ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ HEK 293T В КАЧЕСТВЕ АКТИВАТОРА ПРОЛИФЕРАЦИИ НК-КЛЕТОК В КОНТЕКСТЕ РАЗРАБОТКИ CAR-НК-ТЕРАПИИ



Цитировать

Полный текст

Аннотация

Резюме

На сегодняшний день для лечения онкологических заболеваний активно разрабатываются клеточные продукты на основе лимфоцитов, экспрессирующих химерный рецептор антигена (CAR). Так как для инфузии пациенту требуется большое количество CAR-лимфоцитов, при их получении обязательно проводится этап обогащения данных иммунных клеток. Наиболее часто в методиках для эффективной экспансии НК-клеток применяют аллогенные фидерные клетки, при контакте с которыми иммунные клетки вступают в пролиферацию. Наиболее часто в исследовательских целях различных направлений используется клеточная линия почек эмбриона человека, содержащая Т-антиген SV40 (HEK 293T), поскольку она с легкостью поддается генетическим модификациям. Высокая эффективность проводимой трансдукции указывает на потенциальную возможность модификации клеток HEK 293T с целью экспрессии опухолевых антигенов или провоспалительных цитокинов, что может быть использовано для активации и обогащения НК-клеток. В данной работе проводилась оценка воздействия немодифицированной культуры клеток HEK 293T на цитотоксичность и экспрессию активационных маркеров НК- и НКТ-клеток в режиме длительного культивирования в присутствии необлученных аутологичных фидерных клеток.  В исследовании использовали мононуклеарные клетки периферической крови здоровых доноров-добровольцев. Стимуляцию пролиферации проводили с помощью антител к CD3 и CD28-рецепторам или обработанной митомицином С культуры клеток HEK 293T. Пролиферацию клеток оценивали путем прямого подсчета их количества в присутствии красителя трипанового синего.  Цитотоксичность определяли на культурах-мишенях HG3, T47D-HER2+, K562. Для анализа экспрессии поверхностных рецепторов проводили проточную цитометрию с помощью меченых моноклональных антител. Было предложено четыре различных способа активации лимфоцитов с помощью HEK 293T. Мы обнаружили, что при использовании клеточной линии HEK 293T при всех режимах активации наблюдалось увеличение доли CD3-CD56+клеток в популяции, а также повышенная экспрессия активационных маркеров НК-клеток – NKp30 и NKG2D, кроме того, возрастала доля CD16+ и CD3+CD4+лимфоцитов клеток относительно активации только моноклональными антителами. Из предложенных вариантов соинкубации лимфоцитов с фидерными клетками HEK 293T наиболее эффективное обогащение НК-клеток было описано для протокола, предусматривающего использование клеточной линии HEK 293T однократно перед началом инкубации без дополнительной стимуляции пролиферации с помощью моноклональных антител. Такой вариант приводил к увеличению доли CD56+лимфоцитов до 60% уже на 4-й день культивирования. Таким образом, клетки линии HEK 293T стимулируют деление НК-клеток, следовательно, могут быть использованы в качестве фидерных клеток при разработке CAR-НК-клеточного продукта. Поскольку HEK 293T легко поддается генетическим модификациям, то в дальнейшем возможно создание модифицированной культуры HEK 293T, способной обогащать популяцию НК-клеток с большей эффективностью.

Об авторах

Полина Олеговна Фёдорова

ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет);
ФГБНУ НИИВС им. И. И. Мечникова;
Научно-исследовательский институт экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБУ «Научный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России

Email: ppolite@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7478-8783
Scopus Author ID: 57222573207

ассистент кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии1;  младший научный сотрудник лаборатории прикладной вирусологии2; лаборант-исследователь лаборатории клеточного иммунитета3. Ученая степень, ученое звание: отсутствует.

1ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет);

2ФГБНУ НИИВС им. И. И. Мечникова;

3Научно-исследовательский институт экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБУ «Научный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России;

Россия, Российская Федерация, 119991, г. Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2; Российская Федерация, 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., 5А; Российская Федерация, 115522, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24

Ирина Олеговна Чикилева

Научно-исследовательский институт экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБУ «Научный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России

Email: irinatchikileva@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0769-1695
SPIN-код: 3649-7321

к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории Клеточного иммунитета3

3Научно-исследовательский институт экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБУ «Научный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России

Россия, Российская Федерация, 115522, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24.

Михаил Валентинович Киселевский

Научно-исследовательский институт экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБУ «Научный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: kisele@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0002-0132-167X
SPIN-код: 8687-2387

д.м.н., профессор, зав. лабораторией клеточного иммунитета НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей, профессор Научно-образовательного центра биомедицинской инженерии

Россия, Москва; Москва

Список литературы

  1. Mazinani, M., Rahbarizadeh, F. New cell sources for CAR-based immunotherapy. Biomark Res. 2023; 11, 49. - https://doi.org/10.1186/s40364-023-00482-9
  2. Chohan KL, Siegler EL, Kenderian SS. CAR-T Cell Therapy: the Efficacy and Toxicity Balance. Curr Hematol Malig Rep. 2023 Apr;18(2):9-18. - https://doi.org/10.1007/s11899-023-00687-7
  3. Choi G, Shin G, Bae S. Price and prejudice? the value of chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy. Int J Environ Res Public Health. 2022;19(19):12366. - https://doi.org/10.3390/ijerph191912366
  4. Shah N, Li L, McCarty J, Kaur I, Yvon E, Shaim H, et al. Phase I study of cord blood-derived natural killer cells combined with autologous stem cell transplantation in multiple myeloma. Br J Haematol. 2017;177(3):457–66. - https://doi.org/10.1111/bjh.14570
  5. Exley MA, Lynch L, Varghese B, Nowak M, Alatrakchi N, Balk SP. Developing understanding of the roles of CD1d-restricted T cell subsets in cancer: reversing tumor-induced defects. Clin Immunol. 2011;140(2):184–95. - https://doi.org/10.1016/j.clim.2011.04.017
  6. Lu H, Zhao X, Li Z, Hu Y, Wang H. From CAR-T cells to CAR-NK cells: a developing immunotherapy method for hematological malignancies. Front Oncol. 2021;11:720501. - https://doi.org/10.3389/fonc.2021.720501
  7. Gong, Y., Klein Wolterink, R.G.J., Wang, J. et al. Chimeric antigen receptor natural killer (CAR-NK) cell design and engineering for cancer therapy. J Hematol Oncol 14, 73 (2021).
  8. - https://doi.org/10.1186/s13045-021-01083-5
  9. Schmid H, Schneidawind C, Jahnke S, Kettemann F, Secker K-A, Duerr-Stoerzer S, Keppeler H, Kanz L, Savage PB and Schneidawind D (2018) Culture-Expanded Human Invariant Natural Killer T Cells Suppress T-Cell Alloreactivity and Eradicate Leukemia. Front. Immunol. 9:1817.
  10. - https://doi.org/10.3389/fimmu.2018.01817
  11. Pampusch MS, Haran KP, Hart GT, Rakasz EG, Rendahl AK, Berger EA, Connick E, Skinner PJ. Rapid Transduction and Expansion of Transduced T Cells with Maintenance of Central Memory Populations. Mol Ther Methods Clin Dev. 2019 Sep 30;16:1-10. - https://doi.org/10.1016/j.omtm.2019.09.007
  12. Liu Y, Liu Z, Yang Y, Cui J, Sun J, Liu Y. The prognostic and biology of tumour-infiltrating lymphocytes in the immunotherapy of cancer. Br J Cancer. 2023 Oct;129(7):1041-1049. - https://doi.org/10.1038/s41416-023-02321-y
  13. Rölle A, Pollmann J, Ewen E, Le VTK, Halenius A, Hengel H, et al. IL-12- producing monocytes and HLA-E control HCMV-driven NKG2C+ NK cell expansion. J Clin Invest (2014) 124:5305–16. - https://doi.org/10.1172/JCI77440
  14. Phan MT, Kim J, Koh SK, Lim Y, Yu H, Lee M et al. Selective Expansion of NKG2C+ Adaptive NK Cells Using K562 Cells Expressing HLA-E. Int J Mol Sci. 2022 Aug 20;23(16):9426. - https://doi.org/10.3390/ijms23169426
  15. Гельм Ю.В., Пасова И.А., Гривцова Л.Ю., Константинова Т.В., Михайловский Н.В., Рыбачук В.А., Абакушина Е.В., Иванов С.А., Каприн А.Д. Опыт культивирования NK-клеток человека с фидерными клетками in vitro. Медицинская иммунология. 2022;24(3):481-490.
  16. Gelm Yu.V., Pasova I.A., Grivtsova L.Yu., Konstantinova T.V., Mikhaylovsky N.V., Rybachuk V.A., Abakushina E.V., Ivanov S.A., Kaprin A.D. In vitro experience of human natural killer cell culture with feeder cells. Medical Immunology (Russia). 2022;24(3):481-490. (In Russ.) https://doi.org/10.15789/1563-0625-IVE-2481
  17. Ojo EO, Sharma AA, Liu R, Moreton S, Checkley-Luttge MA, Gupta K et al. Membrane bound IL-21 based NK cell feeder cells drive robust expansion and metabolic activation of NK cells. Sci Rep. 2019 Oct 17;9(1):14916. - https://doi.org/10.1038/s41598-019-51287-6
  18. Gómez García LM, Escudero A, Mestre C, Fuster Soler JL, Martínez AP, Vagace Valero JM et al. Phase 2 Clinical Trial of Infusing Haploidentical K562-mb15-41BBL-Activated and Expanded Natural Killer Cells as Consolidation Therapy for Pediatric Acute Myeloblastic Leukemia. Clin Lymphoma Myeloma Leuk. 2021 May;21(5):328-337. - https://doi.org/10.1016/j.clml.2021.01.013
  19. Muñoz Builes M, Vela Cuenca M, Fuster Soler JL, Astigarraga I, Pascual Martínez A, Vagace Valero JM et al. Study protocol for a phase II, multicentre, prospective, non-randomised clinical trial to assess the safety and efficacy of infusing allogeneic activated and expanded natural killer cells as consolidation therapy for paediatric acute myeloblastic leukaemia. BMJ Open. 2020 Jan 8;10(1):e029642. - https://doi.org/10.1136/bmjopen-2019-029642
  20. Wang C, Li N, Li Y, Hou S, Zhang W, Meng Z, Wang S, Jia Q, Tan J, Wang R, Zhang R. Engineering a HEK-293T exosome-based delivery platform for efficient tumor-targeting chemotherapy/internal irradiation combination therapy. J Nanobiotechnology. 2022 May 31;20(1):247. - https://doi.org/10.1186/s12951-022-01462-1
  21. Scarrott JM, Johari YB, Pohle TH, Liu P, Mayer A, James DC. Increased recombinant adeno-associated virus production by HEK293 cells using small molecule chemical additives. Biotechnol J. 2023 Mar;18(3):e2200450. - https://doi.org/10.1002/biot.202200450
  22. He X, He Q, Yu W, Huang J, Yang M, Chen W, Han W. Optimized protocol for high-titer lentivirus production and transduction of primary fibroblasts. J Basic Microbiol. 2021 May;61(5):430-442. - https://doi.org/10.1002/jobm.202100008
  23. Gao Y, Bergman I. Anti-tumor memory CD4 and CD8 T-cells quantified by bulk T-cell receptor (TCR) clonal analysis. Front Immunol. 2023 Mar 23;14:1137054. - https://doi.org/10.3389/fimmu.2023.1137054
  24. Tian G, Barragán GA, Yu H, Martinez-Amador C, Adaikkalavan A, Rios X, Guo L, Drabek JM, Pardias O, Xu X, Montalbano A, Zhang C, Li Y, Courtney AN, Di Pierro EJ, Metelitsa LS. PRDM1 is a key regulator of the natural killer T-cell central memory program and effector function. Cancer Immunol Res. 2025 Jan 16. - https://doi.org/10.1158/2326-6066.CIR-24-0259
  25. Lowry LE, Zehring WA. Potentiation of Natural Killer Cells for Cancer Immunotherapy: A Review of Literature. Front Immunol. 2017 Sep 1;8:1061. - https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.01061
  26. Bihl F, Germain C, Luci C, Braud VM. Mechanisms of NK cell activation: CD4(+) T cells enter the scene. Cell Mol Life Sci. 2011 Nov;68(21):3457-67. - https://doi.org/10.1007/s00018-011-0796-1
  27. Lowe DB, Shearer MH, Jumper CA, Bright RK, Kennedy RC. Tumor immunity against a simian virus 40 oncoprotein requires CD8+ T lymphocytes in the effector immune phase. J Virol. 2010 Jan;84(2):883-93. - https://doi.org/10.1128/JVI.01512-09
  28. Reus JB, Trivino-Soto GS, Wu LI, Kokott K, Lim ES. SV40 Large T Antigen Is Not Responsible for the Loss of STING in 293T Cells but Can Inhibit cGAS-STING Interferon Induction. Viruses. 2020 Jan 24;12(2):137. - https://doi.org/10.3390/v12020137
  29. Wasylishen AR, Lozano G. Attenuating the p53 Pathway in Human Cancers: Many Means to the Same End. Cold Spring Harb Perspect Med. 2016 Aug 1;6(8):a026211. - https://doi.org/10.1101/cshperspect.a026211
  30. Schietinger A, Philip M, Krisnawan VE, Chiu EY, Delrow JJ, Basom RS, Lauer P, Brockstedt DG, Knoblaugh SE, Hämmerling GJ, Schell TD, Garbi N, Greenberg PD. Tumor-Specific T Cell Dysfunction Is a Dynamic Antigen-Driven Differentiation Program Initiated Early during Tumorigenesis. Immunity. 2016 Aug -16;45(2):389-401. - https://doi.org/10.1016/j.immuni.2016.07.011
  31. Malm, M., Saghaleyni, R., Lundqvist, M. et al. Evolution from adherent to suspension: systems biology of HEK293 cell line development. Sci Rep. 2020; 10, 18996. - https://doi.org/10.1038/s41598-020-76137-8
  32. Hasan AN, Selvakumar A, Shabrova E, Liu XR, Afridi F, Heller G, Riviere I, Sadelain M, Dupont B, O'Reilly RJ. Soluble and membrane-bound interleukin (IL)-15 Rα/IL-15 complexes mediate proliferation of high-avidity central memory CD8+ T cells for adoptive immunotherapy of cancer and infections. Clin Exp Immunol. 2016 Nov;186(2):249-265. - https://doi.org/ doi: 10.1111/cei.12816
  33. Bae DS, Lee JK. Development of NK cell expansion methods using feeder cells from human myelogenous leukemia cell line. Blood Res. 2014 Sep;49(3):154-61. - https://doi.org/10.5045/br.2014.49.3.154
  34. Palen K, Zurko J, Johnson BD, Hari P, Shah NN. Manufacturing chimeric antigen receptor T cells from cryopreserved peripheral blood cells: time for a collect-and-freeze model? Cytotherapy. 2021 Nov;23(11):985-990. - https://doi.org/10.1016/j.jcyt.2021.07.015
  35. Gurney M, Kundu S, Pandey S, O'Dwyer M. Feeder Cells at the Interface of Natural Killer Cell Activation, Expansion and Gene Editing. Front Immunol. 2022 Feb 11;13:802906. - https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.802906

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Фёдорова П.О., Чикилева И.О., Киселевский М.В.,

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 64788 от 02.02.2016.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах