Immunochemical activity of Yersinia pseudotuberculosis ompF and ompC porins evaluated by optical trapping

Full Text

Введение

В настоящее время род Yersinia, включенный в семейство Yersiniaceae, включает 27 видов бактерий, три из которых — Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica и Y. pestis — патогенны для человека. Заболевания, вызываемые первыми двумя видами, протекают преимущественно в форме острого энтерита с поражением регионарных лимфоузлов и пейеровых бляшек кишечника. Энтеропатогенные представители рода Yersinia широко распространены в природных биотопах (почве, воде, растениях), некоторые из них являются зоонозными и обнаруживаются в организме рыб, земноводных и насекомых. Особенности персистенции иерсиний в условиях окружающей среды и те изменения, которые происходят в их клетках в процессе инфицирования теплокровных животных и человека, изучены недостаточно. Большую роль в этих процессах играют поверхностные антигены бактерий: липополисахарид и белки наружной мембраны.

Преобладающими (до 10⁵ копий на клетку) среди белков наружной мембраны грамотрицательных бактерий являются порины, которые относятся к группе трансмембранных интегральных белков, формирующих в бактериальной мембране бочонкообразную структуру с гидрофильной порой внутри [10]. Остатки гидрофобных аминокислот поринов, обращенные наружу, взаимодействуют с липидами бактериальной мембраны; в свою очередь, гидрофильные остатки обращены в полость канала, что обеспечивает трансмембранный перенос низкомолекулярных гидрофильных органических соединений и солей (нутриентов, антибиотиков, солей желчных кислот).

На примере Escherichia coli было показано, что уровень экспрессии генов поринов изменяется в зависимости от температуры, рН среды и осмолярности среды [4, 9]. Подобными свойствами обладают и клетки психротолерантного микроорганизма Yersinia pseudotuberculosis: в окружающей среде и при культивировании в диапазоне температур (от +4 до +10°С) в клеточной стенке данного микроба синтезируется преимущественно порин OmpF. При повышении температуры до +37°С, например в условиях избытка нутриентов внутри теплокровного организма, увеличивается продукция белка OmpC, участвующего в формировании пор меньшего размера. Предполагается, что изменение типа неспецифических поринов в бактериальной мембране и связанное с этим изменение ее проницаемости (или эффективности прохождения нутриентов через наружную мембрану) представляет собой один из механизмов адаптации бактерий к изменению условий окружающей среды [9]. Кроме того, порин OmpC обеспечивает дополнительную защиту иерсиний от действия желчных кислот, способствуя их выживанию в тонком кишечнике [12].

Показано участие поринов грамотрицательных бактерий в процессах адгезии, инвазии и формировании устойчивости к компонентам сыворотки [3, 5, 13]. Сообщается также о вкладе поринов ряда бактерий в образование биопленок [11], об их возможном участии в рецепции бактериофагов [8] и в стимуляции синтеза провоспалительных цитокинов в процессе развития иммунного ответа [6].

Цель настоящего исследования состояла в определении методом оптической ловушки силовых характеристик взаимодействия молекул неспецифических поринов OmpF и OmpC Y. pseudotuberculosis с сыворотками, содержащими гомологичные антитела.

Материалы и методы

В работе использовали штамм Y. pseudotuberculosis серотипа 1b (№ 474), полученный из коллекции ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб».

Порины OmpF и OmpC Y. pseudotuberculosis получали из микробной массы, выращенной, соответственно, при +6…+8 и +37°С по ранее описанной методике [2]. Степень очистки полученных образцов поринов анализировали с помощью SDS, ПААГ-электрофореза по методу Лэммли [7]. По данным электрофореза, использованные в эксперименте образцы белков представляли собой гомогенные препараты. До использования в эксперименте препараты поринов хранили при температуре 4–6°С в фосфатном буферном растворе (ФБР), рН 7,2–7,4, содержащем 0,1% SDS. Cенсибилизацию микросфер препаратами поринов, а также валидацию факта указанной сенсибилизации проводили по методикам, описанным в работе [1].

Мышиные антисыворотки к поринам получали, как описано в работе [1]. Титры антител в полученных антипориновых сыворотках определяли с помощью метода непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА), используя микропланшеты Costar (США). Титры иммунных сывороток к поринам OmpF и OmpC составляли 1:62 400 и 1:124 800 соответственно. Нормальную, интактную сыворотку получали от неиммунных мышей. Непосредственно перед использованием препараты сывороток центрифугировали при 10 000g в течение 20 мин. Все эксперименты с животными были проведены в соответствии с положениями Директивы № 2010/63/ЕС Европейского парламента и Совета Европейского Союза «О защите животных, использующихся для научных целей».

Для сенсибилизации подложек сыворотками использовали пластиковые чашки «Fluorodish» (WPI, Германия) со стеклянным дном, которые предварительно подвергали процедуре аминирования. В отдельной емкости смешивали 10 мкл триэтиламина (Реахим, Россия) и 30 мкл 3-аминопропил-триэтоксисилана (APTES) (Sigma Aldrich, США), после чего помещали ее вместе с чашками в эксикатор и выдерживали в атмосфере аргона в течение 1,5 ч. По окончании процедуры на поверхность чашек наносили последовательно 0,6 мкл EDC (Sigma Aldrich, США), 900 мкл ФБР, 30 мкл 0,46%-ного раствора N-гидроксисукцинимида (SigmaAldrich, США) и 100 мкл каждой из трех сывороток (в разведении 1:10). Инкубировали чашки в течение ночи при температуре 4–6°С, затем пятикратно промывали деионизованной водой и хранили в закрытом эксикаторе при температуре 4–6°С.

Для оценки сил взаимодействия в модельной системе «микросфера–подложка» использовали лазерный пинцет JPK Nanotracker™ (JPK, Германия) на основе иттрий-гранатового источника инфракрасного излучения (λ = 1064 нм). Непосредственно перед проведением эксперимента в чашку «Flurodish», сенсибилизированную одним из трех сывороточных препаратов, приливали 2,5 мл ФБР и 2–4 мкл суспензии микросфер. Тщательно перемешивали содержимое чашки и устанавливали ее на термостатируемую платформу с температурой +37°С. Далее производили калибровку прибора с использованием программы «JPK Calibration Manager» с учетом температуры раствора, диаметра микросфер и вязкости раствора (0,73 сПз). Определенное таким способом среднее значение коэффициента чувствительности квадрантного детектора составило 6,4 мВ/нм, коэффициента жесткости — 0,26 пН/нм.

Методика оценки сил межмолекулярного взаимодействия включала захват микросферы в фокус лазерной ловушки при мощности лазера 2,0 Вт. После повторной калибровки подводили микросферу ко дну чашки таким образом, чтобы расстояние между ними составляло 1,0–1,5 мкм. С помощью пьезостолика прецизионно перемещали чашку в направлении неподвижной микросферы с шагом 50 нм до момента их соприкосновения, который фиксировали по трем последовательным скачкам на хронограмме сигнала. Спустя 1 с после остановки запускали процесс отведения пьезостолика в обратном направлении в полуавтоматическом режиме со скоростью около 150 нм/с. Момент разрыва связи детектировали по скачкообразному изменению сигнала на хронограмме.

Первичные данные сохраняли в виде текстовых файлов, которые затем обрабатывали с использованием специализированного программного обеспечения JPK Processing. Статистический анализ проводили с использованием пакетов программ MatLab 7.0 и Statistica 12.

Результаты и обсуждение

На первом этапе исследования иммунохимически был подтвержден факт сенсибилизации полистирольных микросфер препаратами поринов. С помощью метода ТИФА были определены средние значения оптической плотности (ОП₄₉₂) растворов в лунках с внесенными «анти-OmpF» и «анти-OmpC» сыворотками, полученными после инкубации с микросферами, сенсибилизированными гомологичными антигенами. Измеренные значения ОП₄₉₂ составили соответственно 0,950 и 0,742 против 1,722 и 2,041 единиц ОП₄₉₂, полученных для супернатантов после инкубации микросфер «БСА» с препаратами этих же сывороток. Активность исходных иммунных «анти-OmpF» и «анти-OmpC» сывороток, взятых в том же разведении, составила в среднем 1,803 и 2,102 единиц ОП₄₉₂ соответственно.

На втором этапе исследования методом оптической ловушки были определены средние силы взаимодействия микросфер, обработанных поринами OmpF и OmpC, с соответствующими гомологичными антисыворотками. Их значения оказались близкими и составили соответственно 60 и 69 пН. При использовании подложки, обработанной нормальной мышиной сывороткой, не содержащей антител к указанным белкам, силы взаимодействия составили в среднем 40 и 49 пН соответственно (табл.). Анализ гистограмм распределения сил разрыва для системы «OmpF–анти-OmpF» показал наличие двух выраженных пиков (в области 20–40 и 110–140 пН). Похожая закономерность характерна и для второй пары взаимодействующих молекул: в системе «OmpС–анти-OmpС» первый пик наблюдался в области 20–40 пН, второй — в области 110–150 пН (рис.).

 

Рисунок. Гистограммы распределения сил разрыва в системе «микросфера–подложка»

Figure. Histograms of rupture force distribution in the “microsphere–glass surface” system

Примечание. А —«OmpF–анти-OmpF», Б — «OmpF–нормальная сыворотка», В — «OmpС–анти-OmpС», Г — «OmpC–нормальная сыворотка».

Note. A — “OmpF–anti-OmpF”, B — “OmpF–normal serum”, C — “OmpC–anti-OmpC”, D — “OmpC–normal serum”.

 

Можно предположить, что высокоамплитудные отрывы соответствуют специфическим взаимодействиям антигена с иммунной сывороткой, а низкоамплитудные отрывы — неспецифическим взаимодействиям, обусловленным, очевидно, физико-химическими особенностями носителей (полистирола микросфер и стеклянной поверхности, обработанной аминирующим агентом — APTES). При использовании подложек, обработанных нормальной мышиной сывороткой, доля низкоамплитудных отрывов (до 40 пН) составила 57 и 48% для микросфер «OmpF» и «OmpС» соответственно. При использовании чашек, покрытых сыворотками к указанным поринам, доля низкоамплитудных отрывов оказалась существенно ниже — соответственно 30 и 40%. При этом доля необратимых связываний микросфер «OmpF» с комплементарной и контрольной сыворотками составила 39,4 и 15,3%, а для микросфер «OmpC» — 39,2 и 17,9% (табл.).

 

Таблица. Силы разрыва связей в системе «микросфера–подложка» для различных комбинаций антигенов и сывороток

Table. Rupture force distribution in the “microsphere–glass surface” system for varying antigen-serum combinations

Показатель Parameter	Значение показателя для модельной системы Parameter magnitude in model system
	OmpF– анти-OmpF OmpF– anti-OmpF	OmpF–нормальная сыворотка OmpF–normal serum	OmpС– анти-OmpС OmpС– anti-OmpС	OmpC–нормальная сыворотка OmpC–normal serum
Fmean, пН	60±41*	40±31*	69±41**	49±39**
Доля необратимых связываний, % Proportion of irreversible bindings, %	39,4	15,3	39,2	17,9
Доля «нулевых» опытов, % Proportion of «zero» bindings, %	17,9	46,8	16,5	41,9
N	471	326	450	375

Примечание. Fmean — среднее значение силы разрываемой связи; *, ** — различия в парах статистически достоверны для р > 0,99; под «нулевым» опытом понимается отсутствие скачка сигнала на хронограмме при отведении пьезостолика.

Note. Fmean — mean value of the ruptured bond strength; *, ** — significant pairwise differences for p > 0.99; «zero» binding stands for no signal rise upon piezo table removal.

 

Как видно из представленных на рисунке данных, связывание исследуемых антигенов с антителами представляет собой сложный процесс, поскольку на всех гистограммах присутствует как низкоаплитудный, так и высокоамплитудный пики. В случае иммунной сыворотки, которая используется в эксперименте в небольшом разведении (1:10), наличие пика в области 20–40 пН может объясняться присутствием сывороточных белков, неспецифически взаимодействующих с БСА, привнесенным из блокирующего буфера в состав сенситина на микросферах. Тем не менее преобладание доли необратимых связываний нагруженных исследуемыми антигенами микросфер с подложками, обработанными иммунными сыворотками, свидетельствует о том, что в сконструированной нами модельной системе специфические взаимодействия вносят значительный вклад в силу межмолекулярного связывания (табл.).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что апробированные нами методические подходы, основанные на использовании оптического пинцета, позволяют оценивать силовые характеристики межмолекулярного взаимодействия различных микробных антигенов и антител.

About the authors

Ilya V. Konyshev

Institute of Physiology of the Komi Scientific Center of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences; Russian Federation b Vyatka State University

Email: konyshevil@yandex.ru

PhD (Biology), Senior Researcher, Laboratory of Microbial Physiology; Associate Professor, Department of Biotechnology

Russian Federation, Syktyvkar; 610000, Kirov, Moskovskaya str., 36

Olga D. Novikova

Pacific Institute of Bioorganic Chemistry named after G.B. Elyakov of the Far East Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: viktoria@piboc.dvo.ru

PhD, MD (Chemistry), Head Researcher, Laboratory of Molecular Basis of Antibacterial Immunity

Russian Federation, Vladivostok

Olga Yu. Portnyagina

Pacific Institute of Bioorganic Chemistry named after G.B. Elyakov of the Far East Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: o_vl@piboc.dvo.ru

PhD (Biology), Senior Researcher, Laboratory of Molecular Basis of Antibacterial Immunity

Russian Federation, Vladivostok

Andrey A. Byvalov

Institute of Physiology of the Komi Scientific Center of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences; Vyatka State University

Author for correspondence.
Email: byvalov@nextmail.ru

PhD, MD (Medicine), Professor, Senior Researcher, Center of Excellence «Pharmaceutical Biotechnology»; Head of the Laboratory of Microbial Physiology

Russian Federation, Syktyvkar; 610000, Kirov, Moskovskaya str., 36

References

Supplementary files