Полость рта как локус для формирования гетерогенной бактериальной популяции у пациентов с муковисцидозом

Полный текст

Введение

Муковисцидоз — самое распространенное аутосомно-рецессивное генетически детерминированное заболевание. В последние десятилетия продолжительность и качество жизни больных значительно возросли, что позволило ему выйти далеко за рамки педиатрической патологии. В связи с оптимизацией проводимой терапии и ранней диагностики в России и мире отмечается увеличение доли подростков и взрослых пациентов с муковисцидозом, что, в свою очередь, раскрывает перед врачами новые аспекты осложнений этого заболевания. По-прежнему одной из основных причин ранней летальности являются бактериальные осложнения бронхолегочной системы [1]. На сегодняшний день хорошо известен вклад основных бактериальных патогенов, имеющих ключевое значение при муковисцидозе, в частности инфекции, ассоциированной с Pseudomonas aeruginosa [2]. Но легкие это не единственный биотоп для колонизации. Многочисленными исследованиями показана роль параназальных синусов как локуса для первичного попадания и последующей адаптации штаммов [43]. В то же время, описанию потенциальной роли полости рта в качестве резервуара для бактериальной микрофлоры посвящены лишь единичные публикации [3]. Необходимость и значимость регулярного стоматологического и микробиологического обследования полости рта не регламентирована действующими рекомендациями. Исходя из этого, вероятная роль полости рта как локуса для адаптации и последующей диверсификации клинически значимых патогенов не учитывается при оказании медицинской помощи пациентам с муковисцидозом. Это может быть одним из ключевых факторов, объясняющих неэффективность стандартных схем антисинегнойной эрадикационной терапии. В качестве иллюстрации этого феномена нами приводится описание результатов клинико-микробиологического обследования пациента с муковисцидозом, имеющего интермиттирующие высевы синегнойной инфекции из легких в анамнезе на протяжении жизни.

Материалы и методы

Пациент А., 2007 г. рожд., мужчина. При проведении планового стоматологического обследования не выявлено патологии, полость рта санирована. Во время осмотра у пациента был произведен забор проб биоматериала из восьми локусов полости рта. Стерильными пластиковыми зондами с ватным тампоном вращательным движением собирался материал с поверхности слизистой оболочки щеки и с поверхности спинки языка; с щечной поверхности первых моляров верхней челюсти и язычной поверхности центральных резцов нижней челюсти стоматологическим скалером было произведено снятие минерализованных и неминерализованных зубных отложений; выделенный из выводных протоков правых и левых околоушных и подъязычных слюнных желез секрет собирался стерильными пластиковыми зондами; эндодонтическим бумажным штифтом размера 15.02 производился сбор десневой жидкости. Все собранные пробы биоматериала были помещены в предварительно промаркированные пробирки с жидкой тиогликолевой средой и доставлены в изотермических условиях в лабораторию в течение 20 мин после сбора.

В лаборатории посев каждой пробы осуществлялся на следующие питательные среды: на поверхность двух чашек с 5% кровяным агаром с дефибринированной бараньей кровью (HiMedia, Индия), двух чашек с универсальной хромогенной средой (BioRad, США), чашек с селективной средой для Burkholderia cepacia (OFPBL-агар) с бацитрацином и полимиксина сульфатом (HiMedia, Индия), Veilonella-агаром (HiMedia, Индия), агаром для анаэробов (HiMedia, Индия), Clostridium-агаром (HiMedia, Индия), агаром для лактобактерий (HiMedia, Индия), агаром для бифидобактерий (HiMedia, Индия) с использованием техники посева «штрихом». На поверхность чашек с агаром Сабуро с хлорамфениколом производился посев гомогенизированного материала методом бляшек с последующей инкубацией при 28°С до 14 сут с ежедневными просмотрами посевов. Затем по одной засеянной чашке с 5% кровяным агаром с дефибринированной бараньей кровью и с универсальной хромогенной средой, а также чашка с селективной средой для Burkholderia cepacia (OFPBL-агар) с бацитрацином и полимиксина сульфатом инкубировались в термостате при температуре 37°С в течение 24–48 ч с ежедневным просмотром посевов. При этом засеянные чашки с селективной средой для Burkholderia cepacia (OFPBL-агар) с бацитрацином и полимиксина сульфатом инкубировались в аэробных условиях 24–48 ч при температуре 37°С, далее инкубировались до 14 сут при температуре 28°С с ежедневным просмотром посевов. По одной засеянной чашке с 5% кровяным агаром с дефибринированной бараньей кровью и с универсальной хромогенной средой, а также чашки с Veilonella-агаром, агаром для анаэробов, Clostridium-агаром, агаром для лактобактерий, агаром для бифидобактерий инкубировались в анаэробных условиях 96–120 ч при температуре 37°С.

Идентификация выделенных штаммов производилась с помощью MALDI-ToF масс-спектрометра (Bruker, Германия). Со штаммов Pseudomonas aeruginosa, выделенных из локусов полости рта, а также параллельно из мокроты пациента были сняты белковые спектры методом экстракции муравьиной кислотой. Последующая визуализация протеомного сопоставления полученных масс-спектров проводилась с использованием программного обеспечения MALDI Biotyper 3.0 (Bruker, Германия). В отношении исследуемых штаммов был проведен расчет составного индекса корреляции (Composite Correlation Index — CCI).

Результаты и обсуждение

В результате проведенного микробиологического исследования у пациента из полости рта было выделено 34 штамма микроорганизмов, среди которых были представители пародонтопатогенных бактерий, в частности Actinomyces odontolyticus («пурпурный» пародонтопатогенный комплекс), Streptococcus gordonii, Streptococcus sanguinis, Streptococcus mitis («желтый» пародонтопатогенный комплекс), что расценивается как фактор риска по развитию заболеваний пародонта в дальнейшем.

Кроме этого, был получен рост девяти штаммов P. aeruginosa в посевах из пяти локусов — с поверхности десневой борозды (штамм № 2), устья протоков правых подъязычной (штаммы № 7 и № 8) и околоушной слюнных желез (штамм № 6), поверхности языка (штаммы № 11 и № 12) и слизистой оболочки щек (штаммы № 9 и № 10). В мокроте пациента был получен рост гетерогенной популяции P. aeruginosa, включающей в себя мукоидный штамм (штамм № 4), чувствительный ко всем тестируемым препаратам; немукоидный штамм (штамм № 3), с изолированной устойчивостью к имипенему; а также штамм с морфотипом мелких колоний (штамм № 5), чувствительный ко всем тестируемым препаратам. Штамм, выделенный с поверхности десневой борозды, был мукоидным и сохранял чувствительность ко всем антибиотикам. С устья протока подъязычной слюнной железы выделена гетерогенная популяция возбудителя в виде смеси чувствительного мукоидного беспигментного морфотипа и немукоидного пигментированного клона. Со слизистой оболочки языка также выделена смесь колониальных морфотипов чувствительного беспигментного мукоидного и немукоидного, с изолированной устойчивостью к ципрофлоксацину. Со слизистой оболочки щеки также получена морфологически однородная смесь двух мукоидных морфотипов с гетерорезистентностью к имипенему.

Учитывая широкий спектр выделенных клонов, демонстрирующих как морфологические различия, так и отличающихся по антибиотикорезистентности, нами было проведен анализ однородности культур на основании белковых профилей (масс-спектров). Было выполнено сопоставление имеющихся масс-спектров с применением статистических расчетов с последующей визуализацией в виде CCI-матрицы (рис., вклейка, с. II). При использовании указанного метода возможно выявление степени совпадения штаммов от полной идентичности (темно-красный цвет) до отсутствия совпадения (синий цвет). Значение CCI Score может находиться в пределах значений от 0 до 1, при этом 0 определяется как полное отсутствие совпадений, а 1 — полное совпадение или идентичность штаммов. Информация о номерах штаммов, взятых в анализ, представлена в таблице. Пары штаммов с показателями CCI Score более 0,800 расценивались как близкородственные в соответствии с рекомендациями производителя программного обеспечения.

 

Таблица. Характеристика штаммов P. aeruginosa, использованных для построения CCI-матрицы

Table. Characteristics of the P. aeruginosa strains used to construct the CCI-matrix

Номер штамма Strain number	Описание штамма P. aeruginosa и локуса его выделения Description of the P. aeruginosa strain and relevant site of isolation
1	Контрольный штамм P. aeruginosa ATCC 27853 Control strain of P. aeruginosa ATCC 27853
2	Немукоидный штамм, выделенный с поверхности десневой борозды A non-mucoid strain isolated from the surface of the gingival crest
3	Немукоидный штамм с изолированной устойчивостью к имипенему, выделенный из мокроты A sputum non-mucoid strain with isolated imipenem resistance
4	Мукоидный штамм, выделенный из мокроты Mucoid strain isolated from sputum
5	Немукоидный штамм с морфотипом мелких колоний, выделенный из мокроты A non-mucoid strain with the morphotype of small colonies isolated from sputum
6	Немукоидный штамм, выделенный из устья правой околоушной слюной железы A non-mucoid strain isolated from orifice of the right parotid salivary gland
7	Мукоидный штамм, выделенный из устья правой подъязычной слюной железы Mucoid strain isolated from orifice of the right sublingual salivary gland
8	Немукоидный штамм, выделенный из устья правой подъязычной слюной железы A non-mucoid strain isolated from orifice of the right sublingual salivary gland
9	Немукоидный штамм, выделенный со слизистой оболочки щеки A non-mucoid strain isolated from the cheek mucosa
10	Немукоидный штамм, выделенный со слизистой оболочки щеки с изолированной устойчивостью к имипенему A non-mucoid strain obtained from cheek mucosa with isolated imipenem resistance
11	Немукоидный штамм, выделенный с поверхности языка с изолированной устойчивостью к ципрофлоксацину A non-mucoid strain obtained from the surface of the tongue with isolated ciprofloxacin resistance
12	Мукоидный штамм, выделенный с поверхности языка Mucoid strain isolated from the surface of the tongue

 

В результате проведенного исследования показано, что в полости рта пациента сформировано гетерогенное бактериальное сообщество, что подтверждается результатами сравнения масс-спектров при построении и анализе CCI-матрицы в виде «тепловой карты».

При анализе масс-спектров культур, выделенных из мокроты, были получены следующие результаты. Штамм № 4 имеет близкое родство с другими штаммами, выделенными из мокроты, однако между штаммами № 3 и № 5 уровень родства оказался ниже 0,800, что позволяет предположить, их формирование и адаптацию в различных микроэкологических условиях.

Штаммы, выделенные из одного локуса слизистой оболочки полости рта, оказались гетерогенными по масс-спектрам. Попарные значения CCI Score для мукоидного (штамм № 7) и немукоидного (штамм № 8) штаммов, выделенных из устья правой подъязычной слюной железы; для двух немукоидных штаммов (штаммы № 9 и № 10), выделенных со слизистой оболочки щеки, а также мукоидного (штамм № 12) и немукоидного (штамм № 11) штаммов, выделенных с поверхности языка, оказались ниже 0,800.

При сравнении штаммов, выделенных из мокроты со штаммами из полости рта, были выявлены следующие закономерности: штамм № 3 на основании сравнений масс-спектров оказался родственным со штаммами, выделенными из устья правой околоушной слюной железы (штамм № 6) и с языка (штамм № 12). Штамм № 4, выделенный из мокроты близок по масс-спектрам со штаммами, выделенными с поверхности языка (№ 11 и № 12). Штамм № 5, выделенный из мокроты, близок по масс-спектрам к штаммам, выделенным с поверхности десневой борозды (штамм № 2), немукоидными штаммами, выделенными из устья правой подъязычной слюной железы (штамм № 8) и с поверхности языка (штамм № 11).

Наиболее отличающимся по своим масс-спектрам оказался 9 изолят, не имеющий совпадений по масс-спектрам не только от выделенных из мокроты, но и из локусов полости рта штаммов.

Таким образом выявлен высокий уровень гетерогенности исследуемой популяции, при этом только для отдельных пар изолятов выявлен высокий уровень значений CCI Score.

Заключение

Полость рта пациентов с муковисцидозом может быть одним из локусов для первичного попадания, адаптации и последующего формирования гетерогенной популяции бактерий, имеющих доказанное клиническое значение при данной патологии. Представители микробиологического сообщества посредством микроаспирации могут реколонизировать трахеобронхиальное дерево, тем самым способствуя поддержанию инфекционного воспаления в нижних дыхательных путях и частично объясняя неэффективность небулайзерной антибактериальной терапии. В то же время и клоны, адаптировавшиеся в легочной ткани, при откашливании мокроты способны реколонизировать локусы полости рта.

Было показано, что штаммы, выделенные из мокроты, оказались более однородными, чем культуры, выявленные со слизистой оболочки полости рта. При этом в случае выделения нескольких морфотипов P. aeruginosa из одного локуса в полости рта, близкородственных штаммов выделено не было. Таким образом полость рта является более значимой с точки зрения микробной диссоциации, что может быть обусловлено более разнообразными микроэкологическими условиями. Полученные данные актуализируют вопрос о необходимости комплексного микробиологического подхода при проведении обследования пациентов для повышения эффективности эрадикационных мероприятий при муковисцидозе, что следует учитывать клиницистам и микробиологам в своей практической деятельности.

Об авторах

Ольга Владимировна Кондратенко

ФГБОУ ВО Самарский государственный медицинский университет Минздрава России

Email: o.v.kondratenko@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-7750-9468
SPIN-код: 9605-3821
Scopus Author ID: 5719485453
ResearcherId: DNW-4596-2022

д.м.н., доцент кафедры общей и клинической микробиологии, иммунологии и аллергологии

Россия, 443079, Самара, ул. Гагарина, 18

Мария Сергеевна Сабурова

ФГБОУ ВО Самарский государственный медицинский университет Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: m.s.saburova@samsmu.ru

ассистент кафедры терапевтической стоматологии

Россия, 443079, Самара, ул. Гагарина, 18

Список литературы

Дополнительные файлы