Acinetobacter baumannii при инфекциях кровотока и центральной нервной системы у детей в отделениях реанимации и интенсивной терапии: молекулярно-генетическая характеристика и клиническая значимость

Полный текст

Введение

Acinetobacter baumannii вызывает различные госпитальные инфекции во всем мире. Представители рода Acinetobacter признаны одними из наиболее приоритетных нозокомиальных возбудителей, вызывающих инфекции с высокими показателями смертности и экономическими затратами на лечение [40, 47].

Внутрибольничные инфекции, ассоциированные с A. baumannii, стали актуальной проблемой для здравоохранения во многих странах. Этот патоген способен вызывать различные инфекции, такие как бактериемия, эндокардит, пневмония, менингит, раневые инфекции и инфекции мочевыводящего тракта [4, 35, 55]. Особенно настораживает тот факт, что в последние годы продолжает увеличиваться частота инфицирования кровотока грамотрицательными неферментирующими бактериями, в том числе множественно-резистентными изолятами A. baumannii [58].

A. baumannii является проблемным патогеном за счет широкого арсенала механизмов лекарственной устойчивости и высокой способности к ее приобретению [10, 22, 28, 33, 36, 39, 42].

Эти механизмы включают ферментативное разрушение антибиотиков, изменение проницаемости бактериальной клетки, активное выведение антибиотика и модификацию целевых участков [8, 28, 36, 43, 44]. Различают изоляты A. baumannii с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ; резистентность как минимум к трем классам противомикробных препаратов), с широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ; устойчивость к пяти классам противомикробных препаратов, включая карбапенемы) [17], в настоящее время в стационарах часто выделяют изоляты, резистентные к полимиксинам, что значительно затрудняет лечение [22, 34, 39, 41, 49].

Способность этого возбудителя сохраняться в различных условиях, в том числе при высушивании, приводит к сохранению его жизнеспособности во внутрибольничной среде до нескольких месяцев [15]. Образование биопленок на биотических и абиотических поверхностях также сохраняет жизнеспособность этого патогена [27]. Для нозокомиальных инфекций способность к образованию биопленок играет особую роль, поскольку это позволяет им колонизировать различные рабочие поверхности, медицинские устройства и аппаратуру [3, 21].

A. baumannii обладает регуляторной системой, включающей белок наружной мембраны (ompA), пили (csu), белки, ассоциированные с биопленкой (bap), каталазу (katE) [38]. Эта система поддерживает и регулирует проявление вирулентности, а именно: чувство кворума, образование биопленки, подвижность, адгезию и продукцию каталазы. Факторы вирулентности играют значительную роль при терапии A. baumannii, потому как наличие биопленки может затруднять проникновение антибиотиков к микробной клетке, вследствие чего, происходит увеличение минимальных ингибирующих концентраций антибактериальных препаратов [13]. Продукция каталазы микробной клеткой способствует разрушению активных форм кислорода, которые вырабатываются нейтрофилами хозяина при инфицировании, что вносит существенный вклад в патогенез инфекции [50]. Вирулентные свойства помогают патогену сохраняться в организме хозяина, скрываться от его иммунной системы и проявлять свою патогенность [7, 14].

Сложная таксономия бактерий рода Acinetobacter связана с высоким потенциалом генетической изменчивости [13]. В настоящее время существует более 2800 вариантов последовательностей MLST (ST), внесенных в базу данных MLST A. baumannii (https://pubmlst.org/organisms/acinetobacter-baumannii). Недавний анализ показал наличие шести основных крупных международных клональных линий, распространенных на всех континентах [26]. Эти международные клональные линии включают три основных первоначальных эпидемических клона и отражают появление новых клонов эпидемического риска [12].

A. baumannii, обладающий МЛУ и ШЛУ, а также рядом патогенных свойств, способен вызывать тяжелые инфекционные осложнения у пациентов в отделениях реанимации и интенсивной терапии, нередко приводя к неблагоприятным исходам [11].

Целью нашего исследования было изучение резистентности, патогенности и клонального разнообразия A. baumannii при инфекциях кровотока и ЦНС у детей.

Материалы и методы

Бактериальные культуры. В период с 2014 по 2021 г. были отобраны 17 изолятов A. baumannii из положительных гемокультур и проб ликвора. Изоляты были выделены от пациентов из двух московских детских больниц: ФГАУ «НМИЦ здоровья детей» Минздрава России (С1), НИИ неотложной детской хирургии и травматологии Департамента здравоохранения г. Москвы (С2).

Образцы крови инкубировали в анализаторе гемокультур BACTEC 9050 (Becton Dickinson, США), BacT/ALERT (bioMerieux, Франция) до фиксации роста микроорганизмов, затем пробу отсевали на плотные питательные среды для выделения чистой культуры возбудителя. Посевы производили на питательные среды: кровяной агар и Uri-select агар (BioRad, США), затем инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 24–48 ч. Идентификацию возбудителя проводили методом масс-спектрометрии MALDI-ToF (Bruker Daltonics, Германия).

Чувствительность к антибактериальным препаратам. Для определения чувствительности к антибиотикам использовали: меропенем, имипенем, колистин, тобрамицин, амикацин, гентамицин, триметоприм/сульфаметоксазол,ципрофлоксацин, левофлоксацин. МПК антибиотиков определяли методом серийных микроразведений в бульоне Мюллера–Хинтон (bioMerieux, Франция), Sensititre™ (ThermoScientific, Великобритания). В качестве контроля использовали штамм A. baumannii АТСС 19606.

Минимальные подавляющие концентрации (МПК) к меропенему определяли методом микроразведений в соответствии со стандартом (ГОСТ Р ИСО 20776-1-2010).

Результаты интерпретировали в соответствии с критериями Европейского комитета по тестированию чувствительности к антибиотикам (EUCAST) версия 10.0. (EUCAST: European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, version 10.0., 2020, pp. 10–20).

Выделение ДНК и определение генов карбапенемаз. Для выделения ДНК использовали суточную культуру. Бактериальную ДНК выделяли согласно инструкции производителя с использованием коммерческих наборов «ГК-экспресс» (ЦНИИЭ Роспотребнадзора). Полученные образцы хранили до использования при температуре –20°С.

Выявление генов, отвечающих за продукцию карбапенемаз, проводили с использованием наборов с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс MDR Ab-OXA-FL» (OXA-23, OXA-40, OXA-58, ОХА-51), «АмплиСенс MDR MBL-FL» (IMP, NDM, VIM), производства ЦНИИЭ Роспотребнадзора. Проведение ПЦР осуществляли согласно инструкции производителя. ПЦР проводили с помощью амплификатора LightCycler 96 (Roche). Результаты оценивали по наличию или отсутствию пересечения графика флуоресценции с пороговой линией, отражающей экспоненциальный подъем сигнала. При значении Ct ≤ 32 результат оценивали как положительный.

Биопленкообразование. Анализ формирования биопленок на абиотической поверхности проводили с использованием сердечно-мозгового бульона (BHB; Becton Dickinson, США) по ранее описанной методике с модификациями [20].

Биопленки выращивали в 96-ти луночных полистироловых планшетах с плоским дном. Все изоляты тестировали в трех повторах. Для исследования использовались суточные бактериальные культуры. Аликвоту 20 мкл бактериальной суспензии с мутностью 0,8 по МакФарланду вносили в лунки, содержащие 180 мкл BHB. Инкубировали в течение 24 ч при температуре 37°С без перемешивания. После инкубации бульон и планктонные клетки тщательно отбирали, лунки промывали дистиллированной водой. Для фиксации биопленок добавляли 200 мкл 2,5% глутарового альдегида и инкубировали 5 мин при комнатной температуре. После удаления альдегида лунки трижды промывали дистиллированной водой. Для окрашивания вносили 200 мкл кристаллического фиолетового (0,1% спиртовой раствор), инкубировали в течение 10 мин. После удаления красителя лунки трижды промывали дистиллированной водой. Для растворения и обесцвечивания связанного красителя добавляли 200 мкл 95% этанола с последующей инкубацией в течение 30 мин. Оптическую плотность итогового раствора измеряли при длине волны 590 нм с использованием планшетного считывателя Infinite 200M (Tecan, Австрия). Результаты интерпретировали согласно рекомендациям [51].

Чувствительность биопленочных культур к меропенему определяли на суточных биопленках. После тщательного отбора бульона и планктонных форм в лунки добавляли растворы антибиотика с концентрацией от 0,5 до 512 мг/л (аналогично определению МПК меропенема для планктонных форм) и инкубировали в течение 24 ч при температуре 37°С без перемешивания. Учет результатов проводили по полному отсутствию роста микроорганизма в лунке.

Гены вирулентности. Гены bfmR, csuA/B, ompA, bap, katE, отвечающие за чувство кворума и процесс образования биопленок, определяли методом ПЦР с детекцией в 2% агарозном геле. Праймеры и температуры отжига представлены в табл. 1.

 

Таблица 1. Праймеры для определения генов, отвечающих за продукцию биопленки

Table 1. Primer sequences for determining the genes responsible for biofilm production

Ген Gene	Последовательность 5′→3′ Primer sequence (5′→3′)		Продукт Size (bp)	Температура отжига (°С) Annealing temperature (°С)	Источник References
bfmR	Bfm-f	CTGGTAGGTAATCAGTTCG	200	62	[53]
	Bfm-r	GAGAGACCCAAACCATAACC
csuA/B	Csu-f	ATGCGGTAAATACTCAAGCA	204	57	[53]
	Csu-r	TCACAGAAATATTGCCACCT
ompA	Omp-f	CTCTTGCTGGCTTAAACGTA	192	57	[53]
	Omp-r	GCAATTTCTGGGCTTGTATTG
katE	Kat-f	GTGTCCGGTTCAGGTTTTAC	230	60	[53]
	Kat-r	GGATTCTTGACAGACCCAAC
bap	Bap-f	ATGCCTGAGATACAAATTATTGCCAAGGATAATC	561	54	[27]
	Bap-r	AGGTGCTGAAGAATCATCATTAC

 

Условия и объемы реакции

Для генов bfmR, csuA/B, ompA, katE: компоненты ПЦР смеси — iTaq Universal Probes Supermix, BioRad — 5 мкл; по 1 мкл каждого праймера (F и R); деионизированная вода — 1 мкл; проба ДНК — 2 мкл.

Условия ПЦР реакции:

• Начальная денатурация — 95°C — 5′;
• Денатурация 94°C — 60″;
• Отжиг праймеров от 57 до 62°C (см. табл. 1) — 60″;
• Элонгация 72°C — 60″;
• Количество температурных циклов — 35;
• Заключительный этап элонгации 72°C — 5′.

Для гена bap: компоненты ПЦР смеси — iQ Supermix, BioRad — 5 мкл; по 1 мкл каждого праймера (F и R); деионизированная вода — 1 мкл; проба ДНК — 2 мкл.

Условия ПЦР реакции:

• Начальная денатурация — 95°C — 5′;
• Денатурация 95°C — 30″;
• Отжиг праймеров 54°C — 30″;
• Элонгация 72°C — 45″;
• Количество температурных циклов — 35;
• Заключительный этап элонгации 72°C — 10′.

ПЦР выполняли с использованием амплификатора LightCycler 96 (Roche, Швейцария); 5 мкл всех продуктов ПЦР подвергали электрофорезу в 1,5% агарозном геле в буфере TBE при 120 В и визуализировали в УФ-свете путем окрашивания бромидом этидия.

Мультилокусное секвенс-типирование (МЛСТ). Для сиквенс-типирования изолятов A. baumannii использовали метод МЛСТ. Подготовка включала амплификацию участков семи генов домашнего хозяйства: gltA, gyrB, gdhB, recA, cpn60, gpi, rpoD. Были использованы праймеры из общепринятой схемы МЛСТ Oxford [6].

Подготовку ампликонов осуществляли с помощью стандартных методик. Секвенирование проводили с использованием наборов реагентов и оборудования фирмы Applied Biosystems (США) в соответствии с рекомендациями производителя. Нуклеотидные последовательности, полученные в результате секвенирования, анализировали с помощью программы SeqMan (DNASTAR Inc.) и затем сравнивали с базой аллелей МЛСТ [https://pubmlst.org/organisms/acinetobacter-baumannii (02.12.2022)]. Генотип определяли по комбинации аллелей.

Оценка клинических данных. Ретроспективно были проанализированы клинические данные пациентов, из крови или ликвора которых был выделен A. baumannii.

Статистические методы. Статистическую обработку данных проводили с помощью программ SPSS 20.0 (SPSS Statistics, США) и Microsoft Excel. Различия считались статистически значимыми при р ≤ 0,05.

Результаты

За исследуемый период было выделено 17 изолятов A. baumannii из положительных проб гемокультур и ликвора. При этом из крови было выделено 14 (82%) изолятов, а из ликвора — 3 (18%).

