The aim of the study is to increase the selectivity of isolating Acinetobacter baylyi from river water. For developing a selective culture medium, we used 5 strains of A. baylyi, 4 of which were isolated from the water of the river Neva, 1 — from clinical material. A. baylyi strains were identified by a combination of phenotypic features and/or using the mass spectrometric method (MALDI-ToF MS). In preliminary studies we found that the bacteria A. baylyi utilizes no L-phenylalanine as a single source of carbon and nitrogen, as well as the only source of carbon in a medium with mineral nitrogen sources, but utilizes L-phenylalanine as the only source of nitrogen only if it is supplemented with ethanol as the only source of carbon. Based on this A. baylyi property, a selective medium was developed for the isolation of these bacteria from river water. Composition and preparation of liquid selective medium were as follows: 1 liter of distilled water added with L-phenylalanine (CAS 63-91-2) 2.0 (g/l); NaCI 5.0; Na2SO4 2.0; KH2PO4 1.0; K2HPO4 2.5; MgSO4 0.1; dissolved while heating, boiled for 5 minutes, 4 ml of 96-degree ethanol was added to a warm medium, pH 7.2±0.2 assessed; 40 ml were poured into sterile vials. Dense selective medium: the same ingredients and extra 15.0 g of agar are added to 1 liter of distilled water; with similar preparation technique, the medium is poured into sterile Petri dishes. Method of application of selective nutrient medium for isolation of A. baylyi from river water: water from the river Neva is seeded in a volume of 10 ml into a vial with 40 ml of liquid selective medium, incubated in aerobic conditions at 28°С for 48 h, then the enriched material from the flask is placed with a bacteriological loop onto the surface of same dense selective medium in two flasks; incubated in aerobic conditions at 28°С for 48 h. 10 isolated colonies are selected for subsequent identification, they are transplanted into sectors of nutrient agar, incubated at 28°С 24 h and isolates are identified by a complex of phenotypic characteristic of A. baylyi, and/or by the MALDI-ToF MS method. In this case, 19 isolates from 20 were identified as A. baylyi (95% of isolates). A study using this technique of three more water samples from the river Neva showed the results of the same narrowly selective orientation — 90–95% of the isolates were bacteria A. baylyi.
Цель исследования — повышение селективности выделения бактерий Acinetobacter baylyi из речной воды. При разработке селективной среды использовали 5 штаммов A. baylyi, из них 4 были выделены из воды реки Невы, 1 — из клинического материала. Штаммы A. baylyi идентифицировали по комплексу фенотипических признаков и/или с помощью масс-спектрометрического метода (MALDI-ToF MS). В предварительных исследованиях было установлено, что бактерии A. baylyi не утилизируют L-фенилаланин в качестве единственного источника углерода и азота, а также в качестве единственного источника углерода на среде с минеральными источниками азота, но утилизируют L-фенилаланин в качестве единственного источника только азота, если он дополняется этанолом в качестве единственного источника углерода. На основе этого свойства A. baylyi была разработана селективная среда для выделения этих бактерий из речной воды. Состав и приготовление жидкой селективной среды: в 1 л дистиллированной воды вносят (г/л) L-фенилаланин (CAS 63-91-2) 2,0; NaCI 5,0; Na2SO4 2,0; KH2PO4 1,0; K2HPO4 2,5; MgSO4 0,1; растворяют при нагревании, кипятят 5 мин, добавляют в теплую среду 4 мл 96-градусного этанола, проверяют рН 7,2±0,2; разливают по 40 мл в стерильные флаконы. Плотная селективная среда: содержит на 1 л дистиллированной воды те же ингредиенты и дополнительно 15,0 г агара; приготовление такое же, среду разливают в стерильные чашки Петри. Методика применения селективной питательной среды для выделения A. baylyi из речной воды: воду реки Невы засевают в объеме 10 мл во флакон с 40 мл жидкой селективной среды, инкубируют в аэробных условиях при 28°С 48 ч, затем пересевают бактериологической петлей обогащенный материал из флакона на поверхность плотной селективной среды такого же состава в две чашки; инкубируют посевы в аэробных условиях при 28°С 48 ч. Отбирают для последующей идентификации по 10 изолированных колоний, пересевают их на секторы питательного агара, инкубируют при 28°С 24 ч и идентифицируют изоляты по комплексу фенотипических признаков, характерных для A. baylyi, и/или методом MALDI-ToF MS. В данном примере из 20 выделенных изолятов 19 являлись бактериями A. baylyi (95% изолятов). Исследование по указанной методике еще трех проб воды из реки Невы показали результаты одинаковой узкоселективной направленности — 90–95% изолятов составляли бактерии A. baylyi.