Иммунохимическая активность ompF и ompC поринов Yersinia pseudotuberculosis, оцененная методом лазерной ловушки

Полный текст

Введение

В настоящее время род Yersinia, включенный в семейство Yersiniaceae, включает 27 видов бактерий, три из которых — Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica и Y. pestis — патогенны для человека. Заболевания, вызываемые первыми двумя видами, протекают преимущественно в форме острого энтерита с поражением регионарных лимфоузлов и пейеровых бляшек кишечника. Энтеропатогенные представители рода Yersinia широко распространены в природных биотопах (почве, воде, растениях), некоторые из них являются зоонозными и обнаруживаются в организме рыб, земноводных и насекомых. Особенности персистенции иерсиний в условиях окружающей среды и те изменения, которые происходят в их клетках в процессе инфицирования теплокровных животных и человека, изучены недостаточно. Большую роль в этих процессах играют поверхностные антигены бактерий: липополисахарид и белки наружной мембраны.

Преобладающими (до 10⁵ копий на клетку) среди белков наружной мембраны грамотрицательных бактерий являются порины, которые относятся к группе трансмембранных интегральных белков, формирующих в бактериальной мембране бочонкообразную структуру с гидрофильной порой внутри [10]. Остатки гидрофобных аминокислот поринов, обращенные наружу, взаимодействуют с липидами бактериальной мембраны; в свою очередь, гидрофильные остатки обращены в полость канала, что обеспечивает трансмембранный перенос низкомолекулярных гидрофильных органических соединений и солей (нутриентов, антибиотиков, солей желчных кислот).

На примере Escherichia coli было показано, что уровень экспрессии генов поринов изменяется в зависимости от температуры, рН среды и осмолярности среды [4, 9]. Подобными свойствами обладают и клетки психротолерантного микроорганизма Yersinia pseudotuberculosis: в окружающей среде и при культивировании в диапазоне температур (от +4 до +10°С) в клеточной стенке данного микроба синтезируется преимущественно порин OmpF. При повышении температуры до +37°С, например в условиях избытка нутриентов внутри теплокровного организма, увеличивается продукция белка OmpC, участвующего в формировании пор меньшего размера. Предполагается, что изменение типа неспецифических поринов в бактериальной мембране и связанное с этим изменение ее проницаемости (или эффективности прохождения нутриентов через наружную мембрану) представляет собой один из механизмов адаптации бактерий к изменению условий окружающей среды [9]. Кроме того, порин OmpC обеспечивает дополнительную защиту иерсиний от действия желчных кислот, способствуя их выживанию в тонком кишечнике [12].

Показано участие поринов грамотрицательных бактерий в процессах адгезии, инвазии и формировании устойчивости к компонентам сыворотки [3, 5, 13]. Сообщается также о вкладе поринов ряда бактерий в образование биопленок [11], об их возможном участии в рецепции бактериофагов [8] и в стимуляции синтеза провоспалительных цитокинов в процессе развития иммунного ответа [6].

Цель настоящего исследования состояла в определении методом оптической ловушки силовых характеристик взаимодействия молекул неспецифических поринов OmpF и OmpC Y. pseudotuberculosis с сыворотками, содержащими гомологичные антитела.

Материалы и методы

В работе использовали штамм Y. pseudotuberculosis серотипа 1b (№ 474), полученный из коллекции ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб».

Порины OmpF и OmpC Y. pseudotuberculosis получали из микробной массы, выращенной, соответственно, при +6…+8 и +37°С по ранее описанной методике [2]. Степень очистки полученных образцов поринов анализировали с помощью SDS, ПААГ-электрофореза по методу Лэммли [7]. По данным электрофореза, использованные в эксперименте образцы белков представляли собой гомогенные препараты. До использования в эксперименте препараты поринов хранили при температуре 4–6°С в фосфатном буферном растворе (ФБР), рН 7,2–7,4, содержащем 0,1% SDS. Cенсибилизацию микросфер препаратами поринов, а также валидацию факта указанной сенсибилизации проводили по методикам, описанным в работе [1].

Мышиные антисыворотки к поринам получали, как описано в работе [1]. Титры антител в полученных антипориновых сыворотках определяли с помощью метода непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА), используя микропланшеты Costar (США). Титры иммунных сывороток к поринам OmpF и OmpC составляли 1:62 400 и 1:124 800 соответственно. Нормальную, интактную сыворотку получали от неиммунных мышей. Непосредственно перед использованием препараты сывороток центрифугировали при 10 000g в течение 20 мин. Все эксперименты с животными были проведены в соответствии с положениями Директивы № 2010/63/ЕС Европейского парламента и Совета Европейского Союза «О защите животных, использующихся для научных целей».

Для сенсибилизации подложек сыворотками использовали пластиковые чашки «Fluorodish» (WPI, Германия) со стеклянным дном, которые предварительно подвергали процедуре аминирования. В отдельной емкости смешивали 10 мкл триэтиламина (Реахим, Россия) и 30 мкл 3-аминопропил-триэтоксисилана (APTES) (Sigma Aldrich, США), после чего помещали ее вместе с чашками в эксикатор и выдерживали в атмосфере аргона в течение 1,5 ч. По окончании процедуры на поверхность чашек наносили последовательно 0,6 мкл EDC (Sigma Aldrich, США), 900 мкл ФБР, 30 мкл 0,46%-ного раствора N-гидроксисукцинимида (SigmaAldrich, США) и 100 мкл каждой из трех сывороток (в разведении 1:10). Инкубировали чашки в течение ночи при температуре 4–6°С, затем пятикратно промывали деионизованной водой и хранили в закрытом эксикаторе при температуре 4–6°С.

Для оценки сил взаимодействия в модельной системе «микросфера–подложка» использовали лазерный пинцет JPK Nanotracker™ (JPK, Германия) на основе иттрий-гранатового источника инфракрасного излучения (λ = 1064 нм). Непосредственно перед проведением эксперимента в чашку «Flurodish», сенсибилизированную одним из трех сывороточных препаратов, приливали 2,5 мл ФБР и 2–4 мкл суспензии микросфер. Тщательно перемешивали содержимое чашки и устанавливали ее на термостатируемую платформу с температурой +37°С. Далее производили калибровку прибора с использованием программы «JPK Calibration Manager» с учетом температуры раствора, диаметра микросфер и вязкости раствора (0,73 сПз). Определенное таким способом среднее значение коэффициента чувствительности квадрантного детектора составило 6,4 мВ/нм, коэффициента жесткости — 0,26 пН/нм.

Методика оценки сил межмолекулярного взаимодействия включала захват микросферы в фокус лазерной ловушки при мощности лазера 2,0 Вт. После повторной калибровки подводили микросферу ко дну чашки таким образом, чтобы расстояние между ними составляло 1,0–1,5 мкм. С помощью пьезостолика прецизионно перемещали чашку в направлении неподвижной микросферы с шагом 50 нм до момента их соприкосновения, который фиксировали по трем последовательным скачкам на хронограмме сигнала. Спустя 1 с после остановки запускали процесс отведения пьезостолика в обратном направлении в полуавтоматическом режиме со скоростью около 150 нм/с. Момент разрыва связи детектировали по скачкообразному изменению сигнала на хронограмме.

Первичные данные сохраняли в виде текстовых файлов, которые затем обрабатывали с использованием специализированного программного обеспечения JPK Processing. Статистический анализ проводили с использованием пакетов программ MatLab 7.0 и Statistica 12.

Результаты и обсуждение

На первом этапе исследования иммунохимически был подтвержден факт сенсибилизации полистирольных микросфер препаратами поринов. С помощью метода ТИФА были определены средние значения оптической плотности (ОП₄₉₂) растворов в лунках с внесенными «анти-OmpF» и «анти-OmpC» сыворотками, полученными после инкубации с микросферами, сенсибилизированными гомологичными антигенами. Измеренные значения ОП₄₉₂ составили соответственно 0,950 и 0,742 против 1,722 и 2,041 единиц ОП₄₉₂, полученных для супернатантов после инкубации микросфер «БСА» с препаратами этих же сывороток. Активность исходных иммунных «анти-OmpF» и «анти-OmpC» сывороток, взятых в том же разведении, составила в среднем 1,803 и 2,102 единиц ОП₄₉₂ соответственно.

На втором этапе исследования методом оптической ловушки были определены средние силы взаимодействия микросфер, обработанных поринами OmpF и OmpC, с соответствующими гомологичными антисыворотками. Их значения оказались близкими и составили соответственно 60 и 69 пН. При использовании подложки, обработанной нормальной мышиной сывороткой, не содержащей антител к указанным белкам, силы взаимодействия составили в среднем 40 и 49 пН соответственно (табл.). Анализ гистограмм распределения сил разрыва для системы «OmpF–анти-OmpF» показал наличие двух выраженных пиков (в области 20–40 и 110–140 пН). Похожая закономерность характерна и для второй пары взаимодействующих молекул: в системе «OmpС–анти-OmpС» первый пик наблюдался в области 20–40 пН, второй — в области 110–150 пН (рис.).

 

Рисунок. Гистограммы распределения сил разрыва в системе «микросфера–подложка»

Figure. Histograms of rupture force distribution in the “microsphere–glass surface” system

Примечание. А —«OmpF–анти-OmpF», Б — «OmpF–нормальная сыворотка», В — «OmpС–анти-OmpС», Г — «OmpC–нормальная сыворотка».

Note. A — “OmpF–anti-OmpF”, B — “OmpF–normal serum”, C — “OmpC–anti-OmpC”, D — “OmpC–normal serum”.

 

Можно предположить, что высокоамплитудные отрывы соответствуют специфическим взаимодействиям антигена с иммунной сывороткой, а низкоамплитудные отрывы — неспецифическим взаимодействиям, обусловленным, очевидно, физико-химическими особенностями носителей (полистирола микросфер и стеклянной поверхности, обработанной аминирующим агентом — APTES). При использовании подложек, обработанных нормальной мышиной сывороткой, доля низкоамплитудных отрывов (до 40 пН) составила 57 и 48% для микросфер «OmpF» и «OmpС» соответственно. При использовании чашек, покрытых сыворотками к указанным поринам, доля низкоамплитудных отрывов оказалась существенно ниже — соответственно 30 и 40%. При этом доля необратимых связываний микросфер «OmpF» с комплементарной и контрольной сыворотками составила 39,4 и 15,3%, а для микросфер «OmpC» — 39,2 и 17,9% (табл.).

 

Таблица. Силы разрыва связей в системе «микросфера–подложка» для различных комбинаций антигенов и сывороток

Table. Rupture force distribution in the “microsphere–glass surface” system for varying antigen-serum combinations

Показатель Parameter	Значение показателя для модельной системы Parameter magnitude in model system
	OmpF– анти-OmpF OmpF– anti-OmpF	OmpF–нормальная сыворотка OmpF–normal serum	OmpС– анти-OmpС OmpС– anti-OmpС	OmpC–нормальная сыворотка OmpC–normal serum
Fmean, пН	60±41*	40±31*	69±41**	49±39**
Доля необратимых связываний, % Proportion of irreversible bindings, %	39,4	15,3	39,2	17,9
Доля «нулевых» опытов, % Proportion of «zero» bindings, %	17,9	46,8	16,5	41,9
N	471	326	450	375

Примечание. Fmean — среднее значение силы разрываемой связи; *, ** — различия в парах статистически достоверны для р > 0,99; под «нулевым» опытом понимается отсутствие скачка сигнала на хронограмме при отведении пьезостолика.

Note. Fmean — mean value of the ruptured bond strength; *, ** — significant pairwise differences for p > 0.99; «zero» binding stands for no signal rise upon piezo table removal.

 

Как видно из представленных на рисунке данных, связывание исследуемых антигенов с антителами представляет собой сложный процесс, поскольку на всех гистограммах присутствует как низкоаплитудный, так и высокоамплитудный пики. В случае иммунной сыворотки, которая используется в эксперименте в небольшом разведении (1:10), наличие пика в области 20–40 пН может объясняться присутствием сывороточных белков, неспецифически взаимодействующих с БСА, привнесенным из блокирующего буфера в состав сенситина на микросферах. Тем не менее преобладание доли необратимых связываний нагруженных исследуемыми антигенами микросфер с подложками, обработанными иммунными сыворотками, свидетельствует о том, что в сконструированной нами модельной системе специфические взаимодействия вносят значительный вклад в силу межмолекулярного связывания (табл.).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что апробированные нами методические подходы, основанные на использовании оптического пинцета, позволяют оценивать силовые характеристики межмолекулярного взаимодействия различных микробных антигенов и антител.

Об авторах

Илья Владимирович Конышев

ФГБУН Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН; ФБОУ ВО Вятский государственный университет

Email: konyshevil@yandex.ru

к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории физиологии микроорганизмов; доцент кафедры биотехнологии Институт биологии и биотехнологии 

Россия, Сыктывкар; 610000, Киров, ул. Московская, 36, каб. 513а

Ольга Данииловна Новикова

ФГБУН Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения РАН

Email: viktoria@piboc.dvo.ru

д.х.н., главный научный сотрудник лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета

Россия, Владивосток

Ольга Юрьевна Портнягина

ФГБУН Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения РАН

Email: o_vl@piboc.dvo.ru

к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета

Россия, Владивосток

Андрей Анатольевич Бывалов

ФГБУН Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН; ФБОУ ВО Вятский государственный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: byvalov@nextmail.ru

д.м.н., профессор, старший научный сотрудник Центра превосходства «Фармацевтическая биотехнология»; зав. лабораторией физиологии микроорганизмов Института физиологии

Россия, Сыктывкар; 610000, Киров, ул. Московская, 36, каб. 513а

Список литературы

Дополнительные файлы