Результаты определения чувствительности к антимикробным препаратам представлены на рис. 1.

 

Рисунок 1. Чувствительность к антимикробным препаратам изолятов A. baumannii

 

Среди изученных штаммов A. baumannii выявлено довольно широкое распространение антибиотикорезистентности. Только для колистина количество чувствительных изолятов превышает количество резистентных — 76% (13/17).

Для карбапенемов резистентность составила 76% (n = 13). К аминогликозидам резистентность проявили от 71 до 88% изолятов. К фторхинолонам были резистентны 88% (n = 15) штаммов. К бисептолу проявили резистентность чуть более половины изолятов — 59% (n = 10).

В нашем исследовании у штаммов A. baumannii были выявлены гены карбапенемаз OXA-23 и OXA-40. Видоспецифическая карбапенемаза OXA-51 была обнаружена у всех изученных изолятов. Карбапенемаза OXA-58, комбинации карбапенемаз и металло-β-лактамазы IMP, NDM, VIM у исследованных штаммов обнаружены не были. Для оценки частоты выявления карбапенемаз сравнивали два временных периода — с 2014 по 2017 г. и с 2018 по 2021 г. Также продукция карбапенемаз сравнивалась между изолятами, выделенными в двух стационарах.

Карбапенемазы группы OXA-23 были выявлены у 24% (n = 4) штаммов. При этом в период с 2018 по 2021 г. эта группа карбапенемаз выявлялась значимо чаще, чем с 2014 по 2017 г. (р = 0,0294). Значимых различий между двумя стационарами по наличию у изолятов этой группы карбапенемаз выявлено не было. Карбапенемазы группы OXA-40 были выявлены у 41% (n = 7) штаммов. Значимых различий между более ранними и более поздними изученными периодами с 2014 по 2021 г. выявлено не было. В то же время в стационаре С1 эта группа карбапенемаз выявлялась значительно чаще, чем в стационаре С2 (р = 0,02098). У двух изолятов, резистентных к карбапенемам, не было выявлено карбапенемаз.

Изучение продукции биопленок показало, что изоляты A. baumannii проявляли способность к формированию биопленок различной интенсивности: слабые биопленки (59%), умеренные (35%) и сильные (6%).

Для биопленочных культур была определена чувствительность к меропенему. Результаты сравнения МПК меропенема планктонных и биопленочных культур отражены на рис. 2.

 

Рисунок 2. Сравнение МПК меропенема для планктонных и биопленочных культур A. baumannii

Примечание. Для двух изолятов под номерами 15 и 16 МПК меропенема была определена более 512 мг/л; на рисунке эти точки имеют значения 700 мг/л. Ось Х — порядковые номера изолятов. Ось Y — значения МПК меропенема.

 

Статистический анализ показал, что МПК меропенема для биопленочных форм культур значимо выше, чем МПК меропенема для планктонных форм тех же штаммов (р < 0,05). МПК меропенема для планктонных клеток распределялись от 0,5 до 512 мг/л, в то время как эти же микроорганизмы в биопленках имели МПК меропенема in vitro в концентрациях от 128 до 512 мг/л и выше. Было определено, что у изолятов, проявлявших способность к образованию слабых биопленок, МПК меропенема для бактериальных клеток в составе биопленок превышали МПК для планктонных клеток от двух до восьми раз. Для штаммов, способных к образованию умеренных и сильных биопленок превышение подавляющих концентраций достигало 512 раз (0,5 мг/л для планктонных и 256 мг/л для клеток в составе биопленок).

Для всех штаммов было проведено определение генов bfmR, csuA/B, ompA, bap и katE, ответственных за регуляцию биопленкообразования. Результаты представлены в табл. 2.

 

Таблица 2. Наличие генов биопленкообразования у штаммов A. baumannii

Table 2. Presence of biofilm formation genes in A. baumannii strains

Интенсивность биопленки Biofilm intensity	Гены, ассоциированные с образованием биопленок Genes associated with biofilm formation
	bfmR	csuA/B	ompA	bap	katE
Слабая/Weak (n = 10)	10	9	9	10	10
Умеренная/Moderate (n = 6)	6	5	6	6	6
Сильная/Strong (n = 1)	1	1	1	1	1

 

Все изоляты имели гены bfmR, bap и katE. Ген ompA был обнаружен у 94% (n = 16) штаммов, а ген csuA/B — у 88% (n = 15).

Популяционная структура изолятов A. baumannii, выделенных из крови и ликвора у детей, представлена девятью различными сиквенс-типами. Один из них ранее не был представлен в базе данных МЛСТ (рис. 3).

 

Рисунок 3. Генотипическая структура изолятов A. baumannii, выделенных из крови и ликвора у детей

Примечание. Темным цветом обозначены изоляты, резистентные к карбапенемам, светлым — чувствительные. Секторами обозначено количество изолятов в генотипе.

 

Сиквенс-типы ST944^Oxf, ST1550^Oxf и ST1104^Oxf входят в клональную группу СС944^Oxf/СС78Pas международной клональной линии ICL6, а сиквенс-типы ST450^Oxf, ST2063^Oxf и ST1102^Oxf — в клональную группу СС92/СС208^Oxf/CC2Pas, относящуюся к международной клональной линии ICL2.

Генотипы ST944^Oxf, ST1127^Oxf, ST1104^Oxf, ST1550^Oxf, ST450^Oxf, ST2419^Oxf встречались только в С1, генотип ST2063^Oxf — только в С2, а генотипы ST1100^Oxf и ST1102^Oxf выделялись в обоих стационарах с одинаковой частотой.

Продуцентами карбапенемаз группы OXA-40 были все представители ST944^Oxf, ST1104^Oxf, ST1550^Oxf (ICL6), а также карбапенем-резистентный представитель ST450^Oxf. Карбапенемазы группы OXA-23 были выявлены у всех изолятов ST1102^Oxf и ST2063^Oxf (ICL2).

Способностью к образованию сильной биопленки обладал только изолят с новым генотипом ST2419^Oxf. Умеренные биопленки образовывали все изоляты ST450^Oxf, ST1102^Oxf и ST1127^Oxf. Все штаммы ST944^Oxf, ST1100^Oxf, ST1104^Oxf, ST1550^Oxf и ST2063^Oxf обладали слабой способностью к биопленкообразованию.

Гены, отвечающие за образование биопленок, встречались у представителей всех девяти генотипов. В трех случаях у изолятов отсутствовали некоторые из них: csuA/B отсутствовал у изолятов генотипов ST1127^Oxf и ST2063^Oxf, ompA отсутствовал у другого представителя ST2063^Oxf.

Среди изученных 17 штаммов по итогам анализа стоит отметить четыре, которые проявили устойчивость ко всем используемым в тестировании антибиотикам. Сводные данные по этим образцам представлены в табл. 3.

 

Таблица 3. Характеристика изолятов A. baumannii, резистентных ко всем исследованным антимикробным препаратам

Table 3. Characteristics of A. baumannii isolates resistant to all antimicrobial drugs studied

Номер изолята Isolate number	Стационар Hospital	Возраст пациента Patient’s age	Локус Locus	Патология Pathology	МПК меропенема MIC of meropenem	МПК колистина MIC of colistin	Карбапенемазы Carbapenemases	Биопленка Biofilm	ST
56–1520	С1	7 месяцев 7 months	Кровь ЦВК CVC Blood	Хирургическая, АП + сепсис Surgical, AP + sepsis	512	8	OXA-40	L	944
99–738	С2	7 лет 3 месяцев 7 years 3 months	Кровь Blood	Хирургическая, ТСТ Surgical, SCI	64	8	OXA-23	L	2063
99–974	С2	11 лет 8 месяцев 11 years 8 months	Ликвор Liquor	Хирургическая, ТСТ + вентрикуломенингит Surgical, SCI + ventriculomeningitis	256	4	OXA-23	L	2063
99–1128	С2	2 года 8 месяцев 2 years 8 months	Ликвор Liquor	Хирургическая, ТСТ Surgical, SCI	32	4	OXA-23	M	1102

Примечание. АП — абдоминальная патология, ТСТ — тяжелая сочетанная травма, L — слабая биопленка, M — умеренная биопленка, ST — сиквенс-тип.

Note. AP — abdominal pathology, SCI — severe combined injury, L — weak biofilm, M — moderate biofilm, ST — sequenstype

 

По результатам оценки клинических данных изоляты A. baumannii были выделены от детей в возрасте от 5 суток до 17 лет. Медиана возраста — 11 месяцев (5 месяцев; 7 лет 3 месяца). Пациенты были разделены на 4 возрастные группы: I (0–1 год) — 9 детей (53%), II (1–3 лет) — 2 ребенка (12%), III (3–7 лет) — 1 ребенок (6%), IV (7–17 лет) — 5 детей (29%). Характеристика изолятов, выделенных в разных возрастных группах, отображена в табл. 4.

 

Таблица 4. Характеристика изолятов A. baumannii в разных возрастных группах

Table 4. Characteristics of A. baumannii isolates in different age groups

Группы Groups Параметры Parameters		Группа 1:дети до 1 года Group 1:children under 1 year (n = 9)	Группа 2:от 1 до 3 лет Group 2:from 1 to 3 years (n = 2)	Группа 3:от 3 до 7 лет Group 3: from 3 to 7 years (n = 1)	Группа 4:от 7 до 17 лет Group 4: from 7 to 17 years (n = 5)
Карбапенемазы Carbapenemases	OXA-23	–	2	–	2
	OXA-40	5	–	–	2
Интенсивность биопленок Biofilm intensity	Слабая/Weak	5	–	–	5
	Умеренная/Moderate	4	2	–	–
	Сильная/Strong	–	–	1	–
Генотипы (STОxf) Genotypes (STОxf)		450 (n = 3) 944 (n = 2) 1104 (n = 2) 1127 1100	1102 (n = 2)	2419	1100 1104 1550 2063 (n = 2)

 

Изоляты A. baumannii были выделены у детей, которые наблюдались с хирургической патологией (врожденные пороки сердца — 24%, абдоминальная патология — 29%, тяжелая сочетанная травма — 29%) и с соматическими заболеваниями, сопровождающимися антибактериальнойи/или глюкокортикостероидной терапией — 18%.

Из 14 пациентов, от которых была получена положительная гемокультура, диагноз сепсис был у четверых (29%), три случая завершились летально.

В трех случаях положительные высевы A. baumannii были получены из образцов ликвора. При этом у двух пациентов стоял диагноз вентрикуломенингит, в одном случае был зафиксирован летальный исход.

Микробиологическая и клиническая характеристика неблагоприятных исходов отображена в табл. 5.

 

Таблица 5. Характеристика случаев бактериемии и инфекции ЦНС, ассоциированных c A. baumannii, с летальным исходом

Table 5. Characteristics of bacteremia and CNS infection cases associated with A. baumannii, with lethal outcome

Номер изолята Isolate number	Возраст пациента Patient’s age	Локус Locus	Патология Pathology	Фенотип резистентности Resistance phenotype	Карбапенемазы Carbapenemases	Биопленки Biofilms	ST
46-3145	1 месяц 1 month	Кровь ЦВК CVC Blood	Хирургическая, ВПС + сепсис Surgical, CHD + sepsis	CAR, AMI, FQL, STX	OXA-40	L	1104
56-1520	7 месяцев 7 months	Кровь ЦВК CVC Blood	Хирургическая, АП + сепсис Surgical, AP + sepsis	CAR, AMI, FQL, STX, COL	OXA-40	L	944
79-784	17 лет 17 years	Ликвор Liquor	Хирургическая, ТСТ + вентрикуломенингит Surgical, SCI + ventriculomeningitis	CAR, AMI, FQL, STX	–	L	1100
87-190	8 месяцев 8 months	Кровь Blood	Хирургическая, ВПС + сепсис Surgical, CHD + sepsis	CAR, AMI, FQL	OXA-40	М	450

Примечание. ВПС — врожденный порок сердца, АП — абдоминальная патология, ТСТ — тяжелая сочетанная травма, L — слабая биопленка, М — умеренная биопленка, CAR — карбапенемы, AMI — аминогликозиды, FQL — фторхинолоны, STX — триметоприм/сульфаметоксазол, COL — колистин, ST — сиквенс-тип.

Note. CHD — congenital heart disease, AP — abdominal pathology, SCI — severe combined injury, L — weak biofilm, M — moderate biofilm,CAR — carbapenems, AMI — aminoglycosides, FQL — fluoroquinolones, STX — trimethoprim/sulfamethoxazole, COL — colistin, ST — sequence type.

 

В трех эпизодах бактериемии с неблагоприятным исходом, ассоциированной A. baumannii, возраст пациентов был меньше года, сепсис у них развился на фоне хирургической патологии. Выделенные изоляты A. baumannii проявляли резистентность минимум к трем группам препаратов (карбапенемы, аминогликозиды и фторхинолоны) и обладали карбапенемазой группы OXA-40. Один из описанных штаммов проявлял устойчивость ко всем исследованным антимикробным препаратам (в том числе к колистину и бисептолу). В двух случаях микроорганизмы обладали слабой способностью к образованию биопленок, в одном — умеренной. В одном случае A. baumannii определялся в пробе ликвора 17-летнего пациента, у которого вентрикуломенингит развился на фоне хирургической патологии.

Изолят ацинетобактера, выделенный в этом случае, проявлял устойчивость к карбапенемам, аминогликозидам, фторхинолонам и бисептолу, не имел карбапенемаз и обладал слабой способностью к биопленкообразованию. Во всех случаях, закончившихся летально, были определены разные сиквенс-типы A. baumannii: ST1104, ST1100, ST944, ST450.

Обсуждение

Результаты этого исследования отражают серьезную проблему, которую представляют собой инфекции кровотока и ЦНС, вызванные множественно-резистентными изолятами A. baumannii. Более половины исследованных нами штаммов ацинетобактера проявили резистентность к трем и более классов антибиотиков. Около четверти изолятов проявили резистентность ко всем исследованным антибиотикам, в том числе к колистину. Эта тенденция не может не вызывать опасений по поводу дальнейших перспектив в лечении инфекций, вызванных нозокомиальными штаммами A. baumannii. Наши данные по резистентности в отношении большинства групп препаратов совпадают с результатами многоцентрового исследования наших турецких коллег, у которых резистентность к этим же группам препаратов составила более 90%. В то же время резистентность к колистину в данном исследовании значительно ниже, чем в нашем — около 1% [9]. Резистентность к карбапенемным антибиотикам в нашем исследовании сопоставима с данными многоцентрового исследования «МАРАФОН 2015–2016» и составила около 70% [1].

Гены OXA-51 встречаются в природе в геноме A. baumannii, недавно они были обнаружены у других представителей рода Acinetobacter, проявляющих устойчивость к карбапенемам. Обнаружение OXA-51-подобного гена может быть использовано в качестве дополнительной идентификации A. baumannii до вида [29]. У всех исследованных нами изолятов ацинетобактера был обнаружен OXA-51-подобный ген.

По данным зарубежных коллег, у ацинетобактера часто встречаются металло-β-лактамазы [24], однако в нашем исследовании резистентность к карбапенемам была связана с наличием карбапенемаз группы D (OXA-23 подобные и OXA-40 подобные). В отличие от результатов китайских [30] и немецких коллег [48], в нашем исследовании преобладают OXA-40-подобные карбапенемазы (41%), OXA-23-подобных обнаружено только 24%. В то же время наши данные по распространенности карбапенемаз согласуются с результатами, полученными коллегами из Польши [37], Испании [54] и России [1].

Среди множества факторов вирулентности способность к образованию биопленок — одна из основных, определяющих патогенность A. baumannii [32]. Все изоляты ацинетобактера, выделенные из крови и ликвора, в нашем исследовании способны к образованию биопленок разной интенсивности, что соотносится с предыдущими данными [23].

Обычно клинические штаммы A. baumannii образуют сильные биопленки [45, 57]. Для изученных нами штаммов было характерно образование биопленок слабой интенсивности. Наличие генов, ответственных за продукцию биопленок, согласно предыдущим исследованиям, коррелирует с интенсивностью биопленкообразования [5, 7]. Несмотря на наличие практически у всех изученных нами штаммов четырех и более генов, отвечающих за биопленкоообразование (bfmR, csuA/B, ompA, bap, katE), менее половины изолятов оказались способны к образованию сильных и умеренных биопленок (7/17).

Основная масса генотипов, полученных в нашем исследовании, относится к двум международным клональным линиям высокого риска ICL2 и ICL6. Это согласуется с предыдущими исследованиями наших российских коллег [1]. По данным базы МЛСТ, генотипический состав A. baumannii, выделенных из крови и ликвора в нашем исследовании, значительно отличается от такового в Китае, Японии [25], Дании [19].

Описывается, что штаммы международной клональной группы СС92/СС208^Oxf/CC2Pas (ICL2) наиболее часто способны вызывать бактериемию у пациентов [18]. В нашем исследовании к клональной линии ICL2 относились 7 изолятов (41%).

Acinetobacter spp. чаще всего вызывает инфицирование пациентов, подвергшихся инвазивным вмешательствам (катетеризация, интубация трахеи), имеющих травматическое или хирургическое повреждение кожных покровов, длительно применявших антимикробные препараты широкого спектра действия, особенно пациентов с травмами и в отделениях интенсивной терапии [16]. Наиболее распространенными инфекциями, связанными с A. baumannii, в клинике являются нозокомиальная пневмония и бактериемия. Фактором, провоцирующим возникновение пневмоний, может быть наличие у пациентов эндотрахеальных трубок и высокая способность A. baumannii к их колонизации [52]. Инфекции кровотока, как правило, связаны с наличием центрального венозного катетера или очагов инфекции, способствующих диссеминации патогена [2]. Менингиты, ассоциированные A. baumannii, обычно возникают после операций или при наличии вентрикулостомы [56].

В нашем исследовании наблюдались пациенты с хирургической патологией (53%), с тяжелыми сочетанными травмами (29%), а также с соматическими заболеваниями, сопровождающимися длительной антибактериальной и/или глюкокортикостероидной терапией (18%). Во всех случаях они находились в отделении реанимации и интенсивной терапии.

Сообщается, что уровень смертности при инфекциях кровотока, ассоциированных A. baumannii, колеблется от 28 до 43% [11]. В то же время данные некоторых исследователей еще более тревожны: свыше 60% в Израиле [46] и Бразилии [31]. В нашем исследовании около четверти случаев бактериемии и инфекции ЦНС, вызванных A. baumannii, имели неблагоприятный исход.

Выводы

Проведенный анализ показал, что инфекции кровотока и ЦНС, ассоциированные с A. baumannii, имеют большое значение особенно в отделениях реанимации и интенсивной терапии. A. baumannii способен длительное время сохраняться в организме человека и на поверхностях окружающей среды, в первую очередь больничной, а также обладает огромным потенциалом антибиотикорезистентности и вирулентности, способствуя высокой заболеваемости и смертности пациентов.

Об авторах

Зульфиря Закиевна Садеева

ФГАУ Национальный медицинский исследовательский центр здоровья детей Министерства здравоохранения Российской Федерации

Автор, ответственный за переписку.
Email: zulfiryasadeeva@yandex.ru

младший научный сотрудник лаборатории молекулярной микробиологии

Россия, Москва

Ирина Евгеньевна Новикова

ФГАУ Национальный медицинский исследовательский центр здоровья детей Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: zulfiryasadeeva@yandex.ru

младший научный сотрудник лаборатории молекулярной микробиологии

Россия, Москва

Наталья Михайловна Алябьева

ФГАУ Национальный медицинский исследовательский центр здоровья детей Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: zulfiryasadeeva@yandex.ru

к.м.н., старший научный сотрудник, зав. лабораторией экспериментальной иммунологии и вирусологии

Россия, Москва

Анна Валерьевна Лазарева

ФГАУ Национальный медицинский исследовательский центр здоровья детей Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: zulfiryasadeeva@yandex.ru

д.м.н., главный научный сотрудник лаборатории молекулярной микробиологии, зав. лабораторией микробиологии

Россия, Москва

Татьяна Михайловна Комягина

ФГАУ Национальный медицинский исследовательский центр здоровья детей Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: zulfiryasadeeva@yandex.ru

младший научный сотрудник лаборатории экспериментальной иммунологии и вирусологии

Россия, Москва

Ольга Витальевна Карасева

ФГАУ Национальный медицинский исследовательский центр здоровья детей Министерства здравоохранения Российской Федерации; НИИ неотложной детской хирургии и травматологии Департамента здравоохранения г. Москвы

Email: zulfiryasadeeva@yandex.ru

д.м.н., зав. отделом неотложной хирургии и травм детского возраста; зам. директора по научной работе, руководитель отдела сочетанной травмы, анестезиологии-реанимации

Россия, Москва; Москва

Марина Германовна Вершинина

ФГАУ Национальный медицинский исследовательский центр здоровья детей Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: zulfiryasadeeva@yandex.ru

к.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории медицинской геномики

Россия, Москва

Андрей Петрович Фисенко

ФГАУ Национальный медицинский исследовательский центр здоровья детей Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: zulfiryasadeeva@yandex.ru

д.м.н., профессор, директор

Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы