Immunochemical activity of OmpF and OmpC porins from Yersinia pseudotuberculosis evaluated by optical trapping

  • Authors: Konyshev I.V.1,2, Novikova O.D.3, Portnyagina O.Y.3, Byvalov A.A.1,2
  • Affiliations:
    1. Federal State Budgetary Scientific Institution Institute of Physiology of the Komi Scientific Center of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences (Komi SC UB RAS)
    2. Vyatka State University
    3. Federal State Budgetary Scientific Institution Pacific Institute of Bioorganic Chemistry named after G.B. Elyakov of the Far East Branch of the Russian Academy of Sciences (IBC named after G.B. Elyakov FEB RAS)
  • Section: SHORT COMMUNICATIONS
  • URL: https://iimmun.ru/iimm/article/view/2007

Cite item

Abstract

Introduction. Study of peculiarities of interaction in the "antigen-antibody" system is of great importance for the development of new modern tools for diagnosis and therapy of infectious diseases. In this regard, it is of great interest to study the rupture force between bacterial antigens and antibodies using modern biophysical methods, one of which is optical trapping. The significance of surface antigens in the immunochemical activity of Yersinia pseudotuberculosis using this method has not been evaluated before. In this work we studied the possibility to evaluate the interaction of hydrophobic porins OmpF and OmpC of Y. pseudotuberculosis with specific antibodies using optical trapping method. Materials and methods. Polystyrene microspheres (d = 1 μm) were coated by purified preparations of OmpF and OmpC porins by passive adhesion; the fact of microspheres sensitization was verified by enzyme immunoassay. Antibodies from mouse sera were sorbed onto the glass surface by chemical linking. The rupture force in the "porins-antibodies" system was determined using a laser trap according to a previously developed algorithm. Results. Using a model system including polystyrene microspheres sensitized with these proteins and an aminated glass substrate coated with immune or nonimmune serum, significant differences in binding strength of OmpF and OmpC porins to homologous antisera versus nonimmune serum were detected. The average forces of interaction with immune sera was 60 pN for OmpF microspheres (control – 40 pN) and 69 pN for OmpC microspheres (control – 49 pN). The proportion of irreversible binding of the microspheres coated by the antigens to the substrates treated with immune sera was significantly higher compared to non-immune serum. The results of the assessment of the average interaction force, as well as the predominance of the proportion of irreversible binding of antigen-coated microspheres with sera-treated substrates, indicates that in this model system specific interactions contribute significantly to the force of interaction. The above method can be used to evaluate the forces of intermolecular interaction in similar model systems using other microbial antigens.

Full Text

Введение

         В настоящее время род Yersinia, включённый в семейство Yersiniaceae, включает 27 видов бактерий, три из которых – Y. pseudotuberculosis, Y. enterocoliticaи Y. pestis – патогенны для человека. Заболевания, вызываемые первыми двумя видами, протекают преимущественно в форме острого энтерита с поражением регионарных лимфоузлов и пейеровых бляшек кишечника. Энтеропатогенные представители рода Yersinia широко распространены в природных биотопах (почве, воде, растениях), некоторые из них являются зоонозными и обнаруживаются в организме рыб, земноводных и насекомых. Особенности персистенции иерсиний в условиях окружающей среды и те изменения, которые происходят в их клетках в процессе инфицирования теплокровных животных и человека, изучены недостаточно. Большую роль в этих процессах играют поверхностные антигены бактерий:  липополисахарид и белки наружной мембраны.

         Преобладающими (до 105 копий на клетку) среди белков наружной мембраны грамотрицательных бактерий являются порины,  которые относятся к группе трансмембранных интегральных белков, формирующих в бактериальной мембране бочонкообразную структуру с гидрофильной порой внутри [1]. Остатки гидрофобных аминокислот поринов, обращённые наружу, взаимодействуют с липидами бактериальной мембраны; в свою очередь, гидрофильные остатки обращены в полость канала, что обеспечивает трансмембранный перенос низкомолекулярных гидрофильных органических соединений и солей (нутриентов, антибиотиков, солей желчных кислот).

На примере Escherichia coli было показано, что уровень экспрессии генов поринов изменяется в зависимости от температуры, рН среды и осмолярности среды [2, 3]. Подобными свойствами обладают и клетки психротолерантного микроорганизма Yersinia pseudotuberculosis: в окружающей среде и при культивировании в диапазоне температур (от +4 до +10 °С) в клеточной стенке данного микроба синтезируется преимущественно порин OmpF. При повышении температуры до +37 °С, например, в условиях избытка нутриентов внутри теплокровного организма, увеличивается продукция OmpC белка, участвующего в формировании пор меньшего размера. Предполагается, что изменение типа неспецифических поринов в бактериальной мембране и связанное с этим изменение ее проницаемости (или эффективности прохождения нутриентов через наружную мембрану) представляет собой один из механизмов адаптации бактерий к изменению условий окружающей среды. [3]. Кроме того, порин OmpC обеспечивает дополнительную защиту иерсиний от действия жёлчных кислот, способствуя их выживанию в тонком кишечнике [4].

 Показано участие поринов грамотрицательных бактерий в процессах адгезии, инвазии и формировании устойчивости к компонентам сыворотки [5-7]. Сообщается также о вкладе поринов ряда бактерий в образование биоплёнок [8], об их возможном участии в рецепции бактериофагов [9] и в стимуляции синтеза провоспалительных цитокинов в процессе развития иммунного ответа [10].

Цель настоящего исследования состояла в определении методом оптической ловушки силовых характеристик взаимодействия молекул неспецифических поринов OmpF и OmpC Y. pseudotuberculosis с сыворотками, содержащими гомологичные антитела.

 

Материалы и методы

 

В работе использовали штамм Y. pseudotuberculosis серотипа 1b (№ 474), полученный из коллекции ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб».

Порины OmpF и OmpC Y. pseudotuberculosis получали из микробной массы, выращенной, соответственно, при + 6… + 8 и + 37 °С по ранее описанной методике  [11]. Степень очистки полученных образцов поринов анализировали с помощью SDS, ПААГ-электрофореза по методу Лэммли [12]. По данным электрофореза, использованные в эксперименте образцы белков представляли собой гомогенные препараты. До использования в эксперименте препараты поринов хранили при температуре 4-6 °С в фосфатном буферном растворе, рН 7.2–7.4, (ФБР), содержащем 0.1 % SDS. Cенсибилизацию микросфер препаратами поринов, а также валидацию факта указанной сенсибилизации проводили по методикам, описанным в работе [13].

Мышиные антисыворотки к поринам получали, как описано в работе [13]. Титры антител в полученных антипориновых сыворотках определяли с помощью метода непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА), используя микропланшеты Costar (США). Титры иммунных сывороток к  OmpF и OmpC поринам составляли 1:62400 и 1:124800 соответственно. Нормальную, интактную сыворотку получали от неиммунных мышей. Непосредственно перед использованием препараты сывороток центрифугировали при 10000 g в течение 20 мин. Все эксперименты с животными были проведены в соответствии с положениями Директивы2010/63/ЕС Европейского парламента и Совета Европейского Союза “О защите животных, использующихся для научных целей”.

Для сенсибилизации подложек сыворотками использовали пластиковые чашки «Fluorodish» (WPI, Германия) со стеклянным дном, которые предварительно подвергали процедуре аминирования. В отдельной ёмкости смешивали 10 мкл триэтиламина (Реахим, Россия) и 30 мкл 3-аминопропил-триэтоксисилана (APTES) (Sigma Aldrich, США), после чего помещали её вместе с чашками в эксикатор и выдерживали в атмосфере аргона в течение 1.5 ч. По окончании процедуры на поверхность чашек наносили последовательно 0.6 мкл EDC (Sigma Aldrich, США), 900 мкл ФБР, 30 мкл 0.46%-ного раствора N-гидроксисукцинимида (SigmaAldrich, США) и 100 мкл каждой из трёх сывороток (в разведении 1:10). Инкубировали чашки в течение ночи при температуре  4-6 °С, затем пятикратно промывали деионизованной водой и хранили в закрытом эксикаторе при температуре  4-6  °С.

Для оценки сил взаимодействия в модельной системе «микросфера – подложка» использовали лазерный пинцет JPK NanotrackerТМ (JPK, Германия) на основе иттрий-гранатового источника инфракрасного излучения (λ = 1064 нм). Непосредственно перед проведением эксперимента в чашку ‘Flurodish’, сенсибилизированную одним из трёх сывороточных препаратов, приливали 2.5 мл ФБР и 2-4 мкл суспензии микросфер. Тщательно перемешивали содержимое чашки и устанавливали её на термостатируемую платформу с температурой +37 °С. Далее производили калибровку прибора с использованием программы «JPK Calibration Manager» с учётом температуры раствора, диаметра микросфер и вязкости раствора (0.73 сПз). Определённое таким способом среднее значение коэффициента чувствительности квадрантного детектора составило 6.4 мВ/ нм, коэффициента жёсткости – 0.26 пН/ нм.

Методика оценки сил межмолекулярного взаимодействия включала захват микросферы в фокус лазерной ловушки при мощности лазера 2.0 Вт. После повторной калибровки подводили микросферу ко дну чашки таким образом, чтобы расстояние между ними составляло 1.0 -1.5 мкм. С помощью пьезостолика прецизионно перемещали чашку в направлении неподвижной микросферы с шагом 50 нм до момента их соприкосновения, который индицировали по трём последовательным скачкам на хронограмме сигнала. Спустя 1 с после остановки запускали процесс отведения пьезостолика в обратном направлении в полуавтоматическом режиме со скоростью около 150 нм/ с. Момент разрыва связи детектировали по скачкообразному изменению сигнала на хронограмме. 

Первичные данные сохраняли в виде текстовых файлов, которые затем обрабатывали с использованием специализированного программного обеспечения JPK Processing. Статистический анализ проводили с использованием пакетов программ MatLab 7.0 и Statistica 12.

 

Результаты и обсуждение

 

На первом этапе исследования иммунохимически был подтверждён факт сенсибилизации полистироловых микросфер препаратами поринов. С помощью метода ТИФА были определены средние значения оптической плотности (ОП492) растворов в лунках с внесёнными «анти-OmpF» и «анти-OmpC» сыворотками, полученными после инкубации с микросферами, сенсибилизированными гомологичными антигенами. Измеренные значения ОП492 составили соответственно 0.950 и 0.742 против 1.722 и 2.041 единиц ОП492, полученных для супернатантов после инкубации микросфер «БСА» с препаратами этих же сывороток. Активность исходных иммунных «анти-OmpF» и «анти-OmpC» сывороток, взятых в том же разведении, составила, в среднем, 1.803 и 2.102 единиц ОП492 соответственно.

На втором этапе исследования методом оптической ловушки были определены средние силы взаимодействия микросфер, обработанных поринами OmpF и OmpC, с соответствующими гомологичными антисыворотками. Их значения оказались близкими и составили соответственно 60 и 69 пН. При использовании подложки, обработанной нормальной мышиной сывороткой, не содержащей антител к указанным белкам, силы взаимодействия составили, в среднем, 40 и 49 пН соответственно (Таблица). Анализ гистограмм распределения сил разрыва для системы «OmpF–анти-OmpF» показал наличие двух выраженных пиков (в области 20-40 и 110-140 пН). Похожая закономерность характерна и для второй пары взаимодействующих молекул: в системе «OmpС–анти-OmpС» первый пик наблюдался в области 20-40 пН, второй – в области 110-150 пН (Рисунок).

Можно предположить, что высокоамплитудные отрывы соответствуют специфическим взаимодействиям антигена с иммунной сывороткой, а низкоамплитудные отрывы – неспецифическим взаимодействиям, обусловленным, очевидно, физико-химическими особенностями носителей (полистирола микросфер и стеклянной поверхности, обработанной аминирующим агентом – APTES). При использовании подложек, обработанных нормальной мышиной сывороткой, доля низкоамплитудных отрывов (до 40 пН) составила 57 и 48 % для микросфер «OmpF» и «OmpС» соответственно. При использовании чашек, покрытых сыворотками к указанным поринам,  доля низкоамплитудных отрывов оказалась существенно ниже - соответственно 30 и 40 %. При этом доля необратимых связываний микросфер «OmpF» с комплементарной и контрольной сыворотками составила  39.4 и 15.3%, а для микросфер «OmpC» -  39.2 и 17.9% (Таблица). 

 

         Как видно из представленных на рисунке данных, связывание исследуемых антигенов с антителами представляет собой сложный процесс, поскольку на всех гистограммах присутствует как низкоаплитудный, так и высокоамплитудный пики. В случае иммунной сыворотки, которая используется в эксперименте в небольшом разведении (1:10), наличие пика в области 20-40 пН может объясняться присутствием сывороточных белков, неспецифически взаимодействующих с БСА, привнесенным из блокирующего буфера в состав сенситина на микросферах. Тем не менее, преобладание доли необратимых связываний нагруженных исследуемыми антигенами микросфер с подложками, обработанными иммунными сыворотками, свидетельствует о том, что в сконструированной нами модельной системе специфические взаимодействия вносят значительный вклад в силу межмолекулярного связывания (Таблица).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что апробированные нами методические подходы, основанные на использовании  оптического пинцета, позволяют оценивать силовые характеристики межмолекулярного взаимодействия различных микробных антигенов и антител.

 

Исследования проведены в рамках темы НИР ИФ ФИЦ Коми НЦ УрО РАН FUUU-2022-0065 (№ 1021051201894-0)".

×

About the authors

Ilya Vladimirovich Konyshev

Federal State Budgetary Scientific Institution Institute of Physiology of the Komi Scientific Center of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences (Komi SC UB RAS); Vyatka State University

Email: konyshevil@yandex.ru

Candidate of Biological Sciences, Senior Researcher, Laboratory of Physiology of Prevention, Institute of Physics, Komi Scientific Center, UrO RAS.

Russian Federation, 50, Pervomaiskaya St., Syktyvkar, 167982, Russia; 36, Moskovskaya St., Kirov, 610000, Russia

Olga Daniilovna Novikova

Federal State Budgetary Scientific Institution Pacific Institute of Bioorganic Chemistry named after G.B. Elyakov of the Far East Branch of the Russian Academy of Sciences (IBC named after G.B. Elyakov FEB RAS)

Email: viktoria@piboc.dvo.ru

Doctor of Chemistry, Principal Scientist, Laboratory of molecular basis of Immunity

Russian Federation, 690022, Russia, Vladivostok, Prospekt 100 let Vladivostok, 159

Olga Yurievna Portnyagina

Federal State Budgetary Scientific Institution Pacific Institute of Bioorganic Chemistry named after G.B. Elyakov of the Far East Branch of the Russian Academy of Sciences (IBC named after G.B. Elyakov FEB RAS)

Email: o_vl@piboc.dvo.ru

Candidate of Biological Sciences, Senior Researcher, Laboratory of molecular basis of Immunity

Russian Federation, 690022, Russia, Vladivostok, Prospekt 100 let Vladivostok, 159

Andrey Anatolievich Byvalov

Federal State Budgetary Scientific Institution Institute of Physiology of the Komi Scientific Center of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences (Komi SC UB RAS); Vyatka State University

Author for correspondence.
Email: byvalov@nextmail.ru

МD, PhD, Professor, Senior Researcher of the Center of Excellence "Pharmaceutical Biotechnology" Vyatka State University, head of the Laboratory ofMicroЬial Physiology of the Institute of Physiology, Komi Scientific Center, UrO RAS.

Russian Federation, 50, Pervomaiskaya St., Syktyvkar, 167982, Russia; 36, Moskovskaya St., Kirov, 610000, Russia

References

  1. Nikaido H. Escherichia coli and Salmonella cellular and molecular biology. Outer membrane. Ed. Neidhardt F.C. ASMPressDC, 1996, pp. 29–47.
  2. Csonka L.N. Physiological and genetic responses of bacteria to osmotic stress. Microbiol. Rev., 1989, vol. 53, pp. 121–147.
  3. Liu X., Ferenci T. An analysis of multifactorial influences on the transcriptional control of ompF and ompC porin expression under nutrient limitation. Microbiology, 2001, vol. 147, pp. 2981–2989.
  4. Thanassi D.G., Cheng L.W., Nikaido H. Active efflux of bile salts by Escherichia coli. J Bacteriol., 1997, vol. 179, pp. 2512–2518.
  5. van Putten J.P., Duensing T.D., Carlson J. Gonococcal invasion of epithelial cells driven by P.IA, a bacterial ion channel with GTP binding properties. J. Exp. Med., 1998, vol. 188, pp. 941–952.
  6. Achouak W., Heulin T., Pages J.M. Multiple facets of bacterial porins. FEMS Microbiol. Lett., 2001, vol. 199, pp. 1–7.
  7. Duperthuy M., Binesse J., Roux F. Le, Romestand B., Caro A., Got P., Givaudan A., Mazel D., Bachère E., Destoumieux-Garzón D. The major outer membrane protein OmpU of Vibrio splendidus contributes to host antimicrobial peptide resistance and is required for virulence in the oyster Crassostrea gigas. Environ. Microbiol., 2010, vol. 12, pp. 951–963.
  8. Pompilio A., Scribano D., Sarshar M., Di Bonaventura G., Palamara A.T., Ambrosi C. Gram-Negative Bacteria Holding Together in a Biofilm: The Acinetobacter baumannii Way. Microorganisms, 2021, vol. 9, 1353.
  9. Leon-Velarde C.G., Happonen L., Pajunen M., Leskinen K., Kropinski A.M., Mattinen L., Rajtor M., Zur J., Smith D., Chen S., Nawaz A., Johnson R.P., Odumeru J.A., Griffiths M.W., Skurnik M. Yersinia enterocolitica-specific infection by Bacteriophages TG1 and ϕR1-RT is dependent on temperature-regulated expression of the phage host receptor OmpF. Appl Environ Microbiol., 2016, vol. 82, pp. 5340-5453.
  10. Galdiero S., Falanga A., Cantisani M., Tarallo R., Della Pepa M.E., D'Oriano V., Galdiero M. Microbe-host interactions: structure and role of Gram-negative bacterial porins. Curr. Protein Pept. Sci., 2012, vol. 13, pp. 843-854.
  11. Новикова О.Д., Федореева Л.И., Хоменко В.А., Портнягина О.Ю., Ермак И.М., Лихацкая Г.Н., Мороз С.В., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Влияние способа экстракции порообразующего белка из Yersinia pseudotuberculosis на его макромолекулярную организацию// Биоорганическая химия. 1993. Т. 19. № 5. C. 536-547.
  12. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970, vol. 227, pp. 680-685.
  13. Бывалов А.А., Конышев И.В., Новикова О.Д., Портнягина О.Ю., Белозеров В.С., Хоменко В.А., Давыдова В.Н. Адгезивность поринов OmpF и OmpC Yersinia pseudotuberculosis к макрофагам J774 // Биофизика. 2018. Т. 63. № 5. С. 913–922.

Supplementary files

There are no supplementary files to display.


Copyright (c) Konyshev I.V., Novikova O.D., Portnyagina O.Y., Byvalov A.A.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 64788 от 02.02.2016.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies