The influence of Aspergillus fumigatus micromycetes on immune response regulation in patients with asthma

Full Text

Введение

Микроскопические грибы, имеющие широкое распространение в окружающей среде, являются представителями отдельного царства живых существ, для которых характерно разнообразное влияние на организм человека. Особое внимание уделяют плесневым термотолерантным микромицетам, способным жить при температуре +37°С, таким как A. fumigatus [23]. Грибы рода Aspergillus — наиболее значимые микромицеты, которые поражают дыхательные пути. При неэффективном удалении из респираторного тракта грибковые конидии могут прорастать, образуя гифы, которые, в свою очередь, запускают каскад иммунных реакций, приводящих к широкому спектру клинических проявлений — от колонизации до инвазивного аспергиллеза. У больных с хроническими полостями в легких A. fumigatus может стать этиологическим агентом хронического аспергиллеза легких, а у больных с атопией — участвовать в развитии микогенной сенсибилизации и аллергического бронхолегочного аспергиллеза (АБЛА) [31].

Аллергический бронхолегочный аспергиллез — хроническое заболевание легких, обусловленное гиперчувствительностью к грибам рода Aspergillus, которое является наиболее значимым проявлением аллергического аспергиллеза и встречается во всем мире. Это потенциально деструктивное заболевание на сегодняшний день недооценено клиницистами. Чаще всего АБЛА развивается у предрасположенных пациентов с бронхиальной астмой (БА) и муковисцидозом, утяжеляя течение основного заболевания, приводя к развитию бронхоэктазов и дыхательной недостаточности [12, 14].

В то время как многочисленные современные исследования посвящены патогенетическим механизмам, лежащими в основе тяжелой БА, работ по оценке иммунного ответа при развитии БА с сенсибилизацией к A. fumigatus и АБЛА недостаточно [10, 18]. Исследования нарушений местных и системных иммуннорегуляторных механизмов, приводящих к гиперпродукции слизи, закупорке дыхательных путей и формированию бронхоэктазов, будут способствовать выявлению АБЛА на более ранних этапах и разработке новых терапевтических стратегий. Поэтому целью исследования стала оценка особенностей регуляции иммунного ответа больных АБЛА и БА с сенсибилизацией к A. fumigatus.

Материалы и методы

В микологической клинике ФГБОУ ВО СЗГМУ им. И.И. Мечникова Минздрава России провели проспективное исследование, в которое включили 41 больного БА. Контрольную группу составили 16 условно здоровых людей, сопоставимых по возрасту и полу, без аллергических заболеваний в анамнезе.

Все участники подписали добровольное информированное согласие на проведение исследования. Протокол обследования пациентов и практически здоровых людей отвечал этическим нормам Хельсинской декларации и был одобрен локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО «Северо-Западный государственный медицинский университета имени И.И. Мечникова» МЗ РФ (Протокол № 2 от 03.02.2021). Все пациенты соответствовали общим критериям включения в исследование: диагноз «БА», тяжелое/среднетяжелое течение заболевания, возраст 18 лет и старше, отсутствие острых респираторных заболеваний в течение предшествующих 4 недель. Критериями включения в контрольную группу были: отсутствие респираторной патологии, хронической инфекционной и неинфекционной патологии, гельминтной инвазии, декомпенсированных состояний, отрицательный аллергологический анамнез, неотягощенная по БА и другим аллергическим заболеваниям наследственность.

Уровни общего IgE (Полигност, Россия), специфических IgE (sIgE) (Алкор Био, Россия), тимус-ассоциированного регуляторного хемокина (thymus and activation regulated chemokine, TARC) (R&D, США) в сыворотке крови определяли с помощью иммуноферментных тест-систем в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя.

Клинический анализ крови выполняли на гематологическом анализаторе DxH-800 (Beckman Coulter, США). Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови было проведено методом 6-цветного цитофлуориметрического анализа с использованием проточного цитометра Navios™ (Beckman Coulter, США). Подготовку образцов периферической крови и настройку цитофлуориметра проводили в соответствии с национальными рекомендациями [8]. Субпопуляцию Т-хелперов (Тh) клеток памяти выделяли по фенотипу CD4⁺CD45RA^– и анализировали уровень экспрессии на них следующих хемокиновых рецепторов: CCR4, CCR6, CXCR3 и CXCR5. Окраску антителами проводили в соответствии с рекомендациями производителей. В работе использовали моноклональные антитела, конъюгированные с флуорохромами: CD4/PerCP, CD45RA/PE/Cy7, CD183(CXCR3)/AlexaFluor488, CD194(CCR4)/PE, CD196(CCR6)/PE-Dazzle™594 и CD185(CXCR5)/Alexa Fluor 647 (Biolegend, США). После внесения антител образцы тщательно перемешивали, затем инкубировали при комнатной температуре 15 мин в защищенном от света месте. По завершении инкубации вносили 500 мкл лизирующего раствора VersaLyse Lysing Solution (Beckman Coulter, США) с добавлением фиксирующего раствора Fixative Solution IOTest 3 (12,5 мкл) (Beckman Coulter, США). Через 10 мин инкубации при комнатной температуре в темноте образцы отмывали в 4 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ) 5 мин при 1500 об/мин, удаляли надосадок и восстанавливали лейкоцитарную взвесь в 400 мкл ФСБ. При цитометрическом анализе для каждого из образцов набирали не менее 5000 лимфоцитов. Полученные результаты анализировали при помощи программного обеспечения Navios™ Software v1.2 (Beckman Coulter, США) и выражали в виде процента позитивных клеток от искомой популяции. Оценку Т-регуляторных лимфоцитов (Тreg) проводили методом проточной цитометрии при окрашивании лимфоцитов периферической крови моноклональными антителами CD4/FITC, CD127/PC7 и CD25/PE (Beckman Coulter, США). Подготовку проб осуществляли в тех же условиях, что и при 6-цветном анализе.

С целью изучения антиген-специфической продукции IFNγ, IL-10 и IL-13 к 100 мкл разведенной в 5 раз крови добавляли 100 мкл аллергена A. fumigatus (Алкор Био, Россия) в конечной концентрации 10 мкг/мл. Для разведения крови и аллергена использовали полную питательную среду (ППС): среда RPMI 1640 с добавлением L-глутамина (Биолот, Россия), 200 мкг/мл гентамицина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Биолот, Россия). В предварительных экспериментах были определены оптимальная доза аллергена и сроки культивирования клеток. Для спонтанной продукции цитокинов в лунки 96-луночного планшета вносились по 100 мкл ППС. Через 144 ч инкубации образцов при 37°С в атмосфере 5% СО₂ в СО₂-инкубаторе (MCO-5A Sanyo™, Япония) отбирали надосадочную жидкость, аликвотировали и хранили при –20°C до проведения анализа. Содержание цитокинов в полученных образцах определяли методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческих тест-систем (Вектор-Бест, Россия и R&D, США) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя.

Для изучения функции внешнего дыхания использовали спирометрию методом выполнения петли «объем–поток» с компьютерной обработкой результатов исследования. Учитывали следующие показатели: объем форсированного выдоха за первую секунду (ОФВ1), форсированная жизненная емкость легких (ФЖЕЛ), индекс Тиффно. По показаниям выполняли компьютерную томографию (КТ) легких в режиме высокого разрешения.

Диагноз, степень тяжести и уровень контроля над течением БА устанавливали в соответствии с рекомендациями рабочей группы GINA (Global Initiative for Asthma, updated, 2022) [28]. При оценке контроля над симптомами БА ориентировались на жалобы, клинические проявления, данные спирометрии с проведением теста на обратимость. Также использовали опросник АСТ (Asthma Control Test), который является краткой и доступной анкетой, содержит 5 вопросов с 5-балльной оценкой ответов. Сумма 25 баллов означают полный контроль БА, 20–24 — неполный контроль, 19 баллов и меньше — указывает на отсутствие контроля. С помощью АСТ оценивали уровень контроля БА за последние 4 недели.

Для выявления микогенной сенсибилизации и аллергического бронхолегочного аспергиллеза (АБЛА) использовали рекомендации рабочей группы ISHAM (International Society for Human and Animal Mycology, 2013). Критериями микогенной сенсибилизации были: положительный кожный прик-тест (≥ 3 мм) и/или выявление в сыворотке крови уровня специфического IgE к грибковому аллергену, соответствующего классу 1 и выше (≥ 0,35 МЕ/мл) [9].

Полученные в процессе исследования данные обрабатывали с помощью программной системы Statistica 10 (StatSoft, США). Нормальность распределения количественных данных проверяли с помощью критерия Колмогоров–Смирнова и Шапиро–Уилка. Изучаемые характеристики представляли медианами, нижним и верхним квартилями (Ме (Q_0,25; Q_0,75). Для оценки значимости различий использовали непараметрический U-критерий Манна–Уитни. Для выявления корреляционных взаимосвязей между двумя количественными параметрами использовали непараметрический метод ранговой корреляции по Спирмену c вычислением коэффициента ранговой корреляции (r). Различия считали статистически значимыми при р < 0,05.

Результаты

На основании результатов клинико-инструментального обследования больные БА были разделены на три группы: 16 больных БА без сенсибилизации к A. fumigatus (БА Asp–) (женщин — 80,7%), 10 больных БА с сенсибилизацией к A. fumigatus (БА Asp+) (женщин — 77,8%), 15 больных, у которых на фоне БА сформировался АБЛА (женщин — 80,2%). Контрольную группу составили 16 здоровых добровольцев (женщин — 75,0%). Группы не различались между собой по возрасту и полу (табл. 1).

 

Таблица 1. Характеристика больных бронхиальной астмой, Mе (Q_0,25–Q_0,75)

Table 1. Characteristics of patients with bronchial asthma, Mе (Q_0.25–Q_0.75)

Показатель Parameters	Группа 1 Group 1 n = 16	Группа 2 Group 2 n = 16	Группа 3 Group 3 n = 10	Группа 4 Group 4 n = 15	Достоверно значимые различия p value
	Контрольная группа Control group	БА без сенсибилизации к A. fumigatus BA without sensitization to A. fumigatus	БА с сенсибилизацией к A. fumigatus BA with sensitization to A. fumigatus	АБЛА ABPA
Возраст, лет Age, years	41,0 (39,0–44,5)	50,0 (37,0–56,5)	46,0 (35,0–66,0)	49,0 (41,0–64,0)
ОФВ1, % от должного FEV1, %	–	81,0 (67,0–91,1)	64,0 (56,5–81,5)	65,0 (60,0–70,0)	p2–3 = 0,005 p2–4 = 0,015
АСТ, баллы АСТ, score	–	15,0 (10,0–19,0)	13,5 (10,5–20,0)	13,0 (12,0–14,0)

Примечание. p_2–3 — статистическая значимость различий между группами БА без сенсибилизации к A. fumigatus и БА с сенсибилизацией к A. fumigatus; p_2–4 — статистическая значимость различий между группами БА без сенсибилизации к A. fumigatus и АБЛА (U-критерий Манна–Уитни).

Note. p_2–3 — statistical significance of differences between BA without and with sensitization to A. fumigatus; p_2–4 — statistical significance of differences between BA without sensitization to A. fumigatus and ABPA groups (Mann–Whitney U-test).

 

Анализ спирометрических характеристик выявил, что показатель ОФВ1 в группах больных АБЛА и БА Asp+ был значимо ниже, чем у больных БА Asp– (65,0% (60,0–70,0) и 64,0% (56,5–81,5) vs 81,0% (67,0–91,1), p = 0,015 и p = 0,005 соответственно), что может быть связано с более выраженным воспалением стенки бронхов, и утяжелением течения БА при сочетании с сенсибилизацией к A. fumigatus. Статистически значимых различий по результатам заполнения опросника АСТ у больных исследуемых групп не установлено. Однако выявлена тенденция к снижению среднего балла по мере возрастания показателей, отражающих степень сенсибилизации к A. fumigatus (табл. 1).

Во всех исследуемых группах больных установлено статистически значимое повышение уровня общего IgE по сравнению с группой контроля (p ≤ 0,001). Содержание общего IgE у больных АБЛА составило 2332,5 МЕ/мл (1147,0–4530,0) и было значимо выше, чем в группах больных БА Asp+ (659,0 МЕ/мл (300,0–700,0, p < 0,001) и БА Asp– (159,0 МЕ/мл (72,0–441,0), p < 0,001). Кроме того, данный показатель был значимо выше у больных БА Asp+ по сравнению с пациентами БА Asp– (p = 0,012) (рис., А). Уровни sIgE к A. fumigatus различались между больными АБЛА и БА Asp+ (2,23 МЕ/мл (1,10–4,14) vs 0,72 МЕ/мл (0,50–1,60), p = 0,019) и значимо превышали показатели пациентов с БА Asp– (0,00 МЕ/мл (0,00–0,02), p < 0,001 и p < 0,001 соответственно) (рис., Б).

Известно, что эозинофилы крови могут быть маркером эозинофильного воспаления в дыхательных путях у пациентов с БА, а эозинофилия является признанным прогностическим фактором обострения заболевания. Абсолютное число эозинофилов в группе больных АБЛА составило 0,41 × 10⁹/л (0,37–0,75) и было значимо выше по сравнению с показателями пациентов с БА Asp– (0,30 × 10⁹/л (0,07–0,43), p = 0,023) и контрольной группы (0,09 × 10⁹/л (0,06–0,20), p < 0,001). Показатели в группах больных БА Asp+ и БА Asp– не различались между собой (p = 0,36) (рис., В).

Учитывая данные о патогенетических механизмах взаимодействия A. fumigatus с эпителиальными клетками дыхательных путей больных БА, в нашем исследовании был определен уровень TARC, который участвует в детерминации иммунного ответа в сторону Т2-звена [16]. Установлено существенное повышение показателей TARC во всех группах по сравнению с группой контроля (p < 0,001). Выявлены значимые различия содержания данного хемокина у больных АБЛА — 811,0 пг/мл (686,5–1039,0) по сравнению с группой БА Asp+ (425,0 пг/мл (295,0–625,0), p = 0,011) и БА Asp– (287,0 пг/мл (238,5–310,0), p < 0,001). Кроме того уровень TARC был значимо выше у больных БА Asp+ по отношению к пациентам БА Asp– (p = 0,027) (рис., Г).

 

Рисунок. Уровни общего IgE, sIgE, TARC и количество эозинофилов в крови у больных бронхиальной астмой, Ме (Q0,25–Q0,75)

Figure. Serum levels of total IgE, sIgE, TARC and blood eosinophil count in patients with bronchial asthma, Me (Q_0.25–Q_0.75)

Примечание. Показатели общего IgE (МЕ/мл) (A), sIgE (МЕ/мл) (Б), количества эозинофилов в крови (× 10⁹/л) (В), TARC (пг/мл) (Г) у здоровых людей (группа 1), больных БА без сенсибилизации к A. fumigatus (группа 2), больных БА с сенсибилизацией к A. fumigatus (группа 3) и АБЛА (группа 4). p — достоверность различий между группами (U-критерий Манна–Уитни).

Note. Serum level of total IgE (IU/ml) (A), sIgE (IU/ml) (B), count of blood eosinophils (× 10⁹/L) (C), TARC (pg/ml) (D) in healthy subjects (group 1), BA patients without sensitization to A. fumigatus (group 2), BA patients with sensitization to A. fumigatus (group 3) and ABLA (group 4). p — significant differences between groups (Mann–Whitney U-test).

 

Важная роль TARC в прогрессировании аллергического воспаления у больных с микогенной сенсибилизацией подтверждена положительной корреляционной связью TARC с уровнем sIgE к A. fumigatus (r = 0,776, p < 0,001), общего IgE (r = 0,823, p < 0,001) и отрицательной с ОФВ1 (r = –0,552, p < 0,001).

Большое количество современных исследований посвящены иммунологическим изменениям, которые лежат в основе патогенеза различных фенотипов тяжелой БА [1, 2, 3, 7, 19]. Однако работы направленные на определение различных клонов Т-хелперов у больных с сенсибилизацией к Aspergillus spp. немногочисленны [10, 18]. В ходе нашего исследования мы определяли субпопуляционный состав лимфоцитов крови у пациентов с БА в зависимости от наличия сенсибилизации к A. fumigatus и развития АБЛА. Данные представлены в табл. 2. Значимых различий по количеству CD4⁺ Т-хелперов между группами больных и группой контроля установлено не было. Пациенты всех групп имели достоверно более высокий процент CD4⁺CD45RA^– Т-клеток памяти по сравнению с показателем группы контроля, что согласуется с результатами других авторов [11, 32].

 

Таблица 2. Относительное содержание субпопуляций T-хелперов среди клеток с фенотипом CD45RA^– у больных бронхиальной астмой, Mе (Q_0,25–Q_0,75)

Table 2. Percentage of T-helper subpopulations out of CD45RA^– cells in patients with bronchial asthma, Mе (Q_0.25–Q_0.75)

Популяции Т-хелперов T-helper cell subsets	Содержание клеток/Cell count				Достоверно значимые различия p value
	Группа 1 Group 1 n=16	Группа 2 Group 2 n=16	Группа 3 Group 3 n=10	Группа 4 Group 4 n=15
	Контрольная группа Control group	БА без сенсибилизации к A. fumigatus BA without sensitization to A. fumigatus	БА с сенсибилизацией к A. fumigatus BA with sensitization to A. fumigatus	АБЛА ABPA
Тh (CD3+CD4+), %	46,0 (42,5–49,5)	49,5 (43,0–58,0)	50,0 (45,0–54,0)	48,0 (43,0–55,0)
Тh (CD45RA–CD4+), %	41,75 (37,75–52,75)	53,10 (47,70–60,90)	54,30 (44,50–61,20)	49,10 (44,20–65,00)	p1–2 = 0,012 p1–3 = 0,013 p1–4 = 0,012
Тh1 (CXCR5–CXCR3+), %	8,35 (6,95–11,90)	9,00 (7,15–12,15)	11,90 (7,30–18,00)	8,50 (5,60–9,00)
Тh17 (CXCR5–CCR6+ CCR4+), %	13,35 (12,35–14,90)	14,45 (11,60–17,20)	12,45 (9,70–15,70)	13,70 (12,60–15,60)
Тh2 (CXCR5–CCR4+), %	5,65 (4,30–6,30)	8,05 (5,75–10,10)	8,35 (7,40–9,80)	11,10 (8,80–13,00)	p1–2 = 0,006 p1–3 < 0,001 p1–4 < 0,001 p2–4 = 0,017 p3–4 = 0,035
Тh17.1 (CXCR5–CXCR3+CCR6+), %	14,75 (12,65–18,20)	14,65 (9,20–18,35)	8,95 (7,40–10,90)	11,10 (9,92–14,50)	p1–3 = 0,001 p1–4 = 0,016
Tfh1 (CXCR5+CXCR3+), %	3,05 (2,45–4,30)	2,55 (1,60–3,10)	3,45 (2,60–3,90)	3,10 (2,10–3,50)	p1–2 = 0,040 p2–3 = 0,031
Tfh2 (CXCR5+CCR4+), %	1,95 (1,55–2,65)	1,80 (1,60–2,85)	3,15 (1,80–4,30)	2,81 (2,00–3,70)	p1–3 = 0,049 p1–4 = 0,011 p2–4 = 0,021
Tfh17 (CXCR5+CCR6+), %	1,45 (1,10–2,00)	1,55 (1,20–2,00)	2,15 (1,80–2,70)	1,50 (0,70–2,40)	p1–3 = 0,042
Tfh17.1 (CXCR5+CXCR3+CCR6+), %	1,40 (1,10–2,10)	1,40 (1,10–2,00)	1,45 (1,30–1,80)	1,90 (1,40–2,20)

Примечание. p_1–2 — статистическая значимость различий между группами БА без сенсибилизации к A. fumigatus и контролем; p_1–3 — статистическая значимость различий между группами БА с сенсибилизацией к A. fumigatus и контролем; p_1–4 — статистическая значимость различий между группами АБЛА и контролем; p_2–3 — статистическая значимость различий между группами БА без сенсибилизации к A. fumigatus и БА с сенсибилизацией к A. fumigatus; p_2–4 — статистическая значимость различий между группами БА без сенсибилизации к A. fumigatus и АБЛА; p_3–4 — статистическая значимость различий между группами БА с сенсибилизацией к A. fumigatus и АБЛА (U-критерий Манна–Уитни).

Note. p_1–2 — statistical significance of differences between BA without sensitization to A. fumigatus and control groups; p_1–3 — statistical significance of differences between BA with sensitization to A. fumigatus and control groups; p_1–4 — statistical significance of differences between ABPA and control groups; p_2–3 — statistical significance of differences between BA without vs with sensitization to A. fumigatus; p_2–4 — statistical significance of differences between BA without sensitization to A. fumigatus and ABPA groups; p_3–4 — statistical significance of differences between BA with sensitization to A. fumigatus and ABPA groups (Mann–Whitney U-test).

 

Установлено, что анализ экспрессии хемокиновых рецепторов позволяет судить не только о направлении миграции CD4⁺ Т-хелперов из кровотока, но может выступать и в качестве одного из методических приемов для определения поляризации клеток в сторону того или иного клона [6]. В нашем исследовании все CD4⁺CD45RA^– Т-клетки памяти были разделены на CXCR5-негативные и CXCR5-позитивные. Среди CXCR5-негативных CD4⁺CD45RA^– Т-хелперов памяти были выявлены следующие Th c различными фенотипами: Th1 (CXCR5^–CXCR3⁺CCR6^–CCR4^–), Th2 (CXCR5^–CXCR3^–CCR6^–CCR4⁺), «классические» Th17 (CXCR5^–CXCR3^–CCR6⁺CCR4⁺) и «неклассические» Th17.1 (CXCR5^–CXCR3⁺CCR6⁺CCR4^–).

Анализ субпопуляционного состава Т-клеток памяти не выявил достоверных различий по числу Th1 и «классических» Th17 между группами, включенными в исследование (табл. 2). Установлено, что у всех групп больных БА в периферической крови относительное количество Th2 значимо превышало показатели здоровых лиц (р = 0,006, p < 0,001 и p < 0,001 соответственно). Содержание Th17.1 было значимо ниже в группах больных с сенсибилизацией к A. fumigatus по сравнению с контрольными показателями (р = 0,001 и р = 0,016 соответственно). Особенностью пациентов с АБЛА явилось значимо более высокое количество Th2 — 11,10% (8,80–13,00) по сравнению с больными БА Asp+ (8,35% (7,40–9,80), p = 0,035) и БА Asp– (8,05% (5,75–10,10), p = 0,017). Выявлена положительная корреляционная связь между количеством Th2 и уровнями IgE (r = 0,375, p = 0,017), sIgE к A. fumigatus (r = 0,339, p = 0,030), TARC (r = 0,577, p = 0,001) и отрицательная корреляционная связь с ОФВ1 (r = –0,381, p = 0,022) и числом Th17.1 (r = –0,335, p = 0,032).

Важной субпопуляцией T-хелперов являются фолликулярные Т-хелперы (Tfh) — CXCR5- позитивные клетки. По аналогии с традиционными Тh, среди CXCR5⁺CD45RA^– CD4⁺ Т-клеток памяти были выделены: Tfh1 (CXCR3⁺CCR6^– CCR4^–), Tfh2 (CXCR3^–CCR6^–CCR4⁺), Tfh17 (CXCR3^–CCR6⁺CCR4^–), Tfh17.1 (CXCR5⁺CXCR3⁺ CCR6⁺) [6]. Процентное содержание Tfh2 у больных обеих групп с сенсибилизацией к A. fumigatus было значимо выше по сравнению с контрольными значениями (p = 0,049 и p = 0,01 соответственно). У пациентов с АБЛА установлено более высокое число Tfh2 2,81% (2,00–3,70) по сравнению с больными БА Asp– (1,80% (1,60–2,85), p = 0,021). Установлено снижение числа Tfh1 у больных БА Asp– по сравнению с показателями больных БА Asp+ (p = 0,031) и контрольной группы (p = 0,040). У больных БА Asp+ выявлено повышение количества Tfh17 по сравнению со значениями условно здоровых лиц (p = 0,042). Значимых различий в содержании Tfh17.1 между группами, включенными в исследование, установлено не было. Выявлена положительная корреляционная связь между количеством Tfh2 и уровнями IgE (r = 0,383, p = 0,015), sIgE к A. fumigatus (r = 0,373, p = 0,016) и TARC (r = 0,380, p = 0,021).

Установлено, что относительное количество CD4⁺CD127^–CD25⁺ Тreg у пациентов с АБЛА, БА Asp+ и БА Asp– достоверно превышало показатель контрольной группы (11,00% (9,10–14,00), 10,50% (7,50–12,85) и 10,20% (7,00–12,15) vs 6,7% (5,75–7,00), p < 0,001, p = 0,002 и p = 0,002 соответственно). Известно, что Тreg играют важную роль в поддержании иммунного гомеостаза [27]. Однако значимых различий по числу Тreg между исследуемыми группами больных не выявлено.

На заключительном этапе исследования провели сравнительный анализ уровней патогенетически значимых цитокинов, продуцируемых клетками цельной крови больных БА Asp– и АБЛА в ответ на инкубацию с аллергеном A. fumigatus. Для анализа цитокинового профиля проводили вычисление индекса стимуляции (ИС) как соотношения индуцированной продукции цитокинов к их спонтанной выработке. Установлено, что у здоровых доноров аллерген A. fumigatus активировал лимфоциты к продукции IFNγ, но не к выработке IL-10 и IL-13 (табл. 3), что согласуется с результатами других авторов [18]. В группе больных АБЛА по сравнению с группой контроля были выявлены значимо более низкие уровни IFNγ (15,0 пг/мл (10,0–32,0) vs 32,0 пг/мл (20,8–49,0), p = 0,001) и значения ИС (1,00 (0,98–1,37) vs 5,76 (2,14–11,01), p < 0,001) в ответ на индукцию грибковым аллергеном. Напротив, клетки крови больных АБЛА синтезировали более высокие уровни IL-10 (126,0 пг/мл (94,4–159,0) vs 21,2 пг/мл (10,0–36,0) и 24,5 пг/мл (22,0–32,5), p < 0,001 и p < 0,001 соответственно) и IL-13 (104,0 пг/мл (72,4–250,0) vs 44,5 пг/мл (42,0–56,0) и 59,0 пг/мл (38,4–59,6), p < 0,001 и p = 0,001 соответственно) по сравнению с показателями больных БА Asp– и здоровых лиц. Следовательно, индексы стимуляции для IL-10 (4,96 (2,95–41,83) vs 0,58 (0,25–1,55) и 1,14 (1,06–1,50), p = 0,001, p = 0,001, соответственно) и IL-13 (3,67 (2,08–6,56) vs 0,97 (0,84–1,10) и 1,09 (0,95–1,20), p < 0,001, p = 0,001, соответственно) значимо отличались от значений больных БА Asp– и контрольной группы.

В группе больных БА Asp- не было выявлено способности грибкового аллергена стимулировать клетки крови к выработке IL-10 и IL-13, так как показатели ИС не отличались от контрольных значений (p = 0,13 и p = 0,09) (табл. 3). Полученные данные могут свидетельствовать о выраженной активации клонов Т-лимфоцитов, специфичных к другим аэроаллергенам, но не к плесневым микромицетам, что подтверждает отсутствие у больных БА Asp- sIgЕ к A. fumigatus. Таким образом, антиген-специфическая стимуляция клеток крови больных АБЛА вызывала достоверно более высокую продукцию IL-10 и IL-13 и низкую выработку IFNγ по сравнению со значениями в группе контроля и БА.

 

Таблица 3. Показатели спонтанной и антиген-стимулированной продукции цитокинов у больных бронхиальной астмой без сенсибилизации к A. fumigatus и АБЛА, Mе (Q_0,25–Q_0,75)

Table 3. Parameters of spontaneous and antigen-stimulated cytokine production in patients with bronchial asthma without sensitization to A. fumigatus and ABPA, Mе (Q_0,25–Q_0,75)

Показатель Parameters	Группы/Groups			Достоверно значимые различия p value
	Контрольная группа Control group n = 16	БА без сенсибилизации к A. fumigatus BA without sensitization to A. fumigatus n = 16	АБЛА ABPA n = 15
IFNγ спонтанный, пг/мл IFNγ spontaneous, pg/ml	7,7 (3,45–10,35)	7,3 (5,0–19,4)	13,4 (6,0–18,8)	–
IFNγ A. fumigatus, пг/мл IFNγ A. fumigatus, pg/ml	32,0 (20,8–49,0)	21,0 (16,0–32,0)	15,0 (10,0–32,0)	*p = 0,001
ИС IFNγ IS IFNγ	5,76 (2,14–11,01)	1,87 (1,18–5,83)	1,00 (0,98–1,37)	*p < 0,001 **p = 0,026 #p = 0,049
IL-10 спонтанный, пг/мл IL-10 spontaneous, pg/ml	19,5 (16,0–28,5)	23,2 (17,4–45,0)	22,0 (6,4–42,0)	–
IL-10 A. fumigatus, пг/мл IL-10 A. fumigatus, pg/ml	24,5 (22,0–32,5)	21,2 (10,0–36,0)	126,0 (94,4–159,0)	*p < 0,001 **p < 0,001
ИС IL-10 IS IL-10	1,14 (1,06–1,50)	0,58 (0,25–1,55)	4,96 (2,95–41,83)	*p = 0,001 **p = 0,001
IL-13 спонтаный, пг/мл IL-13 spontaneous, pg/ml	53,0 (40,0–61,2)	52,1 (42,0–54,1)	38,2 (31,8–52,0)	–
IL-13 A. fumigatus, пг/мл IL-13 A. fumigatus, pg/ml	59,0 (38,4–59,6)	44,5 (42,0–56,0)	104,0 (72,4–250,0)	*p = 0,001 **p = < 0,001
ИС IL-13 IS IL-13	1,09 (0,95–1,20)	0,97 (0,84–1,10)	3,67 (2,08–6,56)	*p = 0,001 **p = < 0,001

Примечание. *p — статистическая значимость различий между группой АБЛА и контролем; **p — статистическая значимость различий между группами АБЛА и БА без сенсибилизации к A. fumigatus; ^#p — статистическая значимость различий между группой БА без сенсибилизации к A. fumigatus и контролем (U-критерий Манна–Уитни).

Note. *p — statistical significance of differences between ABPA and control groups; **p — statistical significance of differences between ABPA and BA without sensitization to A. fumigatus groups; ^#p — statistical significance of differences between BA without sensitization to A. fumigatus and control groups (Mann–Whitney U-test).

 

Обсуждение

Опубликованы результаты исследований, согласно которым микогенная сенсибилизация ассоциирована с тяжелым течением БА, развитием бронхоэктазов и фиброза [15, 26]. В работе Woolnough K.F. и соавт. показано, что уровень sIgE к термотолерантным нитчатым грибам, в частности к A. fumigatus, но не уровень общего IgE, был взаимосвязан с фиксированной обструкцией воздушного потока и рядом радиологических изменений у больных БА различной степени тяжести. Авторы сделали вывод о возможном риске повреждения легких у всех больных с сенсибилизацией к A. fumigatus независимо от того, соответствуют ли они критериям АБЛА [33]. Сходные результаты были получены нами ранее. Показано, что сенсибилизация к A. fumigatus, но не к другим аэроаллергенам, существенно ухудшает течение БА [4]. В настоящем исследовании у больных с сенсибилизацией к A. fumigatus установлены худшие показатели ОФВ1 и результатов ACT. Выявлена отрицательная корреляционная связь между уровнями sIgE к A. fumigatus и показателем ОФВ1 (r = –0,605, p < 0,001). Полученные данные указывают на более выраженное воспаление и возможность деструктивных изменений в легких у больных БА с сенсибилизацией к A. fumigatus, что диктует необходимость дальнейшего детального изучения особенностей иммунопатогенеза микогенной аллергии.

На современном этапе известно, что иммунные реакции, возникающие в дыхательных путях при контакте с грибковыми аллергенами, вовлекают тучные клетки, базофилы, эозинофилы, врожденные лимфоидные клетки, М2-поляризованные макрофаги и Th2 [29]. Вдыхаемые грибковые аллергены поглощаются дендритными клетками (DCs). Активированные DCs мигрируют в дренирующие лимфатические узлы, где они контролируют дифференцировку CD4⁺ T-клеток [25]. Дифференцировка CD4⁺ T-клеток в Th2 зависит от TSLP, TARC/CCL17 и MCD/CCL22. Появляется все больше доказательств того, что именно TARC играет важную роль в патогенезе аллергических реакций [16]. Так установлено более высокое содержание TARC в сыворотке крови у пациентов с БА по сравнению с контрольной группой. Обращает внимание, что концентрация хемокина увеличивалась с возрастом [17]. Yormaz B. и соавт. сообщили, что сывороточные уровни TARC можно использовать в качестве биомаркеров эозинофильного фенотипа БА [35].

В соответствии с ранее опубликованными данными [5], мы выявили значимые различия уровней TARC у больных АБЛА и больных БА с сенсибилизацией к A. fumigatus по сравнению с показателями больных группы сравнения. Положительная корреляционная связь TARC с уровнями общего IgE, sIgE к A. fumigatus и отрицательная с ОФВ1 подтверждает важное значение данного хемокина в развитии аллергического воспаления у больных с микогенной сенсибилизацией и указывает на возможность его использования в дифференциальной диагностике.

После активации аллергеном Т-клетки разделяются на популяции эффекторных Т-клеток и Т-клетки памяти, последние подразделяются на CCR7^– эффекторные Т-клетки памяти (Tem) и CCR7⁺ центральные Т-клетки памяти (Tcm) [6]. Считают, что Т-клетки памяти связаны с хроническими воспалительными заболеваниями [21, 22]. Однако конкретные субпопуляции Т-клеток памяти человека, ответственные за аллергическое воспаление при различных эндотипах БА, недостаточно хорошо охарактеризованы. Поэтому крайне важно определить, какие субпопуляции Т-клеток памяти связаны с хроническим воспалением в легких у больных с сенсибилизацией к A. fumigatus. Можно предположить, что Т-клетки больных БА с сенсибилизацией к A. fumigatus обладают уникальными фенотипами и функциями, которые могут поддерживать хроническое воспаление в нижних дыхательных путях.

В ходе исследования было выявлено значительное увеличение циркулирующих CD4⁺ CD45RA^– Т-клеток памяти у всех больных БА по сравнению с группой контроля. Известно, что CD4⁺ Т-клетки памяти могут быстро пролиферировать в ответ на повторное проникновение специфического антигена и приобретать эффекторный фенотип с секрецией цитокинов и хемокинов [24]. Следовательно, долгоживущие Т-клетки памяти, обнаруженные в крови пациентов с БА, могут играть важную роль в хроническом воспалении нижних дыхательных путей в ответ на различные аллергены. Ранее сообщалось об увеличении числа CCR4⁺ Тh2 у пациентов с БА [20, 32]. Анализ наших данных установил, что у всех пациентов, включенных в исследование, повышено число циркулирующих Th2 клеток памяти по сравнению с контрольной группой. У больных АБЛА число Тh2 клеток памяти было выше, чем у больных БА с сенсибилизацией и без таковой к A. fumigatus. Напротив, установлено снижение числа Th17.1 у больных АБЛА и БА с сенсибилизацией к A. fumigatus по сравнению с показателями условно здоровых добровольцев.

Известно, что после активации Th2 продуцируют ряд провоспалительных цитокинов: IL-4, IL-13, IL-5 и IL-9. За пролиферацию аллерген-специфических В-клеток и переключение изотипов иммуноглобулинов на IgE класс отвечают IL-4 и IL-13. Главный цитокин Тh2 — IL-13 — индуцирует метаплазию бокаловидных клеток, фиброз и гиперреактивность бронхов, и в сочетании с IL-5 способствует пролиферации и выживанию эозинофилов в дыхательных путях [16]. В нашем исследовании, усиление активности Th2 клеток памяти у пациентов с АБЛА подтверждает повышение секреции IL-13 на фоне снижения выработки IFNγ в ответ на специфическую стимуляцию клеток крови грибковым аллергеном по сравнению с группой контроля и больными БА. Полученные данные согласуются с ранее представленными результатами в другом исследовании. Показано, что у пациентов с АБЛА наблюдалось увеличение индуцированных Aspergillus spp. IL-5 и IL-13 и снижение продукции IFNγ по сравнению со здоровым контролем [10]. Установленная нами положительная корреляционная связь между количеством Тh2 клеток памяти и уровнями sIgE, IgE, TARC и отрицательная с ОФВ1 подтверждает клиническую значимость данного показателя у пациентов с микогенной сенсибилизацией. Значимые различия по числу CXCR3⁺ Th1 и «классических» CCR6⁺CCR4⁺ Th17 в крови пациентов и контрольных субъектов не были выявлены, что совпадает с результатами других авторов [32].

После активации антигеном CXCR5⁺ В-лимфоциты мигрируют в первичные фолликулы лимфатических узлов, где происходит переключение изотипа и «созревание» аффинитета иммуноглобулинов при участи фолликулярных дендритных клеток и Tfh. Отличительной чертой Tfh является экспрессия CXCR5. Считается, что Tfh2 легко вступают в контакт с В-клетками для активации через CXCL13, лиганд CXCR5, секретируемый различными клетками, включая фолликулярные дендритные клетки, эндотелиальные клетки, а также клетки Tfh [13]. Опубликованы сведения о связи дифференцировки Th2 и Tfh2, согласно которым они вносят вклад в патогенез аллергического воспаления, опосредованного IgE [19, 30]. В последнее время появляются новые данные о том, что Tfh, а не Тh2, играют решающую роль в контроле продукции IgE [34]. В нашем исследовании наибольшее число Tfh2 установлено у больных АБЛА, а также у больных БА с сенсибилизацией к A. fumigatus и выявлена положительная корреляционная связь между количеством Tfh2 и уровнями IgE, sIgE к A. fumigatus и TARC, но отсутствовала связь с показателями функции дыхания.

Известно, что CD4⁺ Т-лимфоциты содержат субпопуляцию Т-регуляторных клеток, обеспечивающих аутотолерантность к собственным антигенам и сдерживающих чрезмерную активность клеток иммунной системы. Адаптивные регуляторные Т-хелперы образуются при иммунном ответе и служат фактором, ограничивающим иммунный ответ на его заключительных стадиях за счет действия CTLA-4 и продукции противовоспалительных цитокинов. Адаптивные Treg характеризуются экспрессией TGF-β, IL-10 и IL-4. TGF-β и IL-10 способствуют подавлению иммунного ответа, опосредованного функциональной активностью Тh1 и Тh2 [27]. В настоящем исследовании было установлено, что наиболее высокое число Treg выявлено у больных АБЛА, что согласуется с повышенной продукцией IL-10 у данной категории больных. Усиление активности Treg может отражать степень противодействия хронической воспалительной реакции, поддерживаемой грибковыми аллергенами в том случае, когда термотолерантные грибы способны длительно сохраняться в дыхательных путях [29].

Заключение

Результаты проведенного исследования соответствуют сформированным ранее представлениям о доминировании эозинофильного воспаления, развивающегося в дыхательных путях больных БА с сенсибилизацией к A. fumigatus. Положительная корреляционная связь числа циркулирующих Th2 и Tfh2 с активностью синтеза плазматическими клетками IgE и sIgE к A. fumigatus, а также уровнями TARC в сыворотке крови указывает на важную роль этих клеток в патогенезе микогенной аллергии. Учитывая все более широкое использование антицитокиновой биологической терапии у больных БА, изучение патогенетических механизмов БА с сенсибилизацией к A. fumigatus необходимо для дальнейшей разработки терапевтических моноклональных антител, применение которых повысит уровень контроля БА и позволит снизить объем системной стероидной терапии.

About the authors

Yana I. Kozlova

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

Email: kozlova510@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4602-2438
SPIN-code: 5842-6039

PhD (Medicine), Associate Professor, Department of Clinical Mycology, Allergology and Immunology, P.N. Kashkin Research Institute of Medical Mycology

Russian Federation, 194291, St. Petersburg, Santiago-de-Cuba str., 1/28

E. V. Frolova

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

Email: labimmune@yandex.ru

PhD (Medicine), Head of the Research Laboratory of Allergology and Immunology, P.N. Kashkin Research Institute of Medical Mycology

Russian Federation, 194291, St. Petersburg, Santiago-de-Cuba str., 1/28

I. V. Kudryavtsev

Institute of Experimental Medicine; Pavlov First St. Petersburg State Medical University

Email: igorek1981@yandex.ru

PhD (Biology), Head of the Cell Immunology Laboratory, Department of Immunology; Assistant Professor, Department of Immunology

Russian Federation, 194291, St. Petersburg, Santiago-de-Cuba str., 1/28; St. Petersburg

A. E. Uchevatkina

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

Email: a.uchevatkina@szgmu.ru

PhD (Medicine), Senior Researcher, Research Laboratory of Allergology and Immunology, P.N. Kashkin Research Institute of Medical Mycology

Russian Federation, 194291, St. Petersburg, Santiago-de-Cuba str., 1/28

L. V. Filippova

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

Email: larisa.filippova@szgmu.ru

PhD (Medicine), Senior Researcher, Research Laboratory of Allergology and Immunology, P.N. Kashkin

Russian Federation, 194291, St. Petersburg, Santiago-de-Cuba str., 1/28

O. V. Aak

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

Email: oleg.aak@szgmu.ru

PhD (Chemistry), Leading Researcher, Research Laboratory of Allergology and Immunology, P.N. Kashkin Research Institute of Medical Mycology

Russian Federation, 194291, St. Petersburg, Santiago-de-Cuba str., 1/28

A. E. Taraskina

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

Email: anastasiya.taraskina@szgmu.ru

PhD (Biology), Head of the Research Laboratory of Molecular Genetic Microbiology, P.N. Kashkin Research Institute of Medical Mycology

Russian Federation, 194291, St. Petersburg, Santiago-de-Cuba str., 1/28

A. V. Sobolev

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

Email: sobolev757@rambler.ru

PhD, MD (Medicine), Professor of the Department of Clinical Mycology, Allergology and Immunology, P.N. Kashkin Research Institute of Medical Mycology

Russian Federation, 194291, St. Petersburg, Santiago-de-Cuba str., 1/28

N. V. Vasilyeva

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

Email: mycobiota@szgmu.ru

PhD, MD (Biology), Professor, Honored Scientist of the Russian Federation, Director, P.N. Kashkin Research Institute of Medical Mycology

Russian Federation, 194291, St. Petersburg, Santiago-de-Cuba str., 1/28

N. N. Klimko

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

Author for correspondence.
Email: n_klimko@mail.ru

PhD, MD (Medicine), Professor, Head of the Department of Clinical Mycology, Allergology and Immunology, P.N. Kashkin Research Institute of Medical Mycology

Russian Federation, 194291, St. Petersburg, Santiago-de-Cuba str., 1/28

References

Supplementary files