и углерода Nitrogen/carbon-free mineral L-phenylalanine (2 g/l), mineral salt based medium	Этанол (4 мл/л), минеральная солевая основа среды без азота и углерода Nitrogen/carbon-free mineral ethanol (4 ml/l) mineral salt based medium	L-фенилаланин (2 г/л), этанол (4 мл/л), минеральная солевая основа среды без азота и углерода Nitrogen/carbon-free mineral L-phenylalanine (2 g/l) ethanol (4 ml/l) mineral salt based medium
A. baylyi 1	–**	–	–	+***
A. baylyi 2	–	–	–	+
A. baylyi 3	–	–	–	+
A. baylyi 4	–	–	–	+
A. baylyi 223	–	–	–	+

Примечание. * — минеральная солевая основа плотной среды (NaCI, Na₂SO₄, MgSO₄, KH₂PO₄, K₂HPO₄); ** — отсутствие роста бактерий; *** — наличие роста бактерий.

Note. * — mineral salt base of dense medium (NaCI, Na₂SO₄, MgSO₄, KH₂PO₄, K₂HPO₄); ** — no of bacterial growth; *** — no of bacterial growth.

 

Методика применения селективной синтетической питательной среды для выделения бактерий A. baylyi из речной воды. Исследуемый материал — воду реки Невы — засевают в объеме 10 мл во флакон с 40 мл жидкой питательной среды предлагаемого метода, инкубируют в аэробных условиях при +28°С в течение 48 ч, затем пересевают бактериологической петлей обогащенный материал из флакона на поверхность плотной питательной среды такого же состава в двух чашках Петри. Инкубируют посевы в аэробных условиях при +28°С в течение 48 ч, отбирают для последующей видовой идентификации по 10 изолированных колоний, характерных для ацинетобактеров, пересевают их на секторы питательного агара, инкубируют в аэробных условиях при +28°С в течение 24 ч и идентифицируют видовую принадлежность изолятов по комплексу фенотипических признаков и/или методом MALDI-ToF MS. Бактерии A. baylyi — грамотрицательные коккобактерии, неподвижные; колонии диаметром 2 мм, выпуклые, светло-серые, мутные; оксидазоотрицательные, каталазоположительные; не ферментируют, но окисляют глюкозу; не имеют нитратредуктазу; имеют быструю уреазу; утилизируют в качестве единственного источника углерода глюкозу; не утилизируют L-фенилаланин, L-арабинозу, путресцин.

Сочетание L-фенилаланина и этанола в питательной среде неожиданно выявило необычный узкоселективный эффект обильного выделения бактерий A. baylyi из речной воды — 95% всех изолятов бактерий (19 из 20 изученных колоний), выделенных из одной пробы воды Невы, являлись видом A. baylyi (табл. 2).

 

Таблица 2. Узкоселективный эффект выделения из воды реки Невы бактерий Acinetobacter baylyi предлагаемым методом

Table 2. Narrowly selective effect of Acinetobacter baylyi isolation from the Neva River water by the method proposed

Виды бактерий изолятов, выделенных из одной пробы воды Species of bacterial isolates, isolated from a single water sample	Число изолятов видов из 20 изученных изолятов одной пробы воды, выделенных на этанол-аммиачной среде The number of isolates of species from 20 studied isolates of a single water sample, isolated on ethanol-ammonia medium	Число изолятов видов из 20 изученных изолятов одной пробы воды, выделенных предлагаемым методом The number of isolates of species from 20 studied isolates of a single water sample, isolated by the proposed method
A. baylyi	0	19
A. johnsoni	8	0
A. radioresistens	1	0
A. haemolyticus	2	0
A. towntri	1	0
A. tandoi	3	0
Бактерии прочих родов (Pseudomonas, Klebsiella и другие) Bacteria of other genera (Pseudomonas, Klebsiella and others)	5	1

 

При сравнительном изучении этой же пробы воды с использованием этанол-аммонийной среды не было выявлено бактерий A. baylyi, однако были обнаружены бактерии прочих видов ацинетобактеров и изоляты других родов бактерий (табл. 2). При повторных исследованиях трех проб воды реки Невы были получены результаты одинаковой направленности — предлагаемым методом выделялись преимущественно бактерии A. baylyi (90–95% изолятов).

Обсуждение

Механизм выявленного узкоселективного выделения бактерий A. baylyi из речной воды состоит в том, что известный источник углерода этанол, имеющий широкий спектр трофического селективного действия для большинства видов ацинетобактеров, при дополнении его L-фенилаланином, который является для A. baylyi источником только азота, создают более специфические селективные условия, чем универсальные минеральные источники азота (NH₄CI, NH₄NO₃) или аминокислоты, как источники углерода и азота. При этом свойство A. baylyi использовать L-фенилаланин как источник только азота непосредственно определяет достижение поставленной цели повышения селективности выделения бактерий A. baylyi из речной воды. Комплекс минеральных солей среды обеспечивает метаболизм бактерий и направляет его на усвоение этанола и L-фенилаланина. Температура +28°С является оптимальной для культивирования A. baylyi. Этап предварительного обогащения речной воды в жидкой питательной среде и время инкубации 48 ч обусловлены разнообразием и малой концентрацией бактерий в воде. Разработанный метод обеспечивает выделение из речной воды неограниченного количества штаммов бактерий A. baylyi, что будет способствовать поиску новых биоремедиаторов загрязнений природной среды, изучению экологии ацинетобактеров и эпидемиологии ацинетобактерных инфекций.

Заключение

Разработан метод селективного выделения бактерий A. baylyi из речной воды, позволяющий избирательно выделять из проб воды преимущественно бактерии A. baylyi. На способ получен патент Российской Федерации на изобретение № 2769434 [1].

Благодарности

Авторы благодарят старшего лаборанта кафедры микробиологии Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова Т.Б. Белогурову за помощь в отборе проб воды из реки Невы.

Об авторах

Евгений Петрович Сиволодский

ФГБВОУ ВО Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова МО РФ; ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера

Email: lykraeva@yandex.ru

д.м.н., профессор кафедры микробиологии; старший научный сотрудник лаборатории молекулярно-биологических технологий

Россия, Санкт-Петербург; Санкт-Петербург

Людмила Александровна Краева

ФГБВОУ ВО Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова МО РФ; ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера

Автор, ответственный за переписку.
Email: lykraeva@yandex.ru

д.м.н., зав. лабораторией медицинской бактериологии; профессор кафедры микробиологии

Россия, Санкт-Петербург; Санкт-Петербург

Елена Владимировна Мельникова

ФГБВОУ ВО Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова МО РФ

Email: lykraeva@yandex.ru

врач-бактериолог лаборатории бактериологии Центральной клинико-диагностической лаборатории

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы