Иммунохимическая активность ompF и ompC поринов Yersinia pseudotuberculosis, оцененная методом лазерной ловушки
- Авторы: Конышев И.В.1,2, Новикова О.Д.3, Портнягина О.Ю.3, Бывалов А.А.1,2
-
Учреждения:
- ФГБУН Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН
- ФБОУ ВО Вятский государственный университет
- ФГБУН Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения РАН
- Выпуск: Том 12, № 6 (2022)
- Страницы: 1163-1168
- Раздел: КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
- Дата подачи: 25.07.2022
- Дата принятия к публикации: 22.08.2022
- Дата публикации: 30.12.2022
- URL: https://iimmun.ru/iimm/article/view/2007
- DOI: https://doi.org/10.15789/2220-7619-IAO-2007
- ID: 2007
Цитировать
Полный текст
Аннотация
Введение. Исследование особенностей взаимодействия в системе «антиген–антитело» имеет большое значение для разработки новых современных средств диагностики и терапии инфекционных заболеваний. В этой связи большой интерес представляет изучение природы связи, формируемой между бактериальными антигенами и антителами, с использованием современных биофизических методов. Одним из таких современных подходов является метод оптической ловушки, основанный на использовании лазерного пинцета. Значимость поверхностных антигенов в иммунохимической активности бактерий Yersinia pseudotuberculosis с использованием данного метода ранее не оценивалась. Целью настоящей работы явилось изучение возможности использования метода оптической ловушки для оценки взаимодействия трансмембранных белков, неспецифических поринов Y. pseudotuberculosis OmpF- и OmpC-типа, со специфическими антителами. Материалы и методы. Очищенные препараты поринов OmpF и OmpC наносили на полистирольные микросферы (d = 1 мкм) посредством пассивной адгезии; факт сенсибилизации микросфер верифицировали методом твердофазного иммуноферментного анализа комплементарных антисывороток, истощенных теми или иными микросферами. Антитела в составе мышиных сывороток сорбировали на поверхности стекла посредством химической сшивки. Определение силы связывания в системе «порины–антитела» производили с помощью лазерной ловушки согласно разработанному ранее алгоритму. Результаты. С помощью модельной системы, включающей полистирольные микросферы, сенсибилизированные поринами OmpF и OmpC, и подложку из аминированного стекла, покрытую иммунной или неиммунной сывороткой, были выявлены существенные различия в силе связывания поринов OmpF и OmpC с гомологичными антисыворотками по сравнению с неиммунной, контрольной сывороткой. Средняя сила связи при использовании иммунных сывороток составила 60 пН для микросфер «OmpF» (контроль — 40 пН) и 69 пН для микросфер «OmpC» (контроль — 49 пН). Доля необратимых связываний микросфер обоих типов с соответствующими комплементарными антисыворотками оказалась существенно выше по сравнению с использованием интактной сыворотки. Результаты оценки средней силы взаимодействия, а также преобладание доли необратимых связываний микросфер, нагруженных исследуемыми антигенами, с подложками, обработанными иммунными сыворотками, свидетельствует о том, что в сконструированной нами модельной системе специфические взаимодействия вносят значительный вклад в силу межмолекулярного связывания. Предложенный методический подход может быть применен для оценки сил межмолекулярного взаимодействия в аналогичных модельных системах с использованием иных микробных антигенов.
Ключевые слова
Полный текст
Введение
В настоящее время род Yersinia, включенный в семейство Yersiniaceae, включает 27 видов бактерий, три из которых — Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica и Y. pestis — патогенны для человека. Заболевания, вызываемые первыми двумя видами, протекают преимущественно в форме острого энтерита с поражением регионарных лимфоузлов и пейеровых бляшек кишечника. Энтеропатогенные представители рода Yersinia широко распространены в природных биотопах (почве, воде, растениях), некоторые из них являются зоонозными и обнаруживаются в организме рыб, земноводных и насекомых. Особенности персистенции иерсиний в условиях окружающей среды и те изменения, которые происходят в их клетках в процессе инфицирования теплокровных животных и человека, изучены недостаточно. Большую роль в этих процессах играют поверхностные антигены бактерий: липополисахарид и белки наружной мембраны.
Преобладающими (до 105 копий на клетку) среди белков наружной мембраны грамотрицательных бактерий являются порины, которые относятся к группе трансмембранных интегральных белков, формирующих в бактериальной мембране бочонкообразную структуру с гидрофильной порой внутри [10]. Остатки гидрофобных аминокислот поринов, обращенные наружу, взаимодействуют с липидами бактериальной мембраны; в свою очередь, гидрофильные остатки обращены в полость канала, что обеспечивает трансмембранный перенос низкомолекулярных гидрофильных органических соединений и солей (нутриентов, антибиотиков, солей желчных кислот).
На примере Escherichia coli было показано, что уровень экспрессии генов поринов изменяется в зависимости от температуры, рН среды и осмолярности среды [4, 9]. Подобными свойствами обладают и клетки психротолерантного микроорганизма Yersinia pseudotuberculosis: в окружающей среде и при культивировании в диапазоне температур (от +4 до +10°С) в клеточной стенке данного микроба синтезируется преимущественно порин OmpF. При повышении температуры до +37°С, например в условиях избытка нутриентов внутри теплокровного организма, увеличивается продукция белка OmpC, участвующего в формировании пор меньшего размера. Предполагается, что изменение типа неспецифических поринов в бактериальной мембране и связанное с этим изменение ее проницаемости (или эффективности прохождения нутриентов через наружную мембрану) представляет собой один из механизмов адаптации бактерий к изменению условий окружающей среды [9]. Кроме того, порин OmpC обеспечивает дополнительную защиту иерсиний от действия желчных кислот, способствуя их выживанию в тонком кишечнике [12].
Показано участие поринов грамотрицательных бактерий в процессах адгезии, инвазии и формировании устойчивости к компонентам сыворотки [3, 5, 13]. Сообщается также о вкладе поринов ряда бактерий в образование биопленок [11], об их возможном участии в рецепции бактериофагов [8] и в стимуляции синтеза провоспалительных цитокинов в процессе развития иммунного ответа [6].
Цель настоящего исследования состояла в определении методом оптической ловушки силовых характеристик взаимодействия молекул неспецифических поринов OmpF и OmpC Y. pseudotuberculosis с сыворотками, содержащими гомологичные антитела.
Материалы и методы
В работе использовали штамм Y. pseudotuberculosis серотипа 1b (№ 474), полученный из коллекции ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб».
Порины OmpF и OmpC Y. pseudotuberculosis получали из микробной массы, выращенной, соответственно, при +6…+8 и +37°С по ранее описанной методике [2]. Степень очистки полученных образцов поринов анализировали с помощью SDS, ПААГ-электрофореза по методу Лэммли [7]. По данным электрофореза, использованные в эксперименте образцы белков представляли собой гомогенные препараты. До использования в эксперименте препараты поринов хранили при температуре 4–6°С в фосфатном буферном растворе (ФБР), рН 7,2–7,4, содержащем 0,1% SDS. Cенсибилизацию микросфер препаратами поринов, а также валидацию факта указанной сенсибилизации проводили по методикам, описанным в работе [1].
Мышиные антисыворотки к поринам получали, как описано в работе [1]. Титры антител в полученных антипориновых сыворотках определяли с помощью метода непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА), используя микропланшеты Costar (США). Титры иммунных сывороток к поринам OmpF и OmpC составляли 1:62 400 и 1:124 800 соответственно. Нормальную, интактную сыворотку получали от неиммунных мышей. Непосредственно перед использованием препараты сывороток центрифугировали при 10 000g в течение 20 мин. Все эксперименты с животными были проведены в соответствии с положениями Директивы № 2010/63/ЕС Европейского парламента и Совета Европейского Союза «О защите животных, использующихся для научных целей».
Для сенсибилизации подложек сыворотками использовали пластиковые чашки «Fluorodish» (WPI, Германия) со стеклянным дном, которые предварительно подвергали процедуре аминирования. В отдельной емкости смешивали 10 мкл триэтиламина (Реахим, Россия) и 30 мкл 3-аминопропил-триэтоксисилана (APTES) (Sigma Aldrich, США), после чего помещали ее вместе с чашками в эксикатор и выдерживали в атмосфере аргона в течение 1,5 ч. По окончании процедуры на поверхность чашек наносили последовательно 0,6 мкл EDC (Sigma Aldrich, США), 900 мкл ФБР, 30 мкл 0,46%-ного раствора N-гидроксисукцинимида (SigmaAldrich, США) и 100 мкл каждой из трех сывороток (в разведении 1:10). Инкубировали чашки в течение ночи при температуре 4–6°С, затем пятикратно промывали деионизованной водой и хранили в закрытом эксикаторе при температуре 4–6°С.
Для оценки сил взаимодействия в модельной системе «микросфера–подложка» использовали лазерный пинцет JPK Nanotracker™ (JPK, Германия) на основе иттрий-гранатового источника инфракрасного излучения (λ = 1064 нм). Непосредственно перед проведением эксперимента в чашку «Flurodish», сенсибилизированную одним из трех сывороточных препаратов, приливали 2,5 мл ФБР и 2–4 мкл суспензии микросфер. Тщательно перемешивали содержимое чашки и устанавливали ее на термостатируемую платформу с температурой +37°С. Далее производили калибровку прибора с использованием программы «JPK Calibration Manager» с учетом температуры раствора, диаметра микросфер и вязкости раствора (0,73 сПз). Определенное таким способом среднее значение коэффициента чувствительности квадрантного детектора составило 6,4 мВ/нм, коэффициента жесткости — 0,26 пН/нм.
Методика оценки сил межмолекулярного взаимодействия включала захват микросферы в фокус лазерной ловушки при мощности лазера 2,0 Вт. После повторной калибровки подводили микросферу ко дну чашки таким образом, чтобы расстояние между ними составляло 1,0–1,5 мкм. С помощью пьезостолика прецизионно перемещали чашку в направлении неподвижной микросферы с шагом 50 нм до момента их соприкосновения, который фиксировали по трем последовательным скачкам на хронограмме сигнала. Спустя 1 с после остановки запускали процесс отведения пьезостолика в обратном направлении в полуавтоматическом режиме со скоростью около 150 нм/с. Момент разрыва связи детектировали по скачкообразному изменению сигнала на хронограмме.
Первичные данные сохраняли в виде текстовых файлов, которые затем обрабатывали с использованием специализированного программного обеспечения JPK Processing. Статистический анализ проводили с использованием пакетов программ MatLab 7.0 и Statistica 12.
Результаты и обсуждение
На первом этапе исследования иммунохимически был подтвержден факт сенсибилизации полистирольных микросфер препаратами поринов. С помощью метода ТИФА были определены средние значения оптической плотности (ОП492) растворов в лунках с внесенными «анти-OmpF» и «анти-OmpC» сыворотками, полученными после инкубации с микросферами, сенсибилизированными гомологичными антигенами. Измеренные значения ОП492 составили соответственно 0,950 и 0,742 против 1,722 и 2,041 единиц ОП492, полученных для супернатантов после инкубации микросфер «БСА» с препаратами этих же сывороток. Активность исходных иммунных «анти-OmpF» и «анти-OmpC» сывороток, взятых в том же разведении, составила в среднем 1,803 и 2,102 единиц ОП492 соответственно.
На втором этапе исследования методом оптической ловушки были определены средние силы взаимодействия микросфер, обработанных поринами OmpF и OmpC, с соответствующими гомологичными антисыворотками. Их значения оказались близкими и составили соответственно 60 и 69 пН. При использовании подложки, обработанной нормальной мышиной сывороткой, не содержащей антител к указанным белкам, силы взаимодействия составили в среднем 40 и 49 пН соответственно (табл.). Анализ гистограмм распределения сил разрыва для системы «OmpF–анти-OmpF» показал наличие двух выраженных пиков (в области 20–40 и 110–140 пН). Похожая закономерность характерна и для второй пары взаимодействующих молекул: в системе «OmpС–анти-OmpС» первый пик наблюдался в области 20–40 пН, второй — в области 110–150 пН (рис.).
Рисунок. Гистограммы распределения сил разрыва в системе «микросфера–подложка»
Figure. Histograms of rupture force distribution in the “microsphere–glass surface” system
Примечание. А —«OmpF–анти-OmpF», Б — «OmpF–нормальная сыворотка», В — «OmpС–анти-OmpС», Г — «OmpC–нормальная сыворотка».
Note. A — “OmpF–anti-OmpF”, B — “OmpF–normal serum”, C — “OmpC–anti-OmpC”, D — “OmpC–normal serum”.
Можно предположить, что высокоамплитудные отрывы соответствуют специфическим взаимодействиям антигена с иммунной сывороткой, а низкоамплитудные отрывы — неспецифическим взаимодействиям, обусловленным, очевидно, физико-химическими особенностями носителей (полистирола микросфер и стеклянной поверхности, обработанной аминирующим агентом — APTES). При использовании подложек, обработанных нормальной мышиной сывороткой, доля низкоамплитудных отрывов (до 40 пН) составила 57 и 48% для микросфер «OmpF» и «OmpС» соответственно. При использовании чашек, покрытых сыворотками к указанным поринам, доля низкоамплитудных отрывов оказалась существенно ниже — соответственно 30 и 40%. При этом доля необратимых связываний микросфер «OmpF» с комплементарной и контрольной сыворотками составила 39,4 и 15,3%, а для микросфер «OmpC» — 39,2 и 17,9% (табл.).
Таблица. Силы разрыва связей в системе «микросфера–подложка» для различных комбинаций антигенов и сывороток
Table. Rupture force distribution in the “microsphere–glass surface” system for varying antigen-serum combinations
Показатель Parameter | Значение показателя для модельной системы Parameter magnitude in model system | |||
OmpF– анти-OmpF OmpF– anti-OmpF | OmpF–нормальная сыворотка OmpF–normal serum | OmpС– анти-OmpС OmpС– anti-OmpС | OmpC–нормальная сыворотка OmpC–normal serum | |
Fmean, пН | 60±41* | 40±31* | 69±41** | 49±39** |
Доля необратимых связываний, % Proportion of irreversible bindings, % | 39,4 | 15,3 | 39,2 | 17,9 |
Доля «нулевых» опытов, % Proportion of «zero» bindings, % | 17,9 | 46,8 | 16,5 | 41,9 |
N | 471 | 326 | 450 | 375 |
Примечание. Fmean — среднее значение силы разрываемой связи; *, ** — различия в парах статистически достоверны для р > 0,99; под «нулевым» опытом понимается отсутствие скачка сигнала на хронограмме при отведении пьезостолика.
Note. Fmean — mean value of the ruptured bond strength; *, ** — significant pairwise differences for p > 0.99; «zero» binding stands for no signal rise upon piezo table removal.
Как видно из представленных на рисунке данных, связывание исследуемых антигенов с антителами представляет собой сложный процесс, поскольку на всех гистограммах присутствует как низкоаплитудный, так и высокоамплитудный пики. В случае иммунной сыворотки, которая используется в эксперименте в небольшом разведении (1:10), наличие пика в области 20–40 пН может объясняться присутствием сывороточных белков, неспецифически взаимодействующих с БСА, привнесенным из блокирующего буфера в состав сенситина на микросферах. Тем не менее преобладание доли необратимых связываний нагруженных исследуемыми антигенами микросфер с подложками, обработанными иммунными сыворотками, свидетельствует о том, что в сконструированной нами модельной системе специфические взаимодействия вносят значительный вклад в силу межмолекулярного связывания (табл.).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что апробированные нами методические подходы, основанные на использовании оптического пинцета, позволяют оценивать силовые характеристики межмолекулярного взаимодействия различных микробных антигенов и антител.
Об авторах
Илья Владимирович Конышев
ФГБУН Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН; ФБОУ ВО Вятский государственный университет
Email: konyshevil@yandex.ru
к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории физиологии микроорганизмов; доцент кафедры биотехнологии Институт биологии и биотехнологии
Россия, Сыктывкар; 610000, Киров, ул. Московская, 36, каб. 513аОльга Данииловна Новикова
ФГБУН Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения РАН
Email: viktoria@piboc.dvo.ru
д.х.н., главный научный сотрудник лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета
Россия, ВладивостокОльга Юрьевна Портнягина
ФГБУН Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения РАН
Email: o_vl@piboc.dvo.ru
к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета
Россия, ВладивостокАндрей Анатольевич Бывалов
ФГБУН Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН; ФБОУ ВО Вятский государственный университет
Автор, ответственный за переписку.
Email: byvalov@nextmail.ru
д.м.н., профессор, старший научный сотрудник Центра превосходства «Фармацевтическая биотехнология»; зав. лабораторией физиологии микроорганизмов Института физиологии
Россия, Сыктывкар; 610000, Киров, ул. Московская, 36, каб. 513аСписок литературы
- Бывалов А.А., Конышев И.В., Новикова О.Д., Портнягина О.Ю., Белозеров В.С., Хоменко В.А., Давыдова В.Н. Адгезивность поринов OmpF и OmpC Yersinia pseudotuberculosis к макрофагам J774 // Биофизика. 2018. Т. 63, № 5. С. 913–922. [Byvalov A.A., Konyshev I.V., Novikova O.D., Portnyagina O.Yu., Belozerov V.S., Khomenko V.A., Davydova V.N. Adhesiveness of OmpF and OmpC porins from Yersinia pseudotuberculosis to macrophages J774. Biofizika = Byophysics, 2018, vol. 63, no. 5, pp. 913–922. (In Russ.)]
- Новикова О.Д., Федореева Л.И., Хоменко В.А., Портнягина О.Ю., Ермак И.М., Лихацкая Г.Н., Мороз С.В., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Влияние способа экстракции порообразующего белка из Yersinia pseudotuberculosis на его макромолекулярную организацию // Биоорганическая химия. 1993. Т. 19, № 5. C. 536–547. [Novikova O.D., Fedoreeva L.I., Khomenko V.A., Portnyagina O.Y., Ermak I.M., Likhatskaya G.N., Moroz S.V., Solovieva T.F., Ovodov Yu S. Effect of the method of extraction of pore-forming protein from Yersinia pseudotuberculosis on its macromolecular organization. Bioorganicheskaya khimiya = Bioorganic Chemistry, 1993, vol. 19, no. 5, pp. 536–547. (In Russ.)]
- Achouak W., Heulin T., Pages J.M. Multiple facets of bacterial porins. FEMS Microbiol. Lett., 2001, vol. 199, pp. 1–7. doi: 10.1111/j.1574-6968.2001.tb10642.x
- Csonka L.N. Physiological and genetic responses of bacteria to osmotic stress. Microbiol. Rev., 1989, vol. 53, pp. 121–147. doi: 10.1128/mr.53.1.121-147.1989
- Duperthuy M., Binesse J., Le Roux F., Romestand B., Caro A., Got P., Givaudan A., Mazel D., Bachère E., Destoumieux-Garzón D. The major outer membrane protein OmpU of Vibrio splendidus contributes to host antimicrobial peptide resistance and is required for virulence in the oyster Crassostrea gigas. Environ. Microbiol., 2010, vol. 12, pp. 951–963. doi: 10.1111/j.1462-2920.2009.02138.x
- Galdiero S., Falanga A., Cantisani M., Tarallo R., Della Pepa M.E., D’Oriano V., Galdiero M. Microbe-host interactions: structure and role of Gram-negative bacterial porins. Curr. Protein Pept. Sci., 2012, vol. 13, pp. 843–854. doi: 10.2174/138920312804871120
- Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970, vol. 227, pp. 680–685. doi: 10.1038/227680a0
- Leon-Velarde C.G., Happonen L., Pajunen M., Leskinen K., Kropinski A.M., Mattinen L., Rajtor M., Zur J., Smith D., Chen S., Nawaz A., Johnson R.P., Odumeru J.A., Griffiths M.W., Skurnik M. Yersinia enterocolitica-specific infection by Bacteriophages TG1 and ϕR1-RT is dependent on temperature-regulated expression of the phage host receptor OmpF. Appl. Environ. Microbiol., 2016, vol. 82, pp. 5340–5453. doi: 10.1128/AEM.01594-16
- Liu X., Ferenci T. An analysis of multifactorial influences on the transcriptional control of OmpF and OmpC porin expression under nutrient limitation. Microbiology, 2001, vol. 147, pp. 2981–2989. doi: 10.1099/00221287-147-11-2981
- Nikaido H. Escherichia coli and Salmonella cellular and molecular biology. Outer membrane. Ed. F.C. Neidhardt. ASM Press D.C., 1996, pp. 29–47.
- Pompilio A., Scribano D., Sarshar M., Di Bonaventura G., Palamara A.T., Ambrosi C. Gram-negative bacteria holding together in a biofilm: the Acinetobacter baumannii way. Microorganisms, 2021, vol. 9: 1353. doi: 10.3390/microorganisms9071353
- Thanassi D.G., Cheng L.W., Nikaido H. Active efflux of bile salts by Escherichia coli. J. Bacteriol., 1997, vol. 179, pp. 2512–2518. doi: 10.1128/jb.179.8.2512-2518.1997
- Van Putten J.P., Duensing T.D., Carlson J. Gonococcal invasion of epithelial cells driven by P.IA, a bacterial ion channel with GTP binding properties. J. Exp. Med., 1998, vol. 188, pp. 941–952. doi: 10.1084/jem.188.5.941
Дополнительные файлы
![](/img/style/loading.gif)