THE INFLUENCE OF MICROMYCETES ASPERGILLUS FUMIGATUS ON IMMUNE RESPONSE REGULATION IN PATIENTS WITH ASTHMA


Cite item

Abstract

Aspergillus fumigatus is able not only to sensitize patients with atopy, but also to colonize the respiratory tract, remaining a constant source of allergens due to the small size of the spores and thermal tolerance. Sensitization to A.fumigatus in patients with asthma is associated with a severe course of the disease, and the proliferation of fungal spores in the respiratory tract can lead to the development of allergic bronchopulmonary aspergillosis (ABPA). Currently, the role of micromycetes in the immunopathogenesis of asthma has not been sufficiently studied. The objective was to evaluate the features of the immune response regulation in patients with ABPA or asthma with sensitization to A.fumigatus. The study included 15 patients with ABPA, 10 patients with asthma with sensitization to A. fumigatus, 16 patients with asthma without sensitization to A. fumigatus. The control group consisted of 16 conditionally healthy volunteers. All patients underwent a clinical and functional examination. The Asthma Control Test questionnaire was used to assess disease control. The diagnosis of asthma was established in accordance with the recommendations of the GINA working group (Global Initiative for Asthma, updated, 2022), the diagnosis of fungal sensitization and ABPA – in accordance with the recommendations of the ISHAM working group (International Society for Human and Animal Mycology, 2013). The subpopulations of blood lymphocytes were determined by flow cytometry.  The  A.fumigatus allergen was added to peripheral blood samples to evaluate the production of IFNγ, IL-10 and IL-13. The levels of cytokines in cell culture supernatants, as well as total IgE, specific IgE (sIgE) to A. fumigatus and thymus and activation-regulated chemokine (TARC) in blood serum were determined by enzyme immunoassay. Significantly higher levels of total IgE, sIgE to A. fumigatus and TARC in blood serum were found in patients with ABPA and asthma with sensitization to A. fumigatus compared to patients with asthma without sensitization to A. fumigatus. The results of immunophenotyping of lymphocytes revealed a significant excess of Th2 memory cells and T-regulatory cells in all patients with asthma compared to the control group. The number of Tfh2 was higher but Th17.1 memory cells were lower in patients with sensitization to A. fumigatus compared to those of conditionally healthy volunteers. Patients with ABPA had significantly higher number of Th2 memory cells and TARC content compared to patients with asthma with sensitization to A. fumigatus. The increased activity of Th2 memory cells is confirmed by increased secretion of IL-13 and IL-10 following decrease in IFNγ production in response to specific stimulation of blood cells by the fungal allergen compared to the patients with asthma and the control group. A positive correlation was revealed between the number of Th2 memory cells and the levels of sIgE, IgE, TARC, a negative correlation – with FEV1. Thus, contact with A. fumigatus significantly enhances the activity of Th2 memory cells in patients with asthma which can lead to a severe course of the disease and the formation of allergic bronchopulmonary aspergillosis. The identified features of the immune response dictate the need for a personalized approach to the choice of therapeutic tactics in this category of patients.

Full Text

Введение

Микроскопические грибы, имеющие широкое распространение в окружающей среде, являются представителями отдельного царства живых существ, для которых характерно разнообразное влияние на организм человека. Особое внимание уделяют плесневым термотолерантным микромецетам, способным жить при температуре +370С, таким как A.fumigatus. [1]. Грибы рода Aspergillus – наиболее значимые микромицеты, которые поражают дыхательные пути. При неэффективном удалении из респираторного тракта грибковые конидии могут прорастать, образуя гифы, которые, в свою очередь, запускают каскад иммунных реакций, приводящих к широкому спектру клинических проявлений от колонизации до инвазивного аспергиллеза. У больных с хроническими полостями в легких A.fumigatus может стать этиологическим агентом хронического аспергиллеза легких, а у больных с атопией – участвовать в развитии микогенной сенсибилизации и аллергического бронхолегочного аспергиллеза [2].

Аллергический бронхолегочный аспергиллёз – хроническое заболевание лёгких, обусловленное гиперчувствительностью к грибам рода Aspergillus, которое является наиболее значимым проявлением аллергического аспергиллеза и встречается во всем мире. Это потенциально деструктивное заболевание недооценено клиницистами на современном этапе. Чаще всего аллергический бронхолегочный аспергиллез (АБЛА) развивается у предрасположенных пациентов с бронхиальной астмой (БА) и муковисцидозом, утяжеляя течение основного заболевания, приводя к развитию бронхоэктазов и дыхательной недостаточности [3, 4].

В то время как многочисленные современные исследования посвящены патогенетическим механизмам, которые лежат в основе тяжелой БА, работ, направленных на оценку иммунного ответа при развитии БА с сенсибилизацией к A.fumigatus и АБЛА, недостаточно [5, 6]. Исследования нарушений местных и системных иммуннорегуляторных механизмов, приводящих к гиперпродукции слизи, закупорке дыхательных путей и формированию бронхоэктазов, будут способствовать выявлению АБЛА на более ранних этапах и разработке новых терапевтических стратегий. Поэтому целью исследования явилась оценка особенностей регуляции иммунного ответа больных аллергическим бронхолегочным аспергиллезом и бронхиальной астмой с сенсибилизацией к A. fumigatus.

Материалы и методы.

В микологической клинике ФГБОУ ВО СЗГМУ им. И.И. Мечникова Минздрава России провели проспективное исследование, в которое включили 41 больного бронхиальной астмой. Контрольную группу составили 16 условно здоровых людей, сопоставимых по возрасту и полу, без аллергических заболеваний в анамнезе.

Все участники подписали добровольное информированное согласие на проведение исследования. Протокол обследования пациентов и практически здоровых людей отвечал этическим нормам Хельсинской декларации и был одобрен локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО «Северо-Западный государственный медицинский университета имени И.И. Мечникова» МЗ РФ (Протокол № 2 от 03.02.2021). Все пациенты соответствовали общим критериям включения в исследование: диагноз «БА», тяжелое/среднетяжелое течение, возраст 18 лет и старше, отсутствие острых респираторных заболеваний в течение предшествующих 4 недель. Критериями включения в контрольную группу были: отсутствие респираторной патологии, хронической инфекционной и неинфекционной патологии, гельминтной инвазии, декомпенсированных состояний, отрицательный аллергологический анамнез, неотягощенная по БА и другим аллергическим заболеваниям наследственность.

Уровни общего IgE (Полигност, Россия), специфических IgE (sIgE) (АлкорБио, Россия), TARC (R&D, США) в сыворотке крови определяли с помощью иммуноферментных тест-систем в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя.

Клинический анализ крови выполняли на гематологическом анализаторе DxH-800 (Beckman Coulter, США). Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови было выполнено методом 6-цветного цитофлуориметрического анализа с использованием проточного цитометра Navios™ (Beckman Coulter, США). Подготовку образцов периферической крови и настройку цитофлуориметра проводили в соответствии с национальными рекомендациями [7]. Субпопуляцию Т-хелперов (Тh) клеток памяти выделяли по фенотипу CD4+CD45RA– и анализировали уровень экспрессии на них следующих хемокиновых рецепторов: CCR4, CCR6, CXCR3 и CXCR5. Окраску антителами проводили в соответствии с рекомендациями производителей. В работе использовали моноклональные антитела, конъюгированных с флуорохромами: CD4/PerCP, CD45RA/PE/Cy7, CD183(CXCR3)/AlexaFluor488, CD194(CCR4)/PE, CD196(CCR6)/PE-Dazzle™594 и CD185(CXCR5)/Alexa Fluor 647 (Biolegend, США). После внесения антител образцы тщательно перемешивали, затем инкубировали при комнатной температуре 15 минут в защищенном от света месте. По завершении инкубации вносили 500 мкл лизирующего раствора VersaLyse Lysing Solution (Beckman Coulter, США) с добавлением фиксирующего раствора Fixative Solution IOTest 3 (12,5 мкл) (Beckman Coulter, США). Через 10 минут инкубации при комнатной температуре в темноте образцы отмывали в 4 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ) 5 минут при 1500 оборотах в минуту, удаляли надосадок и восстанавливали лейкоцитарную взвесь в 400 мкл ФСБ. При цитометрическом анализе для каждого из образцов набирали не менее 5000 лимфоцитов. Полученные результаты анализировали при помощи программного обеспечения Navios™ Software v1.2 (Beckman Coulter, США) и выражали в виде % позитивных клеток от искомой популяции. Оценку Т-регуляторных лимфоцитов (Тreg) проводили методом проточной цитометрии при окрашивании лимфоцитов периферической крови моноклональными антителами CD4/FITC, CD127/PC7 и CD25/PE (Beckman Coulter, США). Подготовку проб осуществляли в тех же условиях, что и при 6-цветном анализе.

С целью изучения антиген-специфической продукции IFNγ, IL-10 и IL-13 к 100 мкл разведенной в 5 раз крови добавляли 100 мкл аллергена A.fumigatus (АлкорБио, Россия), в конечной концентрации 10 мкг/мл. Для разведения крови и аллергена использовали полную питательную среду (ППС): среда RPMI 1640 с добавлением L-глутамина (Биолот, Россия), 200 мкг/мл гентамицина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Биолот, Россия). В предварительных экспериментах были определены оптимальная доза аллергена и сроки культивирования клеток. Для спонтанной продукции цитокинов в лунки 96-луночного планшета вносились по 100 мкл ППС. Через 144 часа инкубации образцов при 37°С в атмосфере 5% СО2 в СО2-инкубаторе (MCO-5A Sanyo™, Япония) отбирали надосадочную жидкость, аликвотировали и хранили при –20ºC до проведения анализа. Содержание цитокинов в полученных образцах определяли методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческих тест-систем (Вектор-Бест, Россия) и (R&D, США) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя.

Для изучения функции внешнего дыхания использовали спирометрию методом выполнения петли «объем-поток» с компьютерной обработкой результатов исследования. Учитывали следующие показатели: объем форсированного выдоха за первую секунду (ОФВ1), форсированная жизненная емкость легких (ФЖЕЛ), индекс Тиффно. По показаниям выполняли компьютерную томографию (КТ) легких в режиме высокого разрешения.

Диагноз, степень тяжести и уровень контроля над течением БА устанавливали в соответствии с рекомендациями рабочей группы GINA (Global Initiative for Asthma, updated, 2022) [8]. При оценке контроля над симптомами БА ориентировались на жалобы, клинические проявления, данные спирометрии с проведением теста на обратимость. Также использовали опросник АСТ (Asthma Control Test), который является краткой и доступной анкетой, содержит 5 вопросов с 5-бальной оценкой ответов. Сумма 25 баллов означают полный контроль БА, 20-24 - неполный контроль, 19 баллов и меньше - указывает на отсутствие контроля. С помощью АСТ оценивали уровень контроля БА за последние 4 недели.

 Для выявления микогенной сенсибилизации и аллергического бронхолегочного аспергиллеза (АБЛА) использовали рекомендации рабочей группы ISHAM (International Society for Human and Animal Mycology, 2013). Критериями микогенной сенсибилизации были: положительный кожный прик-тест (≥3 мм) и/или выявление в сыворотке крови уровня специфического IgE к грибковому аллергену, соответствующего классу 1 и выше (≥0,35 МЕ/мл) [9].

Полученные в процессе исследования данные обрабатывали с помощью программной системы STATISTICA 10 (StatSoft, США). Нормальность распределения количественных данных проверяли с помощью критерия Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилка. Изучаемые характеристики представляли медианами, нижним и верхним квартилями (Ме (Q0,25;Q0,75). Для оценки значимости различий использовали непараметрический U-критерий Манна–Уитни. Для выявления корреляционных взаимосвязей между двумя количественными параметрами использовали непараметрический метод ранговой корреляции по Спирмену c вычислением коэффициента ранговой корреляции (r). Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты.

На основании результатов клинико-инструментального обследования больные БА были разделены на три группы: 16 больных БА без сенсибилизации к A fumigatus (БА Asp-) (женщин – 80,7%), 10 больных БА с сенсибилизацией к A fumigatus (БА Asp+) (женщин – 77,8%), 15 больных, у которых на фоне БА сформировался АБЛА (женщин – 80,2%). Контрольную группу составили 16 здоровых добровольцев (женщин – 75,0%). Группы не различались между собой по возрасту и полу (табл. 1).

Анализ спирометрических характеристик выявил, что показатель ОФВ1 в группах больных АБЛА и БА Asp+ был значимо ниже, чем у больных БА Asp- (65,0% (60,0 - 70,0) и 64,0% (56,5 - 81,5) vs 81,0 % (67,0 – 91,1); p=0,015; p=0,005, соответственно), что может быть связано с более выраженным воспалением стенки бронхов, и утяжелением течения БА при сочетании с сенсибилизацией к A.fumigatus. Статистически значимых различий по результатам заполнения опросника АСТ у больных исследуемых групп не установлено. Однако выявлена тенденция к снижению среднего балла по мере возрастания показателей, отражающих степень сенсибилизации к A.fumigatus (табл. 1).

Во всех исследуемых группах больных установлено статистически значимое повышение уровня общего IgE по сравнению с группой контроля (p=<0,001). Содержание общего IgE у больных АБЛА составило 2332,5 МЕ/мл (1147,0 - 4530,0) и было значимо выше, чем в группах больных БА Asp+ (659,0 МЕ/мл (300,0 - 700,0; p<0,001) и БА Asp- (159,0 МЕ/мл (72,0 - 441,0); p<0,001). Кроме того, данный показатель был значимо выше у больных БА Asp+ по сравнению с пациентами БА Asp- (p=0,012) (рис. 1А). Уровни sIgE к A.fumigatus различались между больными АБЛА и БА Asp+ (2,23 МЕ/мл (1,10 - 4,14) vs 0,72 МЕ/мл (0,50 - 1,60), p=0,019) и значимо превышали показатели пациентов с БА Asp- (0,00 МЕ/мл (0,00 - 0,02); p<0,001, p<0,001, соответственно) (рис. 1Б).

Известно, что эозинофилы крови могут быть маркером эозинофильного воспаления в дыхательных путях у пациентов с БА, а эозинофилия является признанным прогностическим фактором обострения заболевания. Абсолютное число эозинофилов в группе больных АБЛА составило 0,41х109/л (0,37 - 0,75) и было значимо выше по сравнению с показателями пациентов с БА Asp- (0,30 х 109/л (0,07 - 0,43); p=0,023) и контрольной группы (0,09 х 109/л (0,06 - 0,20); p<0,001). Показатели в группах больных БА Asp+ и БА Asp- не различались между собой (p = 0,36) (рис. 1В).

Учитывая данные о патогенетических механизмах взаимодействия A.fumigatus с эпителиальными клетками дыхательных путей больных БА, в нашем исследовании был определен уровень тимус-ассоциированного регуляторного хемокина (TARC, от англ. «thymus andactivation-regulated chemokine»), который участвует в детерминации иммунного ответа в сторону Т2-звена [10]. Установлено существенное повышение показателей TARC во всех группах, по сравнению с группой контроля (p<0,001). Выявлены значимые различия содержания данного хемокина у больных АБЛА - 811,0 пг/мл (686,5 - 1039,0) по сравнению с группой БА Asp+ (425,0 пг/мл (295,0 - 625,0); p=0,011) и БА Asp- (287,0 пг/мл (238,5,0 - 310,0); p<0,001). Кроме того уровень TARC был значимо выше у больных БА Asp+ по отношению к пациентам БА Asp- (p=0,027) (рис. 1Г).

Важная роль TARC в прогрессировании аллергического воспаления у больных с микогенной сенсибилизацией подтверждена положительной корреляционной связью TARC с уровнем sIgE к A.fumigatus (r=0,776, p<0,001), общего IgE (r=0,823, p<0,001) и отрицательной с ОФВ1 (r=–0,552, p<0,001).

Многочисленные современные исследования посвящены иммунологическим изменениям, которые лежат в основе патогенеза различных фенотипов тяжелой БА [11, 12, 13, 14, 15]. Однако работы направленные на определение различных клонов Т-хелперов у больных с сенсибилизацией к Aspergillus spp. немногочисленны [5, 6]. В ходе нашего исследования мы определяли субпопуляционный состав лимфоцитов крови у пациентов с БА в зависимости от наличия сенсибилизации к A.fumigatus и развития АБЛА. Данные представлены в таблице 2. Значимых различий по количеству CD4+ Т-хелперов между группами больных и группой контроля установлено не было. Пациенты всех групп имели достоверно более высокий процент CD4+CD45RA– Т-клеток памяти по сравнению с показателем группы контроля, что согласуется с результатами других авторов [16, 17].

Установлено, что анализ экспрессии хемокиновых рецепторов позволяет судить не только о направлении миграции CD4+ Т-хелперов из кровотока, но может выступать и в качестве одного из методических приемов для определения поляризации клеток в сторону того или иного клона [18]. В нашем исследовании все CD4+CD45RA- Т-клетки памяти были разделены на CXCR5-негативные и CXCR5-позитивные клетки. Среди CXCR5-негативных CD4+CD45RA Т-хелперов памяти были выявлены следующие Th c различными фенотипами: Th1 (CXCR5CXCR3+CCR6CCR4), Th2 (CXCR5CXCR3CCR6CCR4+), «классические» Th17 (CXCR5CXCR3CCR6+CCR4+) и «неклассические» Th17.1 (CXCR5CXCR3+CCR6+CCR4).

Анализ субпопуляционного состава Т-клеток памяти не выявил достоверных различий по числу Th1 и «классических» Th17 между группами, включенными в исследование (табл. 2). Установлено, что у всех групп больных БА в периферической крови относительное количество Th2 значимо превышало показатели здоровых лиц (р=0,006, p<0,001, p<0,001, соответственно). Содержание Th17.1 было значимо ниже в группах больных с сенсибилизацией к A.fumigatus по сравнению с контрольными показателями (р=0,001, р=0,016, соответственно). Особенностью пациентов с АБЛА явилось значимо более высокое число Th2 - 11,10% (8,80 - 13,00) по сравнению с больными БА Asp+ (8,35% (7,40 - 9,80); p=0,035) и БА Asp- (8,05% (5,75 - 10,10); p=0,017). Выявлена положительная корреляционная связь между количеством Th2 и уровнями IgE (r=0,375, p=0,017), sIgE к A.fumigatus (r=0,339, p=0,030), TARC (r = 0,577, p=0,001) и отрицательная корреляционная связь с ОФВ1 (r=–0,381, p=0,022) и числом Th17.1 (r=–0,335, p=0,032).

Важной субпопуляцией T-хелперов являются фолликулярные Т-хелперы (Tfh) CXCR5-позитивные клетки. По аналогии с традиционными Тh, среди CXCR5+CD45RA- CD4+Т-клеток памяти были выделены: Tfh1 (CXCR3+CCR6CCR4), Tfh2 (CXCR3CCR6CCR4+), Tfh17 (CXCR3CCR6+CCR4-), Tfh17.1 (CXCR5+CXCR3+CCR6+) [18]. Процентное содержание Tfh2 у больных обеих групп с сенсибилизацией к A.fumigatus было значимо выше по сравнению с контрольными значениями (p=0,049; p=0,01, соответственно). У пациентов с АБЛА установлено более высокое число Tfh2 2,81% (2,00 - 3,70) по сравнению с больными БА Asp- (1,80% (1,60 - 2,85); p=0,021). Установлены снижение числа Tfh1 у больных БА Asp- по сравнению с показателями больных БА Asp+ (p=0,031) и контрольной группы (p=0,040). У больных БА Asp+ выявлено повышение количества Tfh17 по сравнению со значениями условно здоровых лиц (p=0,042). Значимых различий в содержании Tfh17.1 между группами включенными в исследование установлено не было. Выявлена положительная корреляционная связь между количеством Tfh2 и уровнями IgE (r=0,383, p=0,015), sIgE к A.fumigatus (r=0,373, p=0,016) и TARC (r=0,380, p=0,021).

Установлено, что относительное количество CD4+CD127-CD25+ Тreg у пациентов с АБЛА, БА Asp+ и БА Asp- достоверно превышало показатель контрольной группы (11,00 % (9,10 – 14,00), 10,50% (7,50 – 12,85) и 10,20% (7,00-12,15) vs 6,7% (5,75 -7,00); p<0,001, p=0,002, p=0,002, соответственно). Известно, что Тreg играют важную роль в поддержании иммунного гомеостаза [19]. Однако значимых различий по числу Тreg между исследуемыми группами больных не выявлено.

На заключительном этапе исследования провели сравнительный анализ уровней патогенетически значимых цитокинов, продуцируемых клетками цельной крови больных БА Asp- и АБЛА в ответ на инкубацию с аллергеном A. fumigatus. Для анализа цитокинового профиля проводили вычисления индекса стимуляции (ИС) как определение соотношения индуцированной продукции цитокинов к их спонтанной выработке. Установлено, что у здоровых доноров аллерген A. fumigatus активировал лимфоциты к продукции IFNγ, но не к выработке IL-10 и IL-13 (табл. 3), что согласуется с результатами других авторов [6]. В группе больных АБЛА по сравнению с группой контроля были выявлены значимо более низкие уровни IFNγ (15,0 пг/мл (10,0 - 32,0) vs. 32,0 пг/мл (20,8 - 49,0); p=0,001) и значения ИС (1,00 (0,98 - 1,37) vs. 5,76 (2,14 - 11,01); p<0,001) в ответ на индукцию грибковым аллергеном. Напротив, клетки крови больных АБЛА синтезировали более высокие уровни IL-10 (126,0 пг/мл (94,4 - 159,0) vs 21,2 пг/мл (10,0 - 36,0) и 24,5 пг/мл (22,0 - 32,5); p<0,001, p<0,001, соответственно) и IL-13 (104,0 пг/мл (72,4-250,0) vs 44,5 пг/мл (42,0 - 56,0) и 59,0 пг/мл (38,4 - 59,6); p<0,001, p=0,001, соответственно) по сравнению с показателями больных БА Asp- и здоровых лиц. Следовательно, индексы стимуляции для IL-10 (4,96 (2,95 - 41,83) vs 0,58 (0,25 - 1,55) и 1,14 (1,06 - 1,50); p=0,001, p=0,001, соответственно) и IL-13 (3,67 (2,08 - 6,56) vs 0,97 (0,84 – 1,10) и 1,09 (0,95 - 1,20); p<0,001, p=0,001, соответственно) значимо отличались от значений больных БА Asp- и контрольной группы.

В группе больных БА Asp- не было выявлено способности грибкового аллергена стимулировать клетки крови к выработке IL-10 и IL-13, так как показатели ИС не отличались от контрольных значений (p=0,13; p=0,09) (табл. 3). Полученные данные могут свидетельствовать о выраженной активации клонов Т-лимфоцитов, специфичных к другим аэроаллергенам, но не к плесневым микромицетам, что подтверждает отсутствие у больных БА Asp- sIgЕ к A.fumigatus. Таким образом, антиген-специфическая стимуляция клеток крови больных АБЛА вызвала достоверно более высокую продукцию IL-10 и IL-13 и низкую выработку IFNγ по сравнению со значениями в группе контроля и БА.

Обсуждение.

Опубликованы результаты исследований, согласно которым микогенная сенсибилизация ассоциирована с тяжелым течением БА, развитием бронхоэктазов и фиброза. [20, 21]. В работе Woolnough K.F. с соавт. показано, что уровень sIgE к термотолерантным нитчатым грибам, в частности к A.fumigatus, но не уровень общего IgE, был взаимосвязан с фиксированной обструкцией воздушного потока и рядом радиологических изменений у больных БА различной степени тяжести. Авторы сделали вывод о возможном риске повреждения легких у всех больных с сенсибилизацией к A.fumigatus независимо от того, соответствуют ли они критериям АБЛА [22]. Сходные результаты были получены нами ранее. Показано, что сенсибилизация к A fumigatus, но не к другим аэроаллергенам, существенно ухудшает течение БА [23]. В настоящем исследовании у больных с сенсибилизацией к A.fumigatus установлены худшие показатели ОФВ1 и результатов ACT. Выявлена отрицательная корреляционная связь между уровнями sIgE к A.fumigatus и показателем ОФВ1 (r=–0,605, p<0,001). Полученные данные указывают на более выраженное воспаление и возможность деструктивных изменений в легких у больных БА с сенсибилизацией к A.fumigatus, что диктует необходимость дальнейшего детального изучения особенностей иммунопатогенеза микогенной аллергии.

На современном этапе известно, что иммунные реакции, возникающие в дыхательных путях при контакте с грибковыми аллергенами, вовлекают тучные клетки, базофилы, эозинофилы, врожденные лимфоидные клетки, М2-поляризованные макрофаги и Th2 [24]. Вдыхаемые грибковые аллергены поглощаются дендритными клетками (DCs). Активированные DCs мигрируют в дренирующие лимфатические узлы, где они контролируют дифференцировку CD4+ T-клеток [25]. Дифференцировка CD4+ T-клеток в Th2 зависит от TSLP, TARC/CCL17 и MCD/CCL22. Появляется все больше доказательств того, что именно TARC играет важную роль в патогенезе аллергических реакций [10]. Так установлено более высокое содержание TARC в сыворотке крови у пациентов с БА по сравнению с контрольной группой. Обращает внимание, что концентрация хемокина увеличивалась с возрастом [26]. Yormaz B с соавт. сообщили, что сывороточные уровни TARC можно использовать в качестве биомаркеров эозинофильного фенотипа БА [27].

В соответствии с ранее опубликованными данными [28], мы выявили значимые различия уровней TARC у больных АБЛА и больных БА с сенсибилизацией к A.fumigatus по сравнению с показателями больных группы сравнения. Положительная корреляционная связь TARC с уровнями общего IgE, sIgE к A.fumigatus и отрицательная с ОФВ1 подтверждает важное значение данного хемокина в развитии аллергического воспаления у больных с микогенной сенсибилизацией и указывает на возможность его использования в дифференциальной диагностике.

После активации аллергеном Т-клетки разделяются на популяции эффекторных Т-клеток и Т-клетки памяти, последние подразделяются на CCR7 эффекторные Т-клетки памяти (Tem) и CCR7+ центральные Т-клетки памяти (Tcm) [18]. Считают, что Т-клетки памяти связаны с хроническими воспалительными заболеваниями [29, 30].Однако конкретные субпопуляции Т-клеток памяти человека, ответственные за аллергическое воспаление при различных эндотипах БА, недостаточно хорошо охарактеризованы. Поэтому крайне важно определить, какие субпопуляции Т-клеток памяти, связаны с хроническим воспалением в легких у больных с сенсибилизацией к A.fumigatus. Можно предположить, что Т-клетки больных БА с сенсибилизацией к A.fumigatus обладают уникальными фенотипами и функциями, которые могут поддерживать хроническое воспаление в нижних дыхательных путях.

В ходе исследования было выявлено значительное увеличение циркулирующих CD4+CD45RAТ-клеток памяти у всех больных БА по сравнению с группой контроля. Известно, что CD4+Т-клетки памяти могут быстро пролиферировать в ответ на повторное проникновение специфического антигена и приобретать эффекторный фенотип с секрецией цитокинов и хемокинов [31]. Следовательно, долгоживущие Т-клетки памяти, обнаруженные в крови пациентов с БА, могут играть важную роль в хроническом воспалении нижних дыхательных путей в ответ на различные аллергены. Ранее сообщалось об увеличении числа CCR4+ Тh2 у пациентов с БА [17, 32]. Анализ наших данных установил, что у всех пациентов, включенных в исследование, повышено число циркулирующих Th2 клеток памяти по сравнению с контрольной группой. У больных АБЛА число Тh2 клеток памяти было выше, чем у больных БА с сенсибилизацией и без к A.fumigatus. Напротив, установлено снижение числа Th17.1 у больных АБЛА и БА с сенсибилизацией к A.fumigatus по сравнению с показателями условно здоровых добровольцев.

Известно, что после активации Th2 продуцируют ряд провоспалительных цитокинов: IL-4, IL-13, IL-5 и IL-9. За пролиферацию аллерген-специфических В-клеток и переключение изотипов иммуноглобулинов на IgE класс отвечают IL-4 и IL-13. Главный цитокин Тh2, IL-13, индуцирует метаплазию бокаловидных клеток, фиброз и гиперреактивность бронхов, и в сочетании с IL-5, способствует пролиферации и выживанию эозинофилов в дыхательных путях [10]. В нашем исследовании, усиление активности Th2 клеток памяти у пациентов с АБЛА подтверждает повышение секреции IL-13 на фоне снижения выработки IFNγ в ответ на специфическую стимуляцию клеток крови грибковым аллергеном по сравнению с группой контроля и больными БА. Полученные данные согласуются с ранее представленными результатами в другом исследовании. Показано, что у пациентов с АБЛА наблюдалось увеличение индуцированных Aspergillus spp. IL-5 и IL-13 и снижение продукции IFNγ по сравнению со здоровым контролем [5]. Установленная нами положительная корреляционная связь между количеством Тh2 клетками памяти и уровнями sIgE, IgE, TARC и отрицательная с ОФВ1 подтверждает клиническую значимость данного показателя у пациентов с микогенной сенсибилизацией. Значимые различия по числу CXCR3+ Th1 и «классических» CCR6+CCR4+ Th17 в крови пациентов и контрольных субъектов не были выявлены, что совпадает с результатами других авторов [17].

После активации антигеном CXCR5+ В-лимфоциты мигрируют в первичные фолликулы лимфатических узлов, где происходит переключение изотипа и «созревание» аффинитета иммуноглобулинов при участи фолликулярных дендритных клеток и Tfh Отличительной чертой Tfh является экспрессия CXCR5. Считается, что Tfh2 легко вступают в контакт с В-клетками для активации через CXCL13, лиганд CXCR5, секретируемый различными клетками, включая фолликулярные дендритные клетки, эндотелиальные клетки, а также клетки Tfh [33]. Опубликованы сведения о связи дифференцировки Th2 и Tfh2, согласно которым они вносят вклад в патогенез аллергического воспаления, опосредованного IgE [12, 34]. В последнее время появляются новые данные о том, что Tfh, а не Тh2, играют решающую роль в контроле продукции IgE [35]. В нашем исследовании наибольшее число Tfh2 установлено у больных АБЛА, а также у больных бронхиальной астмой с сенсибилизацией к A.fumigatus и выявлена положительная корреляционная связь между количеством Tfh2 и уровнями IgE, sIgE к A.fumigatus и TARC, но отсутствовала связь с показателями функции дыхания.

Известно, что CD4+ Т-лимфоциты содержат субпопуляцию Т-регуляторных клеток, обеспечивающих аутотолерантность к собственным антигенам и сдерживающих чрезмерную активность клеток иммунной системы. Адаптивные регуляторные Т-хелперы образуются при иммунном ответе и служат фактором, ограничивающим иммунный ответ на его заключительных стадиях за счет действия CTLA-4 и продукции противовоспалительных цитокинов. Адаптивные Treg характеризуются экспрессией TGF-β, IL-10 и IL-4. TGF-β и IL-10 способствуют подавлению иммунного ответа, опосредованного функциональной активностью Тh1 и Тh2 [19]. В настоящем исследовании было установлено, что наиболее высокое число Treg выявлено у больных АБЛА, что согласуется с повышенной продукцией IL-10 у данной категории больных. Усиление активности Treg может отражать степень противодействия хронической воспалительной реакции, поддерживаемой грибковыми аллергенами в том случае, когда термотолерантные грибы способны длительно сохраняться в дыхательных путях [24].

Заключение

Результаты проведенного исследования соответствуют сформированным ранее представлениям о доминировании эозинофильного воспаления, развивающегося в дыхательных путях больных БА с сенсибилизацией к A.fumigatus. Положительная корреляционная связь числа циркулирующих Th2 и Tfh2 с активностью синтеза плазматическими клетками IgE и sIgE к A.fumigatus, а также уровнями TARC в сыворотке крови указывает на важную роль этих клеток в патогенезе микогенной аллергии. Учитывая все более широкое использование антицитокиновой биологической терапии у больных БА, изучение патогенетических механизмов БА с сенсибилизацией к A.fumigatus необходимо для дальнейшей разработки терапевтических моноклональных антител, применение которых повысит уровень контроля БА и позволит снизить объем системной стероидной терапии.

 

×

About the authors

Ya. I. Kozlova

North-Western State I.I. Mechnikov Medical University

Email: kozlova510@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4602-2438
SPIN-code: 5842-6039

 

Candidate of Medical Sciences (PhD), Associate Professor

Russian Federation, 194291, Санкт-Петербург, ул. Сантьяго-де-Куба, д. 1/28

E. V. Frolova

North-Western State I.I. Mechnikov Medical University

Email: labimmune@yandex.ru

Candidate of Medical Sciences (PhD), Head of the Laboratory

Russian Federation, 194291, Russian Federation, Saint-Petersburg, Santiago de Cuba street, 1/28

I. V. Kudryavtsev

Institute of Experimental Medicine;
Pavlov First St. Petersburg State Medical University

Email: igorek1981@yandex.ru

Candidate of Biological Sciences (PhD), Head of the Laboratory

Russian Federation

A. E. Uchevatkina

North-Western State I.I. Mechnikov Medical University

Email: a.uchevatkina@szgmu.ru

Candidate of Medical Sciences (PhD), Senior Researcher

Russian Federation

L. V. Filippova

North-Western State I.I. Mechnikov Medical University

Email: larisa.filippova@szgmu.ru

Candidate of Medical Sciences (PhD), Senior Researcher

Russian Federation

O. V. Aak

North-Western State I.I. Mechnikov Medical University

Email: oleg.aak@szgmu.ru

Candidate of Chemical Sciences (PhD), Leading Researcher

Russian Federation

A. E. Taraskina

North-Western State I.I. Mechnikov Medical University

Email: anastasiya.taraskina@szgmu.ru

Candidate of Biological Sciences (PhD), Head of the Laboratory

Russian Federation

A. V. Sobolev

North-Western State I.I. Mechnikov Medical University

Email: sobolev757@rambler.ru

 

Doctor of Medicine, professor of the department

Russian Federation

N. V. Vasilyeva

North-Western State I.I. Mechnikov Medical University

Email: mycobiota@szgmu.ru

Doctor of Biological Sciences (DSc), professor, Director of Kashkin Research Institute of Medical Mycology

Russian Federation

N. N. Klimko

North-Western State I.I. Mechnikov Medical University

Author for correspondence.
Email: n_klimko@mail.ru

Doctor of Medicine, professor, Head of the department

Russian Federation

Supplementary files

There are no supplementary files to display.


Copyright (c) Kozlova Y.I., Frolova E.V., Kudryavtsev I.V., Uchevatkina A.E., Filippova L.V., Aak O.V., Taraskina A.E., Sobolev A.V., Vasilyeva N.V., Klimko N.N.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 64788 от 02.02.2016.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies