Russian Journal of Infection and ImmunityRussian Journal of Infection and ImmunityИнфекция и иммунитет2220-76192313-7398SPb RAACI198610.15789/2220-7619-TIO-1986ORIGINAL ARTICLESОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИResearch ArticleThe influence of Aspergillus fumigatus micromycetes on immune response regulation in patients with asthmaВлияние микроскопических грибов Aspergillus fumigatus на регуляцию иммунного ответа больных бронхиальной астмойhttps://orcid.org/0000-0002-4602-24385842-6039KozlovaYana I.КозловаЯна Игоревна
Russian Federation

PhD (Medicine), Associate Professor, Department of Clinical Mycology, Allergology and Immunology, P.N. Kashkin Research Institute of Medical Mycology

к.м.н., доцент кафедры клинической микологии, аллергологии и иммунологии НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина

kozlova510@mail.ruFrolovaE. V.ФроловаЕ. В.
Russian Federation

PhD (Medicine), Head of the Research Laboratory of Allergology and Immunology, P.N. Kashkin Research Institute of Medical Mycology

к.м.н., зав. НИЛ иммунологии и аллергологии НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина

labimmune@yandex.ruKudryavtsevI. V.КудрявцевИ. В.
Russian Federation

PhD (Biology), Head of the Cell Immunology Laboratory, Department of Immunology; Assistant Professor, Department of Immunology

к.б.н., зав. лабораторией клеточной иммунологии отдела иммунологии; доцент кафедры иммунологии

igorek1981@yandex.ruUchevatkinaA. E.УчеваткинаА. Е.
Russian Federation

PhD (Medicine), Senior Researcher, Research Laboratory of Allergology and Immunology, P.N. Kashkin Research Institute of Medical Mycology

к.м.н., старший научный сотрудник НИЛ иммунологии и аллергологии НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина

a.uchevatkina@szgmu.ruFilippovaL. V.ФилипповаЛ. В.
Russian Federation

PhD (Medicine), Senior Researcher, Research Laboratory of Allergology and Immunology, P.N. Kashkin

к.м.н., старший научный сотрудник НИЛ иммунологии и аллергологии НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина

larisa.filippova@szgmu.ruAakO. V.АакО. В.
Russian Federation

PhD (Chemistry), Leading Researcher, Research Laboratory of Allergology and Immunology, P.N. Kashkin Research Institute of Medical Mycology

к.х.н., ведущий научный сотрудник НИЛ иммунологии и аллергологии НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина

oleg.aak@szgmu.ruTaraskinaA. E.ТараскинаА. Е.
Russian Federation

PhD (Biology), Head of the Research Laboratory of Molecular Genetic Microbiology, P.N. Kashkin Research Institute of Medical Mycology

к.б.н., зав. НИЛ молекулярно-генетической микробиологии НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина

anastasiya.taraskina@szgmu.ruSobolevA. V.СоболевА. В.
Russian Federation

PhD, MD (Medicine), Professor of the Department of Clinical Mycology, Allergology and Immunology, P.N. Kashkin Research Institute of Medical Mycology

д.м.н., профессор кафедры клинической микологии, аллергологии и иммунологии НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина

sobolev757@rambler.ruVasilyevaN. V.ВасильеваН. В.
Russian Federation

PhD, MD (Biology), Professor, Honored Scientist of the Russian Federation, Director, P.N. Kashkin Research Institute of Medical Mycology

д.б.н., профессор, заслуженный деятель науки РФ, директор НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина

mycobiota@szgmu.ruKlimkoN. N.КлимкоН. Н.
Russian Federation

PhD, MD (Medicine), Professor, Head of the Department of Clinical Mycology, Allergology and Immunology, P.N. Kashkin Research Institute of Medical Mycology

д.м.н., профессор, зав. кафедрой клинической микологии, аллергологии и иммунологии НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина

n_klimko@mail.ruNorth-Western State Medical University named after I.I. MechnikovФГБОУ ВО Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. МечниковаInstitute of Experimental MedicineФГБНУ Институт экспериментальной медициныPavlov First St. Petersburg State Medical UniversityФГБОУ ВО Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова МЗ РФ1711202230122022126106910802206202218082022Copyright ©; 2022, Kozlova Y.I., Frolova E.V., Kudryavtsev I.V., Uchevatkina A.E., Filippova L.V., Aak O.V., Taraskina A.E., Sobolev A.V., Vasilyeva N.V., Klimko N.N.Copyright ©; 2022, Козлова Я.И., Фролова Е.В., Кудрявцев И.В., Учеваткина А.Е., Филиппова Л.В., Аак О.В., Тараскина А.Е., Соболев А.В., Васильева Н.В., Климко Н.Н.2022Kozlova Y.I., Frolova E.V., Kudryavtsev I.V., Uchevatkina A.E., Filippova L.V., Aak O.V., Taraskina A.E., Sobolev A.V., Vasilyeva N.V., Klimko N.N.Козлова Я.И., Фролова Е.В., Кудрявцев И.В., Учеваткина А.Е., Филиппова Л.В., Аак О.В., Тараскина А.Е., Соболев А.В., Васильева Н.В., Климко Н.Н.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://iimmun.ru/iimm/article/view/1986

Introduction. Aspergillus fumigatus is able not only to sensitize patients with atopy, but also to colonize the respiratory tract, remaining a constant source of allergens due to the small spore size and thermal tolerance. Currently, the role of micromycetes in the immunopathogenesis of asthma has been poorly studied. The objective was to evaluate the features of the immune response regulation in patients with allergic bronchopulmonary aspergillosis (ABPA) or asthma with sensitization to A. fumigatus. Materials and methods. There were enrolled 15 patients with ABPA, 10 patients with asthma with sensitization to A. fumigatus, 16 patients with asthma without sensitization to A. fumigatus. The control group consisted of 16 apparently healthy volunteers. All patients underwent a clinical and functional examination. The subpopulations of blood lymphocytes were assessed by flow cytometry. The A. fumigatus allergen was added to peripheral blood samples to evaluate the production of IFNγ, IL-10 and IL-13. The serum cytokine levels in cell culture supernatants, as well as total IgE, A. fumigatus-specific IgE (sIgE) as well as thymus and activation-regulated chemokine (TARC) level were measured by enzyme-linked immunosorbent assay. Results. Significantly higher serum levels of total IgE, A. fumigatus-specific sIgE and TARC were found in patients with ABPA and asthma with sensitization to A. fumigatus compared to patients with asthma without sensitization to A. fumigatus. The results of lymphocyte immunophenotyping revealed significant excess of memory Th2 cells and T-regulatory cells in all patients with asthma compared to the control group. The count of Tfh2 was higher but memory Th17.1 cells were lower in patients with sensitization to A. fumigatus compared to those of apparently healthy volunteers. Patients with ABPA had significantly higher count of memory Th2 cells and TARC level compared to patients with asthma sensitized to A. fumigatus. The increased activity of memory Th2 cells is confirmed by increased secretion of IL-13 and IL-10 following along with decreased IFNγ production in response to specific fungal allergen stimulation of blood cells compared to the patients with asthma and the control group. A positive correlation was revealed between the count of memory Th2 cells and the levels of sIgE, IgE, TARC, a negative correlation — with FEV1. Conclusion. Thus, exposure to A. fumigatus significantly enhances the activity of memory Th2 cells in patients with asthma which can lead to severe disease course and development of allergic bronchopulmonary aspergillosis. The features of the immune response identified dictate a need for a personalized approach to choose therapeutic tactics in such patients.

Введение. Благодаря мелким размерам спор и термотолерантности, Aspergillus fumigatus, способны не только сенсибилизировать больных с атопией, но и колонизировать дыхательные пути, оставаясь постоянным источником аллергенов. В настоящее время роль микроскопических плесневых грибов в иммунопатогенезе бронхиальной астмы изучена недостаточно. Цель: оценить особенности регуляции иммунного ответа больных аллергическим бронхолегочным аспергиллезом (АБЛА) и бронхиальной астмой (БА) с сенсибилизацией к A. fumigatus. Материалы и методы. В исследование включили 15 больных АБЛА, 10 больных БА с сенсибилизацией к A. fumigatus, 16 больных БА без сенсибилизации к A. fumigatus. Группу контроля составили 16 условно здоровых добровольцев. Всем больным проводили клинико-функциональное обследование. Субпопуляционный состав лимфоцитов крови определяли методом проточной цитометрии. Для оценки продукции IFNγ, IL-10 и IL-13 к образцам периферической крови добавляли аллерген A. fumigatus. Иммуноферментным методом определяли содержание цитокинов в супернатантах клеточных культур, а также уровни общего IgE, специфических IgE (sIgE) к A. fumigatus, тимус-ассоциированного регуляторного хемокина (TARC) в сыворотке крови. Результаты. У больных АБЛА и БА с сенсибилизацией к A. fumigatus по сравнению с больными БА без сенсибилизации к A. fumigatus установлены значимо более высокие уровни общего IgE, sIgE к A. fumigatus и TARC в сыворотке крови. Анализ результатов иммунофенотипирования лимфоцитов выявил у всех больных БА значимое превышение показателей Th2 клеток памяти и Т-регуляторных клеток по сравнению с группой контроля. У больных с сенсибилизацией к A. fumigatus количество Tfh2 было выше, а Th17.1 клеток памяти ниже по сравнению с показателями условно здоровых добровольцев. У больных АБЛА установлены значимо более высокое количество Th2 клеток памяти и содержание TARC по сравнению с больными БА с сенсибилизацией к A. fumigatus. Усиление активности Th2 клеток памяти подтверждает повышенная секреция IL-13 и IL-10 на фоне снижения выработки IFNγ в ответ на специфическую стимуляцию клеток крови аллергеном гриба по сравнению с больными БА и группой контроля. Выявлена положительная корреляционная связь между количеством Тh2 клеток памяти и уровнями sIgE, IgE, TARC и отрицательная с ОФВ1. Заключение. Таким образом, контакт с A. fumigatus существенно усиливает активность Th2 клеток памяти у больных БА, что может приводить к тяжелому течению заболевания и формированию аллергического бронхолегочного аспергиллеза. Установленные особенности иммунного ответа диктуют необходимость персонифицированного подхода к выбору терапевтической тактики у данной категории больных.

allergic bronchopulmonary aspergillosisasthmamemory T-helper cellschemokinesimmune responseAspergillus fumigatusаллергический бронхолегочный аспергиллезбронхиальная астмаТ-хелперы клетки памятихемокиныиммунный ответAspergillus fumigatusБарковская М.Ш., Блинова Е.А., Гришина Л.В., Леонова М.И., Непомнящих В.М., Демина Д.В., Козлов В.А. Содержание CD4+ и CD8+ эффекторных клеток памяти и пролиферативная активность Т-лимфоцитов при бронхиальной астме // Медицинская иммунология. 2019. T. 21, № 3. C. 503–516. [Barkovskaya M.S., Blinova E.A., Grishina L.V., Leonova M.I., Nepomniashchikch V.M., Demina D.V., Kozlov V.A. Contents of CD4+ and CD8+ effector memory cells and proliferative activity of T lymphocytes in bronchial asthma. Meditsinskaya immunologiya = Medical Immunology (Russia), 2019, vol. 21, no. 3, pp. 503–516. (In Russ.)] doi: 10.15789/1563-0625-2019-3-503-516Бибкова А.А., Сысоев К.А., Семенов А.В., Любимова Н.С., Арсентьева Н.А., Трофимов В.И., Тотолян Арег А. Значимость определения некоторых хемокинов и их рецепторов у больных бронхиальной астмой // Медицинская иммунология. 2012. T. 14, № 1–2. С. 109–188. [Bibkova A.A., Syssoev K.A., Semenov A.V., Lubimova N.S., Arsentieva N.A., Trofimov V.I., Totolian Areg A. Evaluation and clinical significance of chemokines and their specific receptors in patients with bronchial asthma. Meditsinskaya immunologiya = Medical Immunology (Russia), 2012, vol. 14, no. 1–2, pp. 109–188. (In Russ.)]Виткина Т.И., Новгородцева Т.П., Калинина Е.П., Лобанова Е.Г., Антонюк М.В. Иммунные механизмы формирования бронхиальной астмы контролируемого и частично контролируемого течения // Медицинская иммунология. 2019. T. 21, № 3. C. 495–502. [Vitkina T.I., Novgorodtseva T.P., Kalinina E.P., Lobanova E.G., Antonyuk M.V. Immune mechanisms for development of controlled and partially controlled asthma. Meditsinskaya immunologiya = Medical Immunology (Russia), 2019, vol. 21, no. 3, pp. 495–502. (In Russ.)] doi: 10.15789/1563-0625-2019-3-495-502Козлова Я.И., Учеваткина А.Е., Филиппова Л.В., Аак О.В., Кузнецов В.Д., Фролова Е.В., Васильева Н.В., Климко Н.Н. Сенсибилизация к Aspergillus spp. у больных бронхиальной астмой // Врач. 2021. T. 32, № 5. С. 50–55. [Kozlova Y., Uchevatkina A., Filippova L., Aak O., Kuznetsov V., Frolova E., Vasilyeva N., Klimko N. Sensitization to Aspergillus spp. in patients with asthma. Vrach = The Doctor, 2021, vol. 32, no. 5, pp. 50–55. (In Russ.)] doi: 10.29296/25877305-2021-05-09Козлова Я.И., Фролова Е.В., Филиппова Л.В., Учеваткина А.Е., Аак О.В., Соловьева Г.И., Климко Н.Н. Диагностические маркеры аллергического бронхолегочного аспергиллеза у больных бронхиальной астмой // Медицинская иммунология. 2018. T. 20, № 4. С. 561–570. [Kozlova Y.I., Frolova E.V., Filippova L.V., Uchevatkina A.E., Aak O.V., Solovyeva G.I., Klimko N.N. Diagnostic markers of allergic bronchopulmonary aspergilles in patients with bronchial asthma. Meditsinskaya immunologiya = Medical Immunology (Russia), 2018, vol. 20, no. 4, pp. 561–570. (In Russ.)] doi: 10.15789/1563-0625-2018-4-561-570Кудрявцев И.В., Борисов А.Г., Кробинец И.И., Савченко А.А., Серебрякова М.К., Тотолян Арег А. Хемокиновые рецепторы на Т-хелперах различного уровня дифференцировки: основные субпопуляции // Медицинская иммунология. 2016. T. 18, № 3. С. 239–250. [Kudryavtsev I.V., Borisov A.G., Krobinets I.I., Savchenko A.A., Serebriakova M.K., Totolian A.A. Chemokine receptors at distinct differentiation stages of T-helpers from peripheral blood. Meditsinskaya immunologiya = Medical Immunology (Russia). 2016, vol. 18, no. 3, pp. 239–250. (In Russ.)] doi: 10.15789/1563-0625-2016-3-239-250Смольникова М.В., Смирнова С.В., Ильенкова Н.А., Коноплева О.С. Иммунологические маркеры неконтролируемого течения атопической бронхиальной астмы у детей // Медицинская иммунология. 2017. T. 19, № 4. С. 453–460. [Smolnikova M.V., Smirnova S.V., Ilyenkova N.A., Konopleva O.S. Immunological markers of uncontrolled atopic bronchial asthma in children. Meditsinskaya immunologiya = Medical Immunology (Russia). 2017, vol. 19, no. 4, pp. 453–460. (In Russ.)] doi: 10.15789/1563-0625-2017-4-453-460Хайдуков С.В., Байдун Л.А., Зурочка А.В., Тотолян Арег А. Стандартизованная технология «Исследование субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови с применением проточных цитофлюориметров-анализаторов» (проект) // Медицинская иммунология. 2012. T. 14, № 3. С. 255–268. [Khaydukov S.V., Baydun L.A., Zurochka A.V., Totolian Areg A. Standardized technology «Research of lymphocytes subpopulation composition in peripheral blood using flow cytometry analyzers» (Draft). Meditsinskaya immunologiya = Medical Immunology (Russia), 2012, vol. 14, no. 3, pp. 255–268. (In Russ.)]Agarwal R., Chakrabarti A., Shah A., Gupta D., Meis J.F., Guleria R., Moss R., Denning D.W. For the ABPA complicating asthma ISHAM working group 2013. Allergic bronchopulmonary aspergillosis: review of literature and proposal of new diagnostic and classification criteria. Clin. Exp. Allergy, 2013, vol. 43, no. 8, pp. 850–873. doi: 10.1111/cea.12141Becker K.L., Gresnigt M.S., Smeekens S.P., Jacobs C.W., Magis-Escurra C., Jaeger M., Wang X., Lubbers R., Oosting M., Joosten L.A., Netea M.G., Reijers M.H., van de Veerdonk F.L. Pattern recognition pathways leading to a Th2 cytokine bias in ABPA patients. Clin. Exp. Allergy, 2015, vol. 45, pp. 423–437. doi: 10.1111/cea.12354Campbell J.J., Brightling C.E, Symon F.A., Qin S., Murphy K.E., Hodge M., Andrew D.P., Wu L., Butcher E.C., Wardlaw A.J. Expression of chemokine receptors by lung T cells from normal and asthmatic subjects. J. Immunol., 2001, vol. 166, no. 4, pp. 2842–2848. doi: 10.4049/jimmunol.166.4.2842Carsin A., Romain T., Ranque S., Reynaud-Gaubert M., Dubus J.-C., Mege J.-L., Vitte J. Aspergillus fumigatus in cystic fibrosis: an update on immune interactions and molecular diagnostics in allergic bronchopulmonary aspergillosis. Allergy, 2017, vol. 11, pp. 1632–1642. doi: 10.1111/all.13204Crotty S. T follicular helper cell biology: a decade of discovery and diseases. Immunity, 2019, vol. 50, no. 5, pp. 1132–1148. doi: 10.1016/j.immuni.2019.04.011Denning D.W., Pashley C., Hartl D., Wardlaw A., Godet C., Del Giacco S., Delhaes L., Sergejeva S. Fungal allergy in asthma-state of the art and research needs. Clin. Transl. Allergy, 2014, vol. 4: 14. doi: 10.1186/2045-7022-4-14Goh K., Yii A.C.A., Lapperre T., Chan A.K., Chew F.T., Chotirmall S.H., Koh M.S. Sensitization to Aspergillus species is associated with frequent exacerbations in severe asthma. J. Asthma Allergy, 2017, vol. 10, pp. 131–140. doi: 10.2147/JAA.S130459Hirata H., Yukawa T., Tanaka A., Miyao T., Fukuda T., Fukushima Y., Kurasawa K., Arima M. Th2 cell differentiation from naive CD4+ T cells is enhanced by autocrine CC chemokines in atopic diseases. Clin. Exp. Allergy, 2019, vol. 49, no. 4, pp. 474–483. doi: 10.1111/cea.13313Jo K.M., Lim H.K., Sull J.W., Choi E., Lee J.S., Cheong M.A., Hong M.H., Kim Y., Kim I.S. Thymus and activation-regulated chemokine (TARC)/CCL17 and IgE are associated with elderly asthmatics. Immun. Ageing, 2018, vol. 15: 13. doi: 10.1186/s12979-018-0118-7Jolink H., de Boer R., Willems L.N., van Dissel J.T., Falkenburg J.H., Heemskerk M.H. T helper 2 response in allergic bronchopulmonary aspergillosis is not driven by specific Aspergillus antigens. Allergy, 2015, vol. 70, no. 10, pp. 1336–1339. doi: 10.1111/all.12688Kamekura R., Shigehara K., Miyajima S., Jitsukawa S., Kawata K., Yamashita K., Nagaya T., Kumagai A., Sato A., Matsumiya H., Ogasawara N., Seki N., Takano K., Kokai Y., Takahashi H., Himi T., Ichimiya S. Alteration of circulating type 2 follicular helper T cells and regulatory B cells underlies the comorbid association of allergic rhinitis with bronchial asthma. Clin. Immunol., 2015, vol. 158, no. 2, pp. 204–211. doi: 10.1016/j.clim.2015.02.016Kurashima K., Fujimura M., Myou S., Ishiura Y., Onai N., Matsushima K. Asthma severity is associated with an increase in both blood CXCR3+ and CCR4+ T cells. Respirology, 2006, vol. 11, no. 2, pp. 152–157. doi: 10.1111/j.1440-1843.2006.00822.xLloyd C.M., Hessel E.M. Functions of T cells in asthma: more than just T(H)2 cells. Nat. Rev. Immunol., 2010, vol. 10, no. 12, pp. 838–848. doi:10.1038/nri2870Moaaz M., Youssry S., Baess A., Abed A., Moaaz M. Immune signature of CCR7+ central memory T cells associates with disease severity and Immunoglobulin E in bronchial asthma. Eur. Ann. Allergy Clin. Immunol., 2021, vol. 53, no. 3, pp. 115–127. doi: 10.23822/EurAnnACI.1764-1489.168Pashley C.H., Wardlaw A.J. Allergic fungal airways disease (AFAD): an under-recognised asthma endotype. Mycopathologia, 2021, vol. 186, no. 5, pp. 609–622. doi: 10.1007/s11046-021-00562-0Pepper M., Jenkins M.K. Origins of CD4(+) effector and central memory T cells. Nat. Immunol., 2011, vol. 12, no. 6, pp. 467–471. doi: 10.1038/ni.2038Ramirez-Ortiz Z.G., Means T.K. The role of dendritic cells in the innate recognition of pathogenic fungi (A. fumigatus, C. neoformans and C. albicans). Virulence, 2012, vol. 3, pp. 635–646. doi: 10.4161/viru.22295Sio Y.Y., Pang S.L., Say Y.H., Teh K.F., Wong Y.R., Shah S.M.R., Reginald K., Chew F.T. Sensitization to airborne fungal allergens associates with asthma and allergic rhinitis presentation and severity in the singaporean/malaysian population. Mycopathologia, 2021, vol. 186, no. 5, pp. 583–588. doi: 10.1007/s11046-021-00532-6Sjaastad L.E., Owen D.L., Tracy S.I., Farrar M.A. Phenotypic and functional diversity in regulatory T cells. Front. Cell. Dev. Biol., 2021, vol. 9: 715901. doi: 10.3389/fcell.2021.715901The Global Strategy for Asthma Management and Prevention, Global Initiative for Asthma (GINA) 2022. URL: https://ginasthma.org/gina-reports (10.08.2022)Tiwary M., Samarasinghe A.E. Initiation and pathogenesis of severe asthma with fungal sensitization. Cells, 2021, vol. 10, no. 4: 913. doi: 10.3390/cells10040913Varricchi G., Harker J., Borriello F., Marone G., Durham S.R., Shamji M.H. T follicular helper (Tfh ) cells in normal immune responses and in allergic disorders. Allergy, 2016, vol. 71, no. 8, pp. 1086–1094. doi: 10.1111/all.12878Wardlaw A.J., Rick E.M., Pur Ozyigit L., Scadding A., Gaillard E.A., Pashley C.H. New perspectives in the diagnosis and management of allergic fungal airway disease. J. Asthma Allergy, 2021, vol. 14, pp. 557–573. doi: 10.2147/JAA.S251709Wiest M., Upchurch K., Yin W., Ellis J., Xue Y., Lanier B., Millard M., Joo H., Oh S. Clinical implications of CD4+ T cell subsets in adult atopic asthma patients. Allergy Asthma Clin. Immunol., 2018, vol. 14: 7. doi: 10.1186/s13223-018-0231-3Woolnough K.F., Richardson M., Newby C., Craner M., Bourne M., Monteiro W., Siddiqui S., Bradding P., Pashley C.H., Wardlaw A.J. The relationship between biomarkers of fungal allergy and lung damage in asthma. Clin. Exp. Allergy, 2017, vol. 47, no. 1, pp. 48–56. doi: 10.1111/cea.12848Yao Y., Chen C.L., Yu D., Liu Z. Roles of follicular helper and regulatory T cells in allergic diseases and allergen immunotherapy. Allergy, 2021, vol. 76, no. 2, pp. 456–470. doi: 10.1111/all.14639Yormaz B., Menevse E., Cetin N., Esin Celik Z., Bakir H., Tulek B., Korez M.K., Suerdem M. Diagnostic value of thymus and activation-regulated chemokine and of periostin in eosinophilic asthma: a prospective study. Allergy Asthma Proc., 2021, vol. 42, no. 1, pp. e30–e39. doi: 10.2500/aap.2021.42.200102