The oral cavity as a site for developing a heterogeneous bacterial population in patients with cystic fibrosis

Full Text

Введение

Муковисцидоз — самое распространенное аутосомно-рецессивное генетически детерминированное заболевание. В последние десятилетия продолжительность и качество жизни больных значительно возросли, что позволило ему выйти далеко за рамки педиатрической патологии. В связи с оптимизацией проводимой терапии и ранней диагностики в России и мире отмечается увеличение доли подростков и взрослых пациентов с муковисцидозом, что, в свою очередь, раскрывает перед врачами новые аспекты осложнений этого заболевания. По-прежнему одной из основных причин ранней летальности являются бактериальные осложнения бронхолегочной системы [1]. На сегодняшний день хорошо известен вклад основных бактериальных патогенов, имеющих ключевое значение при муковисцидозе, в частности инфекции, ассоциированной с Pseudomonas aeruginosa [2]. Но легкие это не единственный биотоп для колонизации. Многочисленными исследованиями показана роль параназальных синусов как локуса для первичного попадания и последующей адаптации штаммов [43]. В то же время, описанию потенциальной роли полости рта в качестве резервуара для бактериальной микрофлоры посвящены лишь единичные публикации [3]. Необходимость и значимость регулярного стоматологического и микробиологического обследования полости рта не регламентирована действующими рекомендациями. Исходя из этого, вероятная роль полости рта как локуса для адаптации и последующей диверсификации клинически значимых патогенов не учитывается при оказании медицинской помощи пациентам с муковисцидозом. Это может быть одним из ключевых факторов, объясняющих неэффективность стандартных схем антисинегнойной эрадикационной терапии. В качестве иллюстрации этого феномена нами приводится описание результатов клинико-микробиологического обследования пациента с муковисцидозом, имеющего интермиттирующие высевы синегнойной инфекции из легких в анамнезе на протяжении жизни.

Материалы и методы

Пациент А., 2007 г. рожд., мужчина. При проведении планового стоматологического обследования не выявлено патологии, полость рта санирована. Во время осмотра у пациента был произведен забор проб биоматериала из восьми локусов полости рта. Стерильными пластиковыми зондами с ватным тампоном вращательным движением собирался материал с поверхности слизистой оболочки щеки и с поверхности спинки языка; с щечной поверхности первых моляров верхней челюсти и язычной поверхности центральных резцов нижней челюсти стоматологическим скалером было произведено снятие минерализованных и неминерализованных зубных отложений; выделенный из выводных протоков правых и левых околоушных и подъязычных слюнных желез секрет собирался стерильными пластиковыми зондами; эндодонтическим бумажным штифтом размера 15.02 производился сбор десневой жидкости. Все собранные пробы биоматериала были помещены в предварительно промаркированные пробирки с жидкой тиогликолевой средой и доставлены в изотермических условиях в лабораторию в течение 20 мин после сбора.

В лаборатории посев каждой пробы осуществлялся на следующие питательные среды: на поверхность двух чашек с 5% кровяным агаром с дефибринированной бараньей кровью (HiMedia, Индия), двух чашек с универсальной хромогенной средой (BioRad, США), чашек с селективной средой для Burkholderia cepacia (OFPBL-агар) с бацитрацином и полимиксина сульфатом (HiMedia, Индия), Veilonella-агаром (HiMedia, Индия), агаром для анаэробов (HiMedia, Индия), Clostridium-агаром (HiMedia, Индия), агаром для лактобактерий (HiMedia, Индия), агаром для бифидобактерий (HiMedia, Индия) с использованием техники посева «штрихом». На поверхность чашек с агаром Сабуро с хлорамфениколом производился посев гомогенизированного материала методом бляшек с последующей инкубацией при 28°С до 14 сут с ежедневными просмотрами посевов. Затем по одной засеянной чашке с 5% кровяным агаром с дефибринированной бараньей кровью и с универсальной хромогенной средой, а также чашка с селективной средой для Burkholderia cepacia (OFPBL-агар) с бацитрацином и полимиксина сульфатом инкубировались в термостате при температуре 37°С в течение 24–48 ч с ежедневным просмотром посевов. При этом засеянные чашки с селективной средой для Burkholderia cepacia (OFPBL-агар) с бацитрацином и полимиксина сульфатом инкубировались в аэробных условиях 24–48 ч при температуре 37°С, далее инкубировались до 14 сут при температуре 28°С с ежедневным просмотром посевов. По одной засеянной чашке с 5% кровяным агаром с дефибринированной бараньей кровью и с универсальной хромогенной средой, а также чашки с Veilonella-агаром, агаром для анаэробов, Clostridium-агаром, агаром для лактобактерий, агаром для бифидобактерий инкубировались в анаэробных условиях 96–120 ч при температуре 37°С.

Идентификация выделенных штаммов производилась с помощью MALDI-ToF масс-спектрометра (Bruker, Германия). Со штаммов Pseudomonas aeruginosa, выделенных из локусов полости рта, а также параллельно из мокроты пациента были сняты белковые спектры методом экстракции муравьиной кислотой. Последующая визуализация протеомного сопоставления полученных масс-спектров проводилась с использованием программного обеспечения MALDI Biotyper 3.0 (Bruker, Германия). В отношении исследуемых штаммов был проведен расчет составного индекса корреляции (Composite Correlation Index — CCI).

Результаты и обсуждение

В результате проведенного микробиологического исследования у пациента из полости рта было выделено 34 штамма микроорганизмов, среди которых были представители пародонтопатогенных бактерий, в частности Actinomyces odontolyticus («пурпурный» пародонтопатогенный комплекс), Streptococcus gordonii, Streptococcus sanguinis, Streptococcus mitis («желтый» пародонтопатогенный комплекс), что расценивается как фактор риска по развитию заболеваний пародонта в дальнейшем.

Кроме этого, был получен рост девяти штаммов P. aeruginosa в посевах из пяти локусов — с поверхности десневой борозды (штамм № 2), устья протоков правых подъязычной (штаммы № 7 и № 8) и околоушной слюнных желез (штамм № 6), поверхности языка (штаммы № 11 и № 12) и слизистой оболочки щек (штаммы № 9 и № 10). В мокроте пациента был получен рост гетерогенной популяции P. aeruginosa, включающей в себя мукоидный штамм (штамм № 4), чувствительный ко всем тестируемым препаратам; немукоидный штамм (штамм № 3), с изолированной устойчивостью к имипенему; а также штамм с морфотипом мелких колоний (штамм № 5), чувствительный ко всем тестируемым препаратам. Штамм, выделенный с поверхности десневой борозды, был мукоидным и сохранял чувствительность ко всем антибиотикам. С устья протока подъязычной слюнной железы выделена гетерогенная популяция возбудителя в виде смеси чувствительного мукоидного беспигментного морфотипа и немукоидного пигментированного клона. Со слизистой оболочки языка также выделена смесь колониальных морфотипов чувствительного беспигментного мукоидного и немукоидного, с изолированной устойчивостью к ципрофлоксацину. Со слизистой оболочки щеки также получена морфологически однородная смесь двух мукоидных морфотипов с гетерорезистентностью к имипенему.

Учитывая широкий спектр выделенных клонов, демонстрирующих как морфологические различия, так и отличающихся по антибиотикорезистентности, нами было проведен анализ однородности культур на основании белковых профилей (масс-спектров). Было выполнено сопоставление имеющихся масс-спектров с применением статистических расчетов с последующей визуализацией в виде CCI-матрицы (рис., вклейка, с. II). При использовании указанного метода возможно выявление степени совпадения штаммов от полной идентичности (темно-красный цвет) до отсутствия совпадения (синий цвет). Значение CCI Score может находиться в пределах значений от 0 до 1, при этом 0 определяется как полное отсутствие совпадений, а 1 — полное совпадение или идентичность штаммов. Информация о номерах штаммов, взятых в анализ, представлена в таблице. Пары штаммов с показателями CCI Score более 0,800 расценивались как близкородственные в соответствии с рекомендациями производителя программного обеспечения.

 

Таблица. Характеристика штаммов P. aeruginosa, использованных для построения CCI-матрицы

Table. Characteristics of the P. aeruginosa strains used to construct the CCI-matrix

Номер штамма Strain number	Описание штамма P. aeruginosa и локуса его выделения Description of the P. aeruginosa strain and relevant site of isolation
1	Контрольный штамм P. aeruginosa ATCC 27853 Control strain of P. aeruginosa ATCC 27853
2	Немукоидный штамм, выделенный с поверхности десневой борозды A non-mucoid strain isolated from the surface of the gingival crest
3	Немукоидный штамм с изолированной устойчивостью к имипенему, выделенный из мокроты A sputum non-mucoid strain with isolated imipenem resistance
4	Мукоидный штамм, выделенный из мокроты Mucoid strain isolated from sputum
5	Немукоидный штамм с морфотипом мелких колоний, выделенный из мокроты A non-mucoid strain with the morphotype of small colonies isolated from sputum
6	Немукоидный штамм, выделенный из устья правой околоушной слюной железы A non-mucoid strain isolated from orifice of the right parotid salivary gland
7	Мукоидный штамм, выделенный из устья правой подъязычной слюной железы Mucoid strain isolated from orifice of the right sublingual salivary gland
8	Немукоидный штамм, выделенный из устья правой подъязычной слюной железы A non-mucoid strain isolated from orifice of the right sublingual salivary gland
9	Немукоидный штамм, выделенный со слизистой оболочки щеки A non-mucoid strain isolated from the cheek mucosa
10	Немукоидный штамм, выделенный со слизистой оболочки щеки с изолированной устойчивостью к имипенему A non-mucoid strain obtained from cheek mucosa with isolated imipenem resistance
11	Немукоидный штамм, выделенный с поверхности языка с изолированной устойчивостью к ципрофлоксацину A non-mucoid strain obtained from the surface of the tongue with isolated ciprofloxacin resistance
12	Мукоидный штамм, выделенный с поверхности языка Mucoid strain isolated from the surface of the tongue

 

В результате проведенного исследования показано, что в полости рта пациента сформировано гетерогенное бактериальное сообщество, что подтверждается результатами сравнения масс-спектров при построении и анализе CCI-матрицы в виде «тепловой карты».

При анализе масс-спектров культур, выделенных из мокроты, были получены следующие результаты. Штамм № 4 имеет близкое родство с другими штаммами, выделенными из мокроты, однако между штаммами № 3 и № 5 уровень родства оказался ниже 0,800, что позволяет предположить, их формирование и адаптацию в различных микроэкологических условиях.

Штаммы, выделенные из одного локуса слизистой оболочки полости рта, оказались гетерогенными по масс-спектрам. Попарные значения CCI Score для мукоидного (штамм № 7) и немукоидного (штамм № 8) штаммов, выделенных из устья правой подъязычной слюной железы; для двух немукоидных штаммов (штаммы № 9 и № 10), выделенных со слизистой оболочки щеки, а также мукоидного (штамм № 12) и немукоидного (штамм № 11) штаммов, выделенных с поверхности языка, оказались ниже 0,800.

При сравнении штаммов, выделенных из мокроты со штаммами из полости рта, были выявлены следующие закономерности: штамм № 3 на основании сравнений масс-спектров оказался родственным со штаммами, выделенными из устья правой околоушной слюной железы (штамм № 6) и с языка (штамм № 12). Штамм № 4, выделенный из мокроты близок по масс-спектрам со штаммами, выделенными с поверхности языка (№ 11 и № 12). Штамм № 5, выделенный из мокроты, близок по масс-спектрам к штаммам, выделенным с поверхности десневой борозды (штамм № 2), немукоидными штаммами, выделенными из устья правой подъязычной слюной железы (штамм № 8) и с поверхности языка (штамм № 11).

Наиболее отличающимся по своим масс-спектрам оказался 9 изолят, не имеющий совпадений по масс-спектрам не только от выделенных из мокроты, но и из локусов полости рта штаммов.

Таким образом выявлен высокий уровень гетерогенности исследуемой популяции, при этом только для отдельных пар изолятов выявлен высокий уровень значений CCI Score.

Заключение

Полость рта пациентов с муковисцидозом может быть одним из локусов для первичного попадания, адаптации и последующего формирования гетерогенной популяции бактерий, имеющих доказанное клиническое значение при данной патологии. Представители микробиологического сообщества посредством микроаспирации могут реколонизировать трахеобронхиальное дерево, тем самым способствуя поддержанию инфекционного воспаления в нижних дыхательных путях и частично объясняя неэффективность небулайзерной антибактериальной терапии. В то же время и клоны, адаптировавшиеся в легочной ткани, при откашливании мокроты способны реколонизировать локусы полости рта.

Было показано, что штаммы, выделенные из мокроты, оказались более однородными, чем культуры, выявленные со слизистой оболочки полости рта. При этом в случае выделения нескольких морфотипов P. aeruginosa из одного локуса в полости рта, близкородственных штаммов выделено не было. Таким образом полость рта является более значимой с точки зрения микробной диссоциации, что может быть обусловлено более разнообразными микроэкологическими условиями. Полученные данные актуализируют вопрос о необходимости комплексного микробиологического подхода при проведении обследования пациентов для повышения эффективности эрадикационных мероприятий при муковисцидозе, что следует учитывать клиницистам и микробиологам в своей практической деятельности.

About the authors

Olga V. Kondratenko

Samara State Medical University of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: o.v.kondratenko@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-7750-9468
SPIN-code: 9605-3821
Scopus Author ID: 5719485453
ResearcherId: DNW-4596-2022

PhD, MD (Medicine), Associate Professor, Department of General and Clinical Microbiology, Immunology and Allergology

Россия, 443079, Samara, Gagarin str., 18

Maria S. Saburova

Samara State Medical University of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Author for correspondence.
Email: m.s.saburova@samsmu.ru

Assistant Professor, Department of Therapeutic Dentistry

Россия, 443079, Samara, Gagarin str., 18

References

Supplementary files