Отправить статью по E-mail Получение иммунодиагностических препаратов из антигенов Toxocara canis для серодиагностики токсокароза у человека
- Авторы: Канина И.В.1, Новак А.И.1, Новак М.Д.1, Евдокимова О.В.1
-
Учреждения:
- ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. академика И.П. Павлова
- Выпуск: Том 12, № 2 (2022)
- Страницы: 391-396
- Раздел: КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
- Дата подачи: 11.10.2021
- Дата принятия к публикации: 03.01.2022
- Дата публикации: 13.05.2022
- URL: https://iimmun.ru/iimm/article/view/1804
- DOI: https://doi.org/10.15789/2220-7619-OID-1804
- ID: 1804
Цитировать
Полный текст
Аннотация
Токсокароз — гельминтозная инвазия человека, имеющая широкий круг хозяев с эпизоотическим распространением. Серопозитивность населения в странах с умеренным климатом составляет около 37%, в регионах с тропическим — до 92%. Практически все возрастные группы населения подвержены риску инвазии токсокарами. Иммунологический метод в настоящее время сохраняет диагностическое значение для токсокароза, так как реакция иммунной системы на гельминтов сопровождается формированием сенсибилизации, а техники и способы отбора клинического материала для выявления миграционной формы токсокароза у человека являются трудоемкими и инвазивными. Цель настоящего исследования — разработка иммунобиологического препарата на основе экскреторно-секреторных антигенов личинок Toxocara canis для серодиагностики синдрома larva migrans у человека в реакциях иммуноферментного анализа. Антигены получали из личинок Toxocara canis путем культивирования яиц, выделенных из маток самок нематод в питательной среде с глютамином. Очистку препарата от балластных веществ проводили центрифугированием при 8000g в течение 20 минут с последующей фильтрацией через микрофильтрационную мембрану с диаметром пор 0,05–0,15 мкм типа МФАС-П-1 (ЗАО НТЦ «Владипор»). Для выявления антител к токсокарам тестировали сыворотки крови добровольцев — студентов из стран, где частота заболеваемости токсокарозом остается высокой. Для отбора серопозитивных и серонегативных сывороток использовали иммуноферментный анализ с коммерческими антигенами тест-системы «Токсокара-IgG-ИФА-БЕСТ», которую также использовали в качестве контроля. Диагностические антигенные препараты готовили с разной концентрацией белка для исследования серопозитивных сывороток и определения оптимальной дозы антигенного препарата. Результаты. В иммуноферментном анализе с использованием стандартной тест-системы из 250 исследованных проб, токсокара-IgG-антитела выявлены в 20 сыворотках (8%), что свидетельствует об антигенной стимуляции иммунной системы гельминтами и, возможно, о ранее перенесенном заболевании. В ИФА с опытными образцами антигенов количество серопозитивных проб коррелировало с концентрацией белка в антигенных препаратах: при концентрации 1,96 мкг/мл выявлено 5,2% положительных результатов, 1,71 мкг/мл — 3,2%, 0,33 мкг/мл — 0,8% (коэффициент корреляции Пирсона = 0,94). Количество серопозитивных сывороток, выявленных коммерческим антигеном стандартной тест-системы ИФА, совпало с количеством положительных сывороток при использовании опытного образца антигена с концентрацией белка 2,49 мкг/мл. Таким образом, полученные в результате эксперимента иммунодиагностические препараты на основе экскреторно-секреторных антигенов Toxocara canis характеризуются высокой чувствительностью и могут быть использованы для выявления токсокара-IgG-антител в иммуноферментном анализе. Концентрация белка в антигенном препарате не менее 2,49 мкг/мл является оптимальной и по чувствительности совпадает с коммерческим антигеном стандартной тест-системы.
Ключевые слова
Полный текст
Введение
Токсокароз — гельминтозная инвазия человека, имеющая широкий круг хозяев с эпизоотическим распространением. Серопозитивность населения в странах умеренного пояса составляет около 37%, на территориях с тропическим климатом — до 92%. Риску инвазии подвержены практически все возрастные группы населения [1].
Заражение человека происходит алиментарно при попадании инвазионных яиц токсокар от млекопитающих семейств Canidae или Felidae в продукты питания, питьевую воду, а также при несоблюдении гигиенических мер при контакте с животными, преимущественно щенками и котятами. В тонком кишечнике человека из инвазионных яиц освобождаются личинки, которые через слизистые оболочки кишечника проникают в кровоток и мигрируют в органы и ткани, вызывая миграционную форму токсокароза — синдром larva migrans. Часть личинок задерживается в легких и паренхиматозных органах, окружается реактивно-измененными тканями с формированием паразитарных гранулем. Особенности иммунного ответа при инфицировании токсокарами обусловлены характером взаимоотношений «паразит–хозяин», спецификой онтогенеза и антигенной структурой нематод. В развитии инвазионного процесса особую роль играяют гуморальные факторы защиты организма, что определяет подходы к диагностике инвазии у человека [2]. «Адаптационная толерантность» гельминтов приводит к уменьшению иммунореактивности организма и, как следствие, снижению напряженности иммунитета. Сенсибилизирующее действие метаболических антигенов определяет иммунопатогенез с развитием неспецифичной и полиморфной клинической картины.
Иммунологический метод в настоящее время сохраняет преимущественное диагностическое значение при синдроме larva migrans, так как реакция иммунной системы на антигены гельминтов сопровождается формированием сенсибилизации, а техники и способы отбора клинического материала для выявления миграционной формы токсокароза у человека трудоемкие и инвазивные.
Разработкой иммунодиагностических тестов при токсокарозе занимались российские и зарубежные ученые в ветеринарной и медицинской практике [6, 7, 8, 9]. Тем не менее используемые в ветеринарии иммунореагенты недостаточно адаптированы для диагностики миграционной формы токсокароза у человека, иммунореагенты на основе тканевых компонентов токсокар дают перекрестные реакции с антигенными детерминантами гельминтов близких в филогенетическом отношении родов. Наиболее специфичными для иммунодиагностики токсокароза у человека являются экскреторно-секреторные антигены личинок токсокар. Коммерческий набор «Токсокара-IgG-ИФА-БЕСТ» позволяет провести ретроспективный анализ инвазии токсокарами, но мало пригоден для выявления миграционной формы токсокароза [7].
В ходе разработки иммунодиагностических препаратов на основе экскреторно-секреторных антигенов токсокар нами ранее были отработаны и модифицированы условия культивирования личинок. Изучено влияние дезинфицирующих веществ на эмбриональное развитие Toxocara canis in vitro [4, 5].
Цель настоящего исследования — разработка иммунобиологического препарата на основе экскреторно-секреторных антигенов личинок Toxocara canis для серодиагностики синдрома larva migrans у человека в реакции иммуноферментного анализа.
Материалы и методы
Исследования проведены в 2019–2020 гг. на базе кафедры микробиологии ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России.
Экскреторно-секреторные антигены получали при культивировании личинок токсокар в питательной среде, содержащей 16 г 1%-ного глутамина, 500 тыс. ЕД нистатина и 2,5 мг гентамицина [6]. Яйца выделяли из маток половозрелых самок, полученных после дегельминтизации трех-четырехмесячных щенков свободного выгула. Эмбриональное развитие контролировали с использованием бинокулярного микроскопа «Микмед-5» (ЛОМО, Санкт-Петербург, Россия) при увеличении ок. 15 × об. 10. Выход личинок из яиц обеспечивали воздействием раствора панкреатина (240 ЕД/мл) в термостате ТС-1/20 СПУ. Отмывание антигенов от балластных веществ производили на центрифуге J2-HS Beckman Coulter.
Оценка стерильности полученных антигенных препаратов проведена ФБУЗ Центр гигиены и эпидемиологии в Рязанской области согласно «Государственной фармакопее РФ» в соответствии с СанПин 2.1.3.2630-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к организациям, осуществляющим медицинскую деятельность». Все предоставленные образцы антигенов стерильны и безопасны (протокол лабораторных исследований № 4414 от 14.04.2021).
Для каждой партии препарата определяли оптическую плотность на спектрофотометре СФ-2000 с последующим расчетом концентрации белка по формуле Калькара (ОФС 1.2.300.12 «Определение белка спектрофотометрическим методом»).
Верификация диагностической значимости приготовленных антигенных препаратов производилась методом параллельного тестирования 250 сывороток крови от клинически здоровых студентов-добровольцев ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием полистироловых планшетов, сенсибилизированных опытными образцами антигенов токсокар, и стандартизированной тест-системы «Токсокара-IgG-ИФА-БЕСТ» (АО «Вектор-Бест», г. Новосибирск, Россия) [3, 7].
Для аспирации исследуемых образцов и последующей промывки применяли автоматический вошер Wellwash Versa (Thermo Fisher Scientific, США). Учет результатов ИФА проводили с помощью ImmunoChem-2100 Microplate Reader [3].
Результаты и обсуждение
Отработка параметров культивирования личинок токсокар и получения антигