CAR-NK therapy: NK cell expansion exposed to HEK 293T cell line

Full Text

Введение

Создание персонализированного препарата для иммунотерапии опухолевых заболеваний, включающей генетическую модификацию иммунных клеток, состоит из нескольких этапов. В первую очередь, это выбор популяции иммунных клеток, которая будет осуществлять противоопухолевую активность, а также разработка генетической конструкции химерного рецептора антигена (CAR), экспрессия которого необходима для эффективного распознавания опухолевых антигенов и последующей активации иммунной клетки. На данный момент в большинстве доклинических и клинических испытаний используются Т-лимфоциты ввиду их активного клеточного деления и выраженного цитотоксического действия. Кроме того, Т-клетки легко получить от донора или пациента в большом количестве, например, при заборе крови [18]. Однако данная клеточная популяция не лишена недостатков при ее использовании в рамках CAR-терапии. При инфузии CAR-Т-клеток у пациентов наблюдается развитие нежелательных побочных реакций различной степени тяжести, чаще всего пациенты сталкиваются с синдромом высвобождения цитокинов и нейротоксичностью [4]. Кроме того, такая терапия требует тщательного подбора донора по системе главного лейкоцитарного антигена человека (HLA), что может быть осложнено отсутствием у пациента кровных родственников, а также увеличивает сроки изготовления CAR-Т-препарата [5]. Альтернативой Т-лимфоцитам могут служить натуральные киллеры (NK). Их использование не требует детального подбора донора, а при инфузии данных клеток не наблюдается выраженных токсических проявлений [29]. CAR-терапия на основе NKT-клеток, обладающих как характеристиками NK-, так и характеристиками Т-клеток, также является заслуживающим внимания подходом к лечению опухолевых заболеваний. NKT-клетки являются одними из главных участников реализации противоопухолевой иммунной защиты, а также выделяют широкий спектр провоспалительных цитокинов [6].

Следующими этапами разработки CAR-препарата после выбора популяции иммунных клеток является их выделение из источника клеток, активация, генетическая модификация, обогащение CAR-лимфоцитов, а также заморозка готового клеточного продукта на финальном этапе культивирования. Существуют различные протоколы для экспансии клеток-эффекторов, в которых варьируют такие характеристики, как длительность культивирования, тип клеточной популяции, источник иммунных клеток, использование методов сепарации, способ внедрения в клетку генетической конструкции, использование активаторов пролиферации и наличие в питательной среде фидерных клеток.

В большинстве методик для обогащения популяции NK-клеток используется длительный режим культивирования в течение 21 дня. В качестве источников NK-клеток используются мононуклеарные клетки периферической крови (МНК), пуповинная кровь, стволовые клетки и линии NK-клеток [16]. Для генетической модификации NK-клеток используются те же инструменты, что и для манипуляций с Т-лимфоцитами: CAR-трансген доставляется в NK-клетки с помощью вирусных и невирусных векторов [9]. Также для получения «чистой» популяции NK-клеток используются методы разделения клеточных популяций с применением клеточного сортера или магнитного сепаратора. Несмотря на различия между NK- и NKT-клетками, протоколы для экспансии NKT-клеток мало отличаются от таковых для NK-клеток, они также включают длительный режим культивирования и наличие активаторов пролиферации [28].

Ex vivo активация и стимуляция пролиферации выделенных NK- или NKT-клеток необходима по нескольким причинам. Так степень активации иммунных клеток коррелирует с эффективностью проводимых генетических модификаций, поскольку процесс клеточного деления облегчает проникновение в клетку вирусного вектора [22]. Экспансия NK- и NKT-клеток ex vivo является важной задачей при создании CAR-NK- и CAR-NKT-клеток, поскольку для иммунотерапии требуется введение большого количества модифицированных лимфоцитов. Кроме того, активированные иммунные клетки обладают естественной повышенной цитотоксичностью, что лежит в основе другого подхода к иммунотерапии опухолевых заболеваний — адоптивной клеточной терапии с использованием активированных опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов [13].

Существует три подхода к стимуляции NK- и NKT-клеток: использование провоспалительных цитокинов, фидерных клеток и/или веществ, активирующих рецепторы врожденного или приобретенного иммунитета (L-фитогемагглютинин, конканавалин А, MICA, липополисахарид, иономицин, моноклональные антитела (МАТ) к CD3- и CD28-рецепторам). Согласно литературным данным, наиболее часто в методиках для эффективной экспансии NK-клеток применяют фидерные клетки, которые подразделяются на аутологичные и аллогенные. В качестве аутологичных фидерных клеток рассматривается сокультивирование с целевой популяцией других иммунных клеток, полученных из того же источника и оказывающих активирующее воздействие путем межклеточного контакта или через секрецию цитокинов. [25]. Использование аутологичных фидерных клеток является хорошо изученной, безопасной и максимально приближенной к in vivo условиям технологией. Тем не менее при использовании необлученных фидерных клеток такой подход может приводить к их нежелательной экспансии и «загрязнению» клеточного продукта.

Помимо рассмотренных аутологичных фидерных клеток, в качестве аллогенных фидеров выступают различные клеточные линии. Среди них наиболее распространенными для активации NK-клеток являются: В-клеточная лимфобластома, трансформированная вирусом Эпштейна–Барр (EBV-TM-LCL), хроническая миелогенная лейкемия (K562) с различными генетическими модификациями, промоноцитная лейкемия (U937), Т-лимфобластная лейкемия (CEM), а также Т-лимфобластная лейкемия (Jurkat) [1, 20, 23]. Также для усиления стимуляции NK-клеток используют клеточные культуры, модифицированные таким образом, что клетки данных линий экспрессируют интерлейкины или другие активационные молекулы [8, 19].

Клеточная линия почек эмбриона человека, содержащая Т-антиген SV40 (HEK 293T) является одной из самых часто используемых клеточных культур в лабораторной практике. Благодаря белку SV40 клетки HEK 293T обладают способностью реплицировать векторы, несущие область репликации SV40, что находит широкое применение для производства ретровирусов, экспрессии генов и производства белков [12, 26, 31]. Высокая эффективность проводимой трансдукции указывает на потенциальную возможность модификации клеток HEK 293T с целью экспрессии опухолевых антигенов или провоспалительных цитокинов, что может быть использовано для активации и обогащения NK-клеток. В данной работе проводилась оценка воздействия немодифицированной культуры клеток HEK 293T на пролиферацию, цитотоксичность и экспрессию активационных маркеров NK- и NKT-клеток в режиме длительного культивирования в присутствии необлученных аутологичных фидерных клеток.

Материалы и методы

Выделение МНК из периферической крови и лейкоцитарно-тромбоцитарного концентрата. Выделение МНК из периферической крови и лейкоцитарно-тромбоцитарного концентрата проводили с использованием метода седиментации в одноступенчатом градиенте плотности фиколла (р = 1,077 г/см³). Кровь из пробирок, содержащих ЭДТА, разводили в 2 раза раствором Хенкса (ПанЭко, Россия). При выделении клеток из лейкоцитарно-тромбоцитарного концентрата его центрифугировали 10 мин при 1500g, +23°C, отбирали лейкоцитарный слой и разводили его раствором Хенкса в 3 раза. Далее, вне зависимости от источника МНК, образцы наслаивали на 1,5 мл фиколла (FICOLL PAQUE, GE HEALTHCARE, США) и центрифугировали 25 мин при 1500g, +23°C. Затем отбирали слой мононуклеарных клеток и проводили трехкратную отмывку раствором Хенкса, центрифугируя в течение 5 мин при 1500g, +23°C, и отбирая после этого надосадочную жидкость. После этого проводили подсчет живых клеток с использованием красителя трипанового синего (ПанЭко, Россия) в автоматическом счетчике клеток «Luna II» (Logos Biosystems, Республика Корея). Показатель жизнеспособности > 90% считали удовлетворительным. Клетки доводили до рабочей концентрации 3,5–4 × 10⁶/мл с помощью питательной среды ДМЕМ, содержащей 4,5 г/л глюкозы (ПанЭко, Россия), а также 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (HyClone, США), пенициллин-стрептомицин (ПанЭко, Россия). После этого свежевыделенные МНК подвергали активации.

Сорбция моноклональных антител для последующей активации МНК. Для активации МНК использовали МАТ к CD3- и CD28-рецепторам (BioLegend, США) в концентрациях 5 мкг/мл для анти-CD3 антител и 10 мкг/мл — анти-CD28 антител. Для достижения заданной концентрации антител готовили их растворы в стерильном фосфатном буферном солевом растворе (ФСБ) и добавляли по 1 мл/лунку в стерильный 12-луночный культуральный планшет (SPL life Sciences, Республика Корея). Далее проводили инкубацию в течение 5 ч и последующую трехкратную отмывку от несвязавшихся антител с помощью 1% раствора бычьего сывороточного альбумина (Sigma, Roedermark, Germany) в ФСБ.

Активация свежевыделенных МНК. В данной работе активацию свежевыделенных МНК проводили двумя способами: с помощью МАТ и с помощью фидерных клеток клеточной линии почек эмбриона человека HEK 293T полученной из коллекции клеточных культур НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина. При активации МАТ суспензию МНК вносили к сорбированным антителам в концентрации 3,5–4 × 10⁶/мл. После чего клетки инкубировали 48 ч при 37°C в СО₂-инкубаторе модели «SCO5A» (Sheldon Manufacturing Inc., США). При активации свежевыделенных МНК эмбриональными клетками HEK 293T 3,5–4 × 10⁶/мл МНК вносили в стерильный 12-луночный культуральный планшет (SPL life Sciences, Республика Корея), в лунках которого находились обработанные Митомицином С (Sigma-Aldrich, США) HEK 293T в состоянии монослоя. Соотношение МНК: НЕК 293Т составляло 5:1. Далее клетки инкубировали 48 ч при 37°C в СО₂-инкубаторе.

Обработка НЕК 293Т Митомицином С. Для блокировки клеточного деления клеточную линию НЕК 293Т сеяли в стерильный 12-луночный культуральный планшет с использованием полной ростовой среды ДМЕМ, количество клеток в посевном материале составляло 4,5 × 10⁵/лунку. На следующий день, когда культура достигала 100% конфлюэнтности, из лунок осторожно удаляли весь объем культуральной среды. Далее в каждую лунку добавляли по 1 мл свежей культуральной среды, содержащей митомицин С в концентрации 7,5 мкг/мл. Инкубировали планшет 1 ч при 37°C в СО₂-инкубаторе. Далее проводили двукратную отмывку раствором Хенкса, после чего добавляли по 1,5 мл/лунку свежей полной культуральной среды. Инкубировали планшет 1 ч при 37°C в СО_2-инкубаторе, однократно отмывали лунки раствором Хенкса и добавляли по 2 мл/лунку свежей полной культуральной среды.

Повторная активация МНК. Дополнительную активацию первичной культуры лимфоцитов проводили на 8-й и/или 15-й день культивирования. Для этого при помощи автоматического счетчика клеток подсчитывали концентрацию и жизнеспособность лимфоцитов. Показатель жизнеспособности > 90% считали удовлетворительным. Из лунок 12-луночного культурального планшета, содержащего однодневную монослойную культуру НЕК 293Т, обработанную митомицином С, удаляли питательную среду и вносили по 2 мл/лунку первичной культуры лимфоцитов, доведенной до концентрации 1,8 × 10⁶ клеток/мл в полной культуральной среде. Инкубировали 20 ч при 37°C в СО₂-инкубаторе. Далее осторожно переносили лимфоциты в стерильный 6-луночный культуральный планшет (SPL life Sciences, Республика Корея) и добавляли равный объем полной культуральной средой, содержащей 500 IU/мл человеческого рекомбинантного IL-2 (Xuri, Китай).

Культивирование лимфоцитов. Культивирование лимфоцитов проводили в течение 21 дня с момента выделения МНК. Клетки культивировали в 12-луночных и 6-луночных культуральных планшетах (SPL life Sciences, Республика Корея) и в культуральных флаконах 25 см² (SPL life Sciences, Республика Корея) в присутствии питательной среды ДМЕМ c 4,5 г/л глюзозы, 10% FBS, 500 IU/мл человеческого рекомбинантного IL-2 (Xuri, Китай), 10 нг/мл человеческого рекомбинантного IL-15 (Sci-Store, Россия), 20 нг/мл человеческого рекомбинантного IL-21 (Peprotech, США) при 37°C в СО₂-инкубаторе. Периодически с помощью световой микроскопии производили контроль морфологических характеристик лимфоцитов и визуальный контроль отсутствия микробной контаминации. С использованием трипанового синего и автоматического счетчика клеток проводили оценку жизнеспособности и количества культивируемых клеток. Показатель жизнеспособности > 90% считали удовлетворительным. Концентрацию клеток при культивировании поддерживали в диапазоне от 3 × 10⁵/мл до 1 × 10⁶/мл.

Культивирование клеточных линий. В работе использовали линии клеток HEK 293T, HG3, T47D-HER2+ и K562, полученные из коллекции клеточных культур НМИЦ Онкологии им. Н.Н. Блохина. Клеточные линии HEK 293T, HG3 и K562 культивировали на среде ДМЕМ (ПанЭко, Россия), содержащей 4,5 г/л глюкозы, 10% FBS и пенициллин-стрептомицин (ПанЭко, Россия), и инкубировали в CO₂-инкубаторе при температуре 37°С. Клеточную культуру T47D-HER2+ культивировали на среде RPMI-1640 (ПанЭко, Россия), содержащей 4,5 г/л глюкозы, 10% FBS и генетицин (ПанЭко, Россия), и инкубировали в CO₂-инкубаторе при температуре 37°С.

Проточная цитофлуориметрия. Методом проточной цитофлуориметрии производили анализ экспрессии поверхностных маркеров лимфоцитов. На этапе пробоподготовки живые клетки подсчитывали и доводили до концентрации 1 × 10⁶/мл. К 100 мкл клеток добавляли меченые флюорохромом МАТ в концентрациях, рекомендованных производителем. Инкубировали 30 мин при 4°С в темноте. Далее производили трехкратную отмывку раствором ФСБ от несвязавшихся антител, центрифугируя 1500g 5 мин 23°С и удаляя надосадочную жидкость. К осадку добавляли 200 мкл ФСБ и раствор пропидия йодида (PI) до конечной концентрации 30 нг/мл (Sigma, США). Изучение экспрессии поверхностных маркеров осуществляли при использовании следующих МАТ: анти-CD3-PerCP (BD Pharmingen, США), анти-CD56-PE (Life Technologies, США), анти-CD8-APC (Invitrogen, США), анти-CD4-FITC (BD Pharmingen, США), анти-CD16-FITC (BD Pharmingen, США), анти-CD16-FITC (BD Pharmingen, США), анти-CD16-PE (BD Pharmingen, США), анти-CD25-APC (BD Pharmingen, США), анти-NKp30 /CD337-PE (BD Pharmingen, США), анти-NKG2D/CD314-APC (BD Pharmingen, США), анти-CD38-FITC (BD Pharmingen, США), анти-CD69-PE (BD Pharmingen, США). Комбинацию меченых флуорохромами антител для обработки проб подбирали с учетом особенности диапазона детекции длины волны каждого флуорохрома. Анализ проводили на проточном цитофлуориметре «Novocyte» (ACEA Biosciences Inc., США) с использованием программного обеспечения Novo-Express 1.5.0. Погибшие клетки исключали из анализа по показателям рассеивания. Анализировали не менее 10 тыс. живых клеток.

Цитотоксический тест. Для оценки эффекторной функции культивируемых лимфоцитов использовали раствор резазурина в концентрации 5 мг/мл (Sigma-Aldrich, США). В качестве культур-мишеней использовали суспензионные культуры HG3 и K562, а также адгезионную культуру T47D-HER2+. Для проведения цитотоксического теста использовали стерильные 96-луночные планшеты (SPL life Sciences, Республика Корея), в которые одномоментно вносили клетки-эффекторы (Э) и клетки-мишени (М) в соотношении (Э:М) 5:1. При проведении цитотоксического теста концентрация клеток HG3 или K562 составляла 1 × 10⁴ клеток/лунку, а концентрация T47D-HER2+ — 0,5 × 10⁴ клеток/лунку. В качестве отрицательного контроля мишеней использовали лунки, в которые вместо эффекторов вносили полную ростовую среду ДМЕМ. В качестве отрицательного контроля эффекторов использовали лунки, в которые вместо мишеней вносили полную ростовую среду ДМЕМ. Для оценки антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ) в лунки дополнительно вносили анти-HER2 МАТ Герцептин (Трастузумаб) (Roche, Швейцария) в конечной концентрации 5 мкг/мл при использовании в качестве мишени клеточную линию T47D-HER2+, или анти-CD20 МАТ Ритуксимаб (Roche, Швейцария) в конечной концентрации 5 мкг/мл при использовании в качестве мишени линию HG3. Конечный объем в каждой контрольной или экспериментальной лунке составлял 220 мкл. Каждая анализируемая точка имела 3 повтора. Затем планшет инкубировали в CO₂-инкубаторе при температуре 37°С в течение суток. На следующий день в каждую лунку вносили по 20 мкл раствора резазурина аналогично протоколу АlamarBlue Cell Viability Reagent Product Information Sheet (Pub. No. MAN0018317 C.0). Затем планшет инкубировали в течение суток в CO2-инкубаторе при температуре 37°С и измеряли интенсивность флуоресценции на мультирежимном планшетном ридере «Spark» (Tecan, Швейцария). Анализ проводили при длине возбуждения 560 нм и длине эмиссии 600 нм с использованием программного обеспечения Sparkcontrol v3.1. Цитотоксичность (%) оценивали по формуле:

$\left(\raisebox{1ex}{$1-\left(\left(\mathrm{Э} + \mathrm{М}\right)-\mathrm{М}\right)$}\!\left/ \!\raisebox{-1ex}{$\mathrm{М}$}\right.) \right)$ $\times 100$,

где Э + М — это среднее значение интенсивности флуоресценции для трех аналогичных лунок, в которых находились клетки-эффекторы и клетки-мишени; Э — это среднее значение интенсивности флуоресценции для трех аналогичных лунок, в которых находились только клетки-эффекторы; М — это среднее значение интенсивности флуоресценции для трех аналогичных лунок, в которых находились только клетки-мишени

Статистическая обработка данных. Данные экспериментов представлены как среднее значение±SD. Результаты были проанализированы с использованием Statistica 10. Тест ANOVA с критерием Tukey HSD использовался для оценки различий. Достоверными считали значения p < 0,05.

Результаты

В данной работе использовались различные схемы для активации первичной культуры лимфоцитов (рис. 1). Так, активация проводилась с помощью МАТ, HEK 293T или при сочетании обоих способов. В качестве группы сравнения использовали лимфоциты, активированные только МАТ к CD3-, CD28-рецепторам в начале культивирования, поскольку данный подход для экспансии иммунных клеток на сегодняшний день, согласно литературным данным, является самым распространенным. Оценка эффективности используемого метода активации проводилась путем анализа популяционного состава культивируемых клеток, экспрессии активационных поверхностных маркеров, а также сравнения реализации эффекторных функций в отношении адгезионной культуры T47D-HER2+, суспензионной культуры HG3 и «классической» мишени для NK-клеток — суспензионной клеточной линии K562.

 

Рисунок 1. Различные подходы к активации пролиферации культивируемых лимфоцитов

Figure 1. Different approaches to the activation and proliferation of cultured lymphocytes

Примечание. А — активация только с помощью МАТ в начале культивирования; Б — активация с помощью МАТ с последующей активацией культурой HEK 293T на 8-й день культивирования; В — активация с помощью МАТ с последующей активацией культурой HEK 293T на 15-й день культивирования; Г — активация с помощью МАТ с последующей активацией культурой HEK 293T на 8-й и 15-й день культивирования; Д — активация только клеточной линией HEK 293T в начале культивирования.

Note. A — activation with mAbs at the beginning of cultivation; B — activation with mAbs and additional stimulation with HEK 293T cells on the 8th cultivation day; C — activation with mAbs and additional stimulation with HEK 293T cells on the 15th cultivation day; D — activation with mAbs and additional stimulation with HEK 293T cells on the 8th and 15th cultivation day; E — activation with HEK 293T cells at the beginning of cultivation.

 

Активация лимфоцитов МАТ с последующей активацией культурой HEK 293T

В зависимости от выбранного режима активации выявлялись различные биологические эффекты HEK 293T на первичную культуру лимфоцитов. При активации МАТ с последующей дополнительной стимуляцией культурой HEK 293T на 8-й день культивирования наблюдалось увеличение доли CD3^–CD56⁺, CD56⁺CD16⁺, CD56⁺CD4⁺, CD56⁺NKp30⁺ клеток и иммунорегуляторного индекса к 14-му дню культивирования, относительно активации только МАТ (табл. 1). Однако к 21-му дню культивирования экспрессия активационных маркеров, за исключением CD16-рецептора, снижалась, и фенотипические характеристики культивируемых лимфоцитов оказывались сопоставимы с контролем. Также в рамках исследования проводились различные цитотоксические тесты: на культуре клеток рака молочной железы, которая сверхэкспрессирует рецептор HER2 (T47D-HER2+), и клеточной линии хронической В-клеточной лейкемии (HG3) изучали антителозависимую клеточную цитотоксичность, а на культуре клеток хронической миелогенной лейкемии — прямую цитотоксичность. Цитотоксичность иммунных клеток после дополнительной стимуляции на 8-й день культивирования в отношении клеток-мишеней HG3 была выше цитотоксичности лимфоцитов, активированных только МАТ (рис. 2). Также на 14-й день относительно контроля наблюдалось увеличение цитотоксичности при использовании культуры-мишени K562.

 

Таблица 1. Pецепторный профиль и соотношение субпопуляций лимфоцитов при дополнительной стимуляции клеточной линией HEK 293T на 8-й день культивирования, p < 0,05

Table 1. Receptor profile and lymphocyte subpopulations after additional stimulation with the HEK 293T cells on the 8th cultivation day, p < 0.05

День культивирования Cultivation day	1-й (до активации) 1st (before activation)	7-й 7th	14-й 14th	21-й 21st
Активация МАТ однократно в начале культивирования Activation with mAbs at the beginning of cultivation
Доля CD3–CD56+ клеток, % Proportion of CD3–CD56+ cells, %	18,15±2,5	9,34±1,1	6,89±0,8	3,62±0,5
Доля CD3+CD56+ клеток, % Proportion of CD3+CD56+ cells, %	5,5±0,9	16,52±1,7	39,03±4,2	73,52±7,5
Доля CD3+CD56– клеток, % Proportion of CD3+CD56– cells, %	59,91±6,1	71,66±6,9	45,21±4,8	21,54±2,5
Иммунорегуляторный индекс Immunoregulatory index	1,63±0,2	1,2±0,2	0,67±0,4	0,41±0,3
Доля CD56+CD8+ клеток, % Proportion of CD56+CD8+ cells, %	5,52±0,6	11,67±1,8	40,87±3,9	51,99±5,8
Доля CD56+CD4+ клеток, % Proportion of CD56+CD4+ cells, %	0,5±0,3	2,2±0,4	1,65±1,8	1,03±0,6
Доля NKG2D+ клеток, % Proportion of NKG2D+ cells, %	38,91±4	54,33±5,7	88,12±9,1	92,35±7,9
Доля CD56+NKG2D+ клеток, % Proportion of CD56+NKG2D+ cells, %	22,15±2,4	29,24±3,2	50,1±5,2	72,55±7,5
Доля NKp30+ клеток, % Proportion of NKp30+ cells, %	15,46±1,7	19,18±2,3	23,86±2,8	6,15±0,8
Доля CD56+NKp30+ клеток, % Proportion of CD56+NKp30+ cells, %	14,12±1,3	17,63±1,7	17,67±1,9	6,75±0,8
Доля CD16+ клеток, % Proportion of CD16+ cells, %	22,07±3,2	19,02±2,2	9,02±1,1	6,1±0,9
Доля CD56+CD16+ клеток, % Proportion of CD56+CD16+ cells, %	16,7±1,9	15,4±1,7	7,82±1,4	5,79±1,1
Активация МАТ + дополнительная стимуляция культурой HEK 293T на 8-й день культивирования Activation with mAbs + additional stimulation with HEK 293T cells on the 8th cultivation day
Доля CD3–CD56+ клеток, % Proportion of CD3–CD56+ cells, %	18,15±2,5	9,34±1,1	15,21±1,7	5,38±0,8
Доля CD3+CD56+ клеток, % Proportion of CD3+CD56+ cells, %	5,5±0,9	16,52±1,7	44,37±4,6	68,6±7,1
Доля CD3+CD56– клеток, % Proportion of CD3+CD56– cells, %	59,91±6,1	71,66±6,9	36,69±3,5	23,91±2,6
Иммунорегуляторный индекс Immunoregulatory index	1,63±0,2	1,2±0,2	1,21±0,3	0,41±0,2
Доля CD56+CD8+ клеток, % Proportion of CD56+CD8+ cells, %	5,52±0,6	11,67±1,8	39,86±4	48,54±4,9
Доля CD56+CD4+ клеток, % Proportion of CD56+CD4+ cells, %	0,5±0,3	2,2±0,4	7,49±7,2	1,07±0,6
Доля NKG2D+ клеток, % Proportion of NKG2D+ cells, %	38,91±4	54,33±5,7	86,38±8,2	96,64±3,1
Доля CD56+NKG2D+ клеток, % Proportion of CD56+NKG2D+ cells, %	22,15±2,4	29,24±3,2	42,99±4,5	73,02±7,4
Доля NKp30+ клеток, % Proportion of NKp30+ cells, %	15,46±1,7	19,18±2,3	27,17±2,9	7,21±0,8
Доля CD56+NKp30+ клеток, % Proportion of CD56+NKp30+ cells, %	14,12±1,3	17,63±1,7	25,65±2,6	8,07±0,9
Доля CD16+ клеток, % Proportion of CD16+ cells, %	22,07±3,2	19,02±2,2	20,33±3	17,29±1,8
Доля CD56+CD16+ клеток, % Proportion ofCD56+CD16+ cells, %	16,7±1,9	15,4±1,7	22,1±2,6	14,95±1,8

 

Рисунок 2. Цитотоксичность лимфоцитов, активированных МАТ и культурой HEK 293T, p < 0,05

Figure 2. Cytotoxicity of lymphocytes after activatation with mAbs and stimulation with HEK 293T cells, p < 0.05

 

Применение однократной дополнительной активации лимфоцитов клеточной линией HEK 293T на 15-й день культивирования приводило к увеличению в процентном соотношении CD3^–CD56⁺, CD56⁺CD4⁺, CD56⁺CD16⁺ и CD56⁺NKp30⁺ лимфоцитов, а также иммунорегуляторного индекса относительно активации с использованием только МАТ, но снижало цитотоксичность по отношению к суспензионной линии HG3 (табл. 2, рис. 2). По результатам цитотоксического теста, проводимого на 21-й день культивирования, при данном режиме активации наблюдался наибольший процент цитотоксичности при использовании «классической» мишени NK-клеток — K562, а цитотоксичность по отношению к адгезионной культуре T47D-HER2+ оказалось сопоставима с контролем.

 

Таблица 2. Pецепторный профиль и соотношение субпопуляций лимфоцитов при дополнительной стимуляции клеточной линией HEK 293T на 15-й день культивирования, p < 0,05

Table 2. Receptor profile and lymphocyte subpopulations after additional stimulation with the HEK 293T cells on the 15th cultivation day, p < 0.05

День культивирования Cultivation day	1-й (до активации) 1st (before activation)	7-й 7th	14-й 14th	21-й 21st
Активация МАТ однократно в начале культивирования A3:E20
Доля CD3–CD56+ клеток, % Proportion of CD3–CD56+ cells, %	18,15±2,5	9,34±1,1	6,89±0,8	3,62±0,5
Доля CD3+CD56+ клеток, % Proportion of CD3+CD56+ cells, %	5,5±0,9	16,52±1,7	39,03±4,2	73,52±7,5
Доля CD3+CD56– клеток, % Proportion of CD3+CD56– cells, %	59,91±6,1	71,66±6,9	45,21±4,8	21,54±2,5
Иммунорегуляторный индекс Immunoregulatory index	1,63±0,2	1,2±0,2	0,67±0,4	0,41±0,3
Доля CD56+CD8+ клеток, % Proportion of CD56+CD8+ cells, %	5,52±0,6	11,67±1,8	40,87±3,9	51,99±5,8
Доля CD56+CD4+ клеток, % Proportion of CD56+CD4+ cells, %	0,5±0,3	2,2±0,4	1,65±1,8	1,03±0,6
Доля NKG2D+ клеток, % Proportion of NKG2D+ cells, %	38,91±4	54,33±5,7	88,12±9,1	92,35±7,9
Доля CD56+NKG2D+ клеток, % Proportion of CD56+NKG2D+ cells, %	22,15±2,4	29,24±3,2	50,1±5,2	72,55±7,5
Доля NKp30+ клеток, % Proportion of NKp30+ cells, %	15,46±1,7	19,18±2,3	23,86±2,8	6,15±0,8
Доля CD56+NKp30+ клеток, % Proportion of CD56+NKp30+ cells, %	14,12±1,3	17,63±1,7	17,67±1,9	6,75±0,8
Доля CD16+ клеток, % Proportion of CD16+ cells, %	22,07±3,2	19,02±2,2	9,02±1,1	6,1±0,9
Доля CD56+CD16+ клеток, % Proportion of CD56+CD16+ cells, %	16,7±1,9	15,4±1,7	7,82±1,4	5,79±1,1
Активация МАТ + дополнительная стимуляция культурой HEK 293T на 15-й день культивирования Activation with mAbs + additional stimulation with HEK 293T cells on the 15th cultivation day
Доля CD3–CD56+ клеток, % Proportion of CD3–CD56+ cells, %	18,15±2,5	9,34±1,1	6,89±0,8	6,55±0,6
Доля CD3+CD56+ клеток, % Proportion of CD3+CD56+ cells, %	5,5±0,9	16,52±1,7	39,03±4,2	69,85±7,2
Доля CD3+CD56– клеток, % Proportion of CD3+CD56– cells, %	59,91±6,1	71,66±6,9	45,21±4,8	20,58±2,1
Иммунорегуляторный индекс Immunoregulatory index	1,63±0,2	1,2±0,2	0,67±0,4	1,8±0,3
Доля CD56+CD8+ клеток, % Proportion of CD56+CD8+ cells, %	5,52±0,6	11,67±1,8	40,87±3,9	47,32±5,5
Доля CD56+CD4+ клеток, % Proportion of CD56+CD4+ cells, %	0,5±0,3	2,2±0,4	1,65±18	6,38±0,7
Доля NKG2D+ клеток, % Proportion of NKG2D+ cells, %	38,91±4	54,33±5,7	88,12±9,1	93,77±6,1
Доля CD56+NKG2D+ клеток, % Proportion of CD56+NKG2D+ cells, %	22,15±2,4	29,24±3,2	50,1±5,2	72,77±6,9
Доля NKp30+ клеток, % Proportion of NKp30+ cells, %	15,46±1,7	19,18±2,3	23,86±2,8	25,78±2,8
Доля CD56+NKp30+ клеток, % Proportion of CD56+NKp30+ cells, %	14,12±1,3	17,63±1,7	17,67±1,9	24,95±2,7
Доля CD16+ клеток, % Proportion of CD16+ cells, %	22,07±3,2	19,02±2,2	9,02±1,1	19,22±2,3
Доля CD56+CD16+ клеток, % Proportion of CD56+CD16+ cells, %	16,7±1,9	15,4±1,7	7,82±1,4	17,23±1,9

 

Двукратная стимуляция культивируемых лимфоцитов, проводимая на 8-й и 15-й день культивирования, демонстрировала снижение цитотоксичности относительно однократных методов стимуляции и относительно активации МАТ (рис. 2). Тем не менее данный режим активации оказывал наиболее выраженное (относительно комбинированных методов активации МАТ и клеточной линией) влияние на увеличение экспрессии CD56⁺CD4⁺, CD56⁺NKp30⁺ и CD56⁺CD16⁺лимфоцитов, определение которой проводилось на 21-й день культивирования (табл. 3).

 

Таблица 3. Pецепторный профиль и соотношение субпопуляций лимфоцитов при дополнительной стимуляции клеточной линией HEK 293T на 8-й и 15-й день культивирования, p < 0,05

Table 3. Receptor profile and lymphocyte subpopulations after additional stimulation with the HEK 293T cells on the 8th and 15th cultivation day, p < 0.05

День культивирования Cultivation day	1-й (до активации) 1st (before activation)	7-й 7th	14-й 14th	21-й 21st
Активация МАТ однократно в начале культивирования Activation with mAbs at the beginning of cultivation
Доля CD3–CD56+ клеток, % Proportion of CD3–CD56+ cells, %	18,15±2,5	9,34±1,1	6,89±0,8	3,62±0,5
Доля CD3+CD56+ клеток, % Proportion of CD3+CD56+ cells, %	5,5±0,9	16,52±1,7	39,03±4,2	73,52±7,5
Доля CD3+CD56– клеток, % Proportion of CD3+CD56– cells, %	59,91±6,1	71,66±6,9	45,21±4,8	21,54±2,5
Иммунорегуляторный индекс Immunoregulatory index	1,63±0,2	1,2±0,2	0,67±0,4	0,41±0,3
Доля CD56+CD8+ клеток, % Proportion of CD56+CD8+ cells, %	5,52±0,6	11,67±1,8	40,87±3,9	51,99±5,8
Доля CD56+CD4+ клеток, % Proportion of CD56+CD4+ cells, %	0,5±0,3	2,2±0,4	1,65±1,8	1,03±0,6
Доля NKG2D+ клеток, % Proportion of NKG2D+ cells, %	38,91±4	54,33±5,7	88,12±9,1	92,35±7,9
Доля CD56+NKG2D+ клеток, % Proportion of CD56+NKG2D+ cells, %	22,15±2,4	29,24±3,2	50,1±5,2	72,55±7,5
Доля NKp30+ клеток, % Proportion of NKp30+ cells, %	15,46±1,7	19,18±2,3	23,86±2,8	6,15±0,8
Доля CD56+NKp30+ клеток, % Proportion of CD56+NKp30+ cells, %	14,12±1,3	17,63±1,7	17,67±1,9	6,75±0,8
Доля CD16+ клеток, % Proportion of CD16+ cells, %	22,07±3,2	19,02±2,2	9,02±1,1	6,1±0,9
Доля CD56+CD16+ клеток, % Proportion of CD56+CD16+ cells, %	16,7±1,9	15,4±1,7	7,82±1,4	5,79±1,1
Активация МАТ + дополнительная стимуляция культурой HEK 293T на 8-й и 15-й день культивирования Activation with mAbs + additional stimulation with HEK 293T cells on the 8th and 15th cultivation day
Доля CD3–CD56+ клеток, % Proportion of CD3–CD56+ cells, %	18,15±2,5	9,34±1,1	15,21±1,7	8,2±0,7
Доля CD3+CD56+ клеток, % Proportion of CD3+CD56+ cells, %	5,5±0,9	16,52±1,7	44,37±4,6	66,09±6,8
Доля CD3+CD56– клеток, % Proportion of CD3+CD56– cells, %	59,91±6,1	71,66±6,9	36,69±3,5	24,16±4,6
Иммунорегуляторный индекс Immunoregulatory index	1,63±0,2	1,2±0,2	1,21±0,3	0,43±0,2
Доля CD56+CD8+ клеток, % Proportion of CD56+CD8+ cells, %	5,52±0,6	11,67±1,8	39,86±4	27,07±3,3
Доля CD56+CD4+ клеток, % Proportion of CD56+CD4+ cells, %	0,5±0,3	2,2±0,4	7,49±7,2	49,58±5,8
Доля NKG2D+ клеток, % Proportion of NKG2D+ cells, %	38,91±4	54,33±5,7	86,38±8,2	94,65±5,2
Доля CD56+NKG2D+ клеток, % Proportion of CD56+NKG2D+ cells, %	22,15±2,4	29,24±3,2	42,99±4,5	85,32±8,6
Доля NKp30+ клеток, % Proportion of NKp30+ cells, %	15,46±1,7	19,18±2,3	27,17±2,9	58,79±6,1
Доля CD56+NKp30+ клеток, % Proportion of CD56+NKp30+ cells, %	14,12±1,3	17,63±1,7	25,65±2,6	57,05±5,9
Доля CD16+ клеток, % Proportion of CD16+ cells, %	22,07±3,2	19,02±2,2	20,33±3	55,07±5,8
Доля CD56+CD16+ клеток, % Proportion of CD56+CD16+ cells, %	16,7±1,9	15,4±1,7	22,1±2,6	54,74±5,7

 

Активация лимфоцитов клеточной линией HEK 293T в начале культивирования

Принципиально иным подходом к активации и обогащению популяции NK-клеток являлась стимуляция неактивированных МНК клетками HEK 293T без использования МАТ. Хотя при данном способе активации отмечался наименьший прирост активированных клеток (данные не представлены), такой подход оказался самым эффективным для обогащения популяции NK-клеток: на 4-й день после стимуляции HEK 293T доля NK-клеток (CD3^–CD56⁺) составляла в среднем 43%, в то время как в контроле доля CD3^–CD56⁺ лимфоцитов была 14,67% (табл. 4). Данная стимулированная культура лимфоцитов имела повышенную экспрессию NKG2D, NKp30 и CD16-рецептора на поверхности CD56⁺клеток относительно контроля. При рассмотрении динамики экспрессии поверхностных маркеров и соотношения популяций лимфоцитов в период с 4-го по 14-й день культивирования после активации клетками HEK 293T отмечалось постепенное уменьшение доли CD3^–CD56⁺, CD3⁺CD56^–, CD56⁺CD8⁺ клеток, а также возрастание доли CD3⁺CD56⁺, CD56⁺CD4⁺, CD56⁺NKp30⁺ и CD56⁺CD16⁺ лимфоцитов.

 

Таблица 4. Pецепторный профиль и соотношение субпопуляций лимфоцитов при стимуляции пролиферации клеточной линией HEK 293T в начале культивирования, p < 0,05

Table 4. Receptor profile and lymphocyte subpopulations after stimulation with the HEK 293T cells at the beginning of cultivation, p < 0.05

День культивирования Cultivation day	1-й (до активации) 1st (before activation)	4-й 4th	11-й 11th	14-й 14th
Активация МАТ однократно в начале культивирования Activation with mAbs at the beginning of cultivation
Доля CD3–CD56+ клеток, % Proportion of CD3–CD56+ cells, %	19,32±2,1	14,67±1,7	7,73±0,9	6,04±0,8
Доля CD3+CD56+ клеток, % Proportion of CD3+CD56+ cells, %	3,5±0,5	8,34±0,9	41,66±4,4	69,01±7,2
Доля CD3+CD56– клеток, % Proportion of CD3+CD56– cells, %	52,15±5,6	63,79±6,5	57,48±6	36,13±3,8
Иммунорегуляторный индекс Immunoregulatory index	1,60±0,2	1,42±0,2	0,66±0,3	0,44±0,1
Доля CD56+CD8+ клеток, % Proportion of CD56+CD8+ cells, %	2,9±0,4	7,27±0,9	33,12±3,6	57,64±5,8
Доля CD56+CD4+ клеток, % Proportion of CD56+CD4+ cells, %	0,78±0,2	2,94±0,3	2,96±0,4	2,61±0,4
Доля NKG2D+ клеток, % Proportion of NKG2D+ cells, %	36,46±3,9	44,3±4,3	66,7±7	87,77±8,9
Доля CD56+NKG2D+ клеток, % Proportion of CD56+NKG2D+ cells, %	20,33±2,2	29,08±3,1	41,46±4,4	62,65±6,5
Доля NKp30+ клеток, % Proportion of NKp30+ cells, %	18,51±2,1	17,35±1,8	16,3±1,8	9,61±1,1
Доля CD56+NKp30+ клеток, % Proportion of CD56+NKp30+ cells, %	15,5±1,7	13,6±1,5	11,57±1,4	7,98±0,9
Доля CD16+ клеток, % Proportion of CD16+ cells, %	20,09±2,1	18,01±1,9	8,19±0,9	5,41±0,6
Доля CD56+CD16+ клеток, % Proportion of CD56+CD16+ cells, %	17,23±1,9	16,29±1,8	7,44±0,9	4,95±0,5
Активация культурой HEK 293T однократно в начале культивирования Activation with HEK 293T cells at the biginning of cultivation
Доля CD3–CD56+ клеток, % Proportion of CD3–CD56+ cells, %	19,32±2,1	43,31±4,4	27,3±2,8	29,22±3,1
Доля CD3+CD56+ клеток, % Proportion of CD3+CD56+ cells, %	3,5±0,5	17,07±1,9	24,96±2,8	45,81±4,8
Доля CD3+CD56– клеток, % Proportion of CD3+CD56– cells, %	52,15±5,6	25,92±2,5	45,85±4,7	18,32±2,1
Иммунорегуляторный индекс Immunoregulatory index	1,60±0,2	5,97±0,7	3,41±0,6	3,4±0,5
Доля CD56+CD8+ клеток, % Proportion of CD56+CD8+ cells, %	2,9±0,4	20,27±2,5	13,12±1,7	6,3±0,8
Доля CD56+CD4+ клеток, % Proportion of CD56+CD4+ cells, %	0,78±0,2	22,04±2,6	45,11±4,4	57,75±5,9
Доля NKG2D+ клеток, % Proportion of NKG2D+ cells, %	36,46±3,9	40,04±4,6	58,36±6,1	87,77±9,1
Доля CD56+NKG2D+ клеток, % Proportion of CD56+NKG2D+ cells, %	20,33±2,2	45,21±4,8	63,89±6,6	74,65±7,6
Доля NKp30+ клеток, % Proportion of NKp30+ cells, %	18,51±2,1	47,92±4,9	52,75±5,7	60,05±5,9
Доля CD56+NKp30+ клеток, % Proportion of CD56+NKp30+ cells, %	15,5±1,7	39,54±4,1	48,49±5,3	54,05±5,6
Доля CD16+ клеток, % Proportion of CD16+ cells, %	20,09±2,1	36,15±3,8	40,82±4,2	52,33±5,3
Доля CD56+CD16+ клеток, % Proportion of CD56+CD16+ cells, %	17,23±1,9	34,95±3,8	40,11±4,4	51,47±5,7

 

Результаты анализа экспрессии ранних маркеров активации (CD38, CD69, CD25), проводимого на 4-е сутки после активации HEK, показали увеличение экспрессии данных рецепторов на поверхности CD56⁺ клеток, что указывало на воздействие опухолевой линии именно на CD56⁺ популяцию NK- и NKT-клеток (табл. 5). По показателям цитотоксического теста проявление эффекторной функции данной культуры по отношению к линии T47D-HER2+ было выше цитотоксичности культуры, однократно активированной МАТ (рис. 3). Результаты цитотоксических тестов, проводимых на других культурах-мишенях, оказались незначительно ниже относительно контрольной группы.

 

Рисунок 3. Цитотоксичность лимфоцитов, активированных клеточной линией HEK 293T в начале культивирования, p < 0,05

Figure 3. Cytotoxicity of lymphocytes after stimulation with HEK 293T cells at the beginning of cultivation, p < 0.05

 

Таблица 5. Экспрессия ранних маркеров активации при стимуляции клеточной линией HEK 293T, проводимой в начале культивирования, p < 0,05

Table 5. Early activation markers expression after stimulation with HEK 293T cells at the beginning of cultivation, p < 0.05

	Активация МАТ однократно в начале культивирования Activation with mAbs at the beginning of cultivation	Активация культурой HEK 293T однократно в  начале культивирования Activation with HEK 293T cells at the biginning of cultivation
Доля CD38+ клеток, % Proportion of CD38+ cells, %	83,21±8,4	58,33±6,1
Доля CD56+CD38+ клеток, % Proportion of CD56+CD38+ cells, %	17,12±1,9	36,69±3,8
Доля CD69+ клеток, % Proportion of CD69+ cells, %	86,39±8,6	27,1±2,8
Доля CD56+CD69+ клеток, % Proportion of CD56+CD69+ cells, %	17,3±1,8	22,1±2,2
Доля CD25+ клеток, % Proportion of CD25+ cells, %	64,57±6,6	24,88±2,6
Доля CD56+CD25+ клеток, % Proportion of CD56+CD25+ cells, %	6,07±0,8	23,69±2,6

 

Обсуждение

Каждый из предложенных режимов активации первичной культуры лимфоцитов имеет свои достоинства и недостатки. Так активация с помощью МАТ и последующая дополнительная стимуляция HEK 293T на 8-й день культивирования приводила к повышению эффекторных функций и экспрессии на поверхности лимфоцитов NK-маркеров активации. Однако в динамике культивирования постепенно наблюдалось нивелирование положительных эффектов соинкубации с клеточной линией. Вероятно, снижение экспрессии маркеров активации происходило ввиду длительного отсутствия прямого контакта NK- и NKT-клеток с клетками-мишенями. Одним из вариантов устранения данного эффекта является сокращение срока культивирования первичной культуры лимфоцитов, продолжительность которого в данной серии экспериментов была выбрана исходя из многочисленных протоколов для экспансии лимфоцитов, активированных МАТ.

Другими подходами к сохранению активационного профиля культивируемых лимфоцитов, продемонстрированных в данной работе, является активация клеточной культурой на более поздние сроки культивирования или повторная соинкубация с клетками HEK 293T. При стимуляции деления лимфоцитов на 15-й день к концу срока культивирования положительный эффект от взаимодействия с HEK 293T сохранялся, но наблюдалось снижение эффекторных функций. Относительно способа активации на 8-й день культивирования, при данном подходе выраженность экспрессии активационных маркеров через неделю после сонкубации с HEK 293T была ниже. Предположительно, двухнедельная зрелая культура лимфоцитов имеет весьма ограниченный потенциал деления, поэтому стимуляция пролиферации на 15-й день культивирования не приводила к выраженной экспансии NK-клеток и экспрессии активационных поверхностных маркеров.

Схожие результаты наблюдались и при двукратной активации фидерами первичной культуры лимфоцитов, однако в данном случае отмечалась самая высокая экспрессия ряда маркеров. Вероятно, повторный контакт с клетками-мишенями вызывал активацию и пролиферацию HEK 293T-специфичных NKT- и NK-клеток памяти, субпопуляция которых, по-видимому, образовалась после первого контакта с фидерами [7]. При повторной активации лимфоцитов наблюдалось существенное увеличение CD56⁺ клеток, экспрессирующих CD4⁺ корецептор, что, возможно, косвенно указывает на наличие в культуре лимфоцитов NKT-клеток памяти, экспрессирующих данную корецепторную молекулу [30].

Наиболее предпочтительным для обогащения популяции NK- и NKT-клеток являлся режим однократной активации клеточной линией HEK 293T без использования МАТ. Так на 4-е сутки после активации доля CD56⁺ лимфоцитов составляла около 60%. Низкая пролиферация первичной культуры лимфоцитов относительно клеток, активированных МАТ (данные не представлены), связана, вероятно, с ограниченным потенциалом клеточного деления у NK-клеток, а также отсутствием стимуляции клеточного деления Т-лимфоцитов, и, как следствие, более низкой, относительно активации МАТ, секреции провоспалительных цитокинов делящимися клетками. Поскольку средняя продолжительность жизни NK-клеток составляет 2 недели [15], культивирование первичной культуры лимфоцитов при данном режиме активации составляла не более 14 дней. В качестве улучшения эффективности метода предлагается дальнейшее сокращение срока культивирования. Хотя данный подход к экспансии NK- и NKT-клеток приводит к незначительному абсолютному возрастанию количества данных клеток, и, возможно, имеет ограниченное применение при создании БМКП, он представляет собой необходимый задел для дальнейшего повышения эффективности протоколов по экспансии NK- и NKT-клеток in vitro.

Итак, влияние линии HEK 293T на первичную культуру лимфоцитов имеет свои характерные черты. Это выраженное возрастание доли NK- и NKT-клеток при отсутствии увеличения общего количества лимфоцитов, и снижение цитотоксичности культивируемых лимфоцитов относительно контроля. Предполагается, что стимуляция деления NK- и NKT-клеток связана с прямым межклеточным взаимодействием с опухолевыми клетками, а также посредством цитокинов, продуцируемых Т-хелперами: при некоторых режимах культивирования наблюдалось существенное возрастание доли этих клеток, а они, как известно, способны стимулировать экспансию NK-клеток [3]. Данное явление подтверждается исследованиями о том, что T-клеточный антиген SV40, который экспрессируют клетки HEK 293T, стимулирует Т-хелперы [14].

Отсутствие повышения цитотоксичности лимфоцитов относительно контроля в ответ на стимуляцию фидерными клетками может быть объяснено специфическим выбором группы сравнения: активация МАТ приводит к выраженной пролиферации CD3⁺CD8⁺ лимфоцитов, которые сами по себе обладают высокой цитотоксической активностью. Тем не менее, выбор в качестве контроля именно такого способа активации, по нашему мнению, вполне оправдан, поскольку позволяет соотносить экспериментальные результаты с актуальным и наиболее распространенным протоколом для экспансии клеток в рамках создания CAR-лимфоцитов. Также снижение цитотоксичности анализируемых лимфоцитов, вероятно, коррелирует с прямым угнетающим воздействием линии HEK 293T. T-клеточный антиген SV40 способен ингибировать продукцию IFNγ [24], инактивировать белок p53 [32], а также вызывать истощение Т-лимфоцитов [27]. Тем не менее преимущество использования клеточной линии HEK 293T для стимуляции лимфоцитов заключается в простоте проведения генетических манипуляций с данной культурой [17]. Например, экспрессия опухоль-ассоциированных антигенов, связанных с мембраной цитокинов и/или иных активирующих молекул, сможет улучшить антигенное распознавание, выживаемость, пролиферацию и цитотоксичность иммунных клеток [11]. Для более полной оценки потенциала культуры HEK 293T в качестве фидерных клеток также необходим сравнительный анализ данной клеточной линии с более «традиционными» стимуляторами деления NK-клеток: K562, Jurkat, EBV-TM-LCL [2].

Таким образом, роль фидерных клеток при создании эффективного БМКП на основе NK- или NKT-клеток многогранна и на сегодняшний день является малоизученной. При использовании аутологичных фидерных клеток активация и обогащение NK-клеток происходит вследствие секреции цитокинов, а при соинкубации с опухолевыми линиями — не только за счет продукции провоспалительных агентов, но и путем прямого межклеточного контакта эффекторов и мишеней, что является наиболее приближенной моделью к взаимодействию данных клеток в условиях in vivo. Кроме того, использование опухолевых клеточных культур позволит получить активированную популяцию иммунных клеток в относительно короткий срок, что является важным обстоятельством при создании БМКП [21]. Обогащение популяции NK-клеток с помощью опухолевых клеток может использоваться совместно с добавлением в питательную среду интерлейкинов, МАТ к рецепторам NK-клеток или клеточных митогенов, способствуя повышению эффективности экспансии и генетических модификаций, и, как следствие, усовершенствованию процесса производства CAR NK- и CAR NKT-клеток [10].

Благодарности

Коллектив авторов выражает благодарность лаборатории Клеточного иммунитета НИИ ЭДиТО НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина за участие в экспериментальной части работы.

About the authors

Polina O. Fedorova

Sechenov First Moscow State Medical University; I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera; Research Institute of Experimental Therapy and Diagnostics of Tumor, N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Author for correspondence.
Email: ppolite@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7478-8783

Assistant Professor, Department of Microbiology, Virology and Immunology, Junior Researcher, Laboratory of Applied Virology, Research Laboratory Assistant, Laboratory of Cellular Immunity

Russian Federation, Moscow; Moscow; Moscow

I. O. Chikileva

Research Institute of Experimental Therapy and Diagnostics of Tumor, N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Email: irinatchikileva@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0769-1695
SPIN-code: 3649-7321

PhD (Biology), Senior Researcher, Laboratory of Cellular Immunity

Russian Federation, Moscow

M. V. Kiselevskiy

Research Institute of Experimental Therapy and Diagnostics of Tumor, N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Email: kisele@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0002-0132-167X
SPIN-code: 8687-2387

DSc (Medicine), Professor, Head of the Laboratory of Cellular Immunity

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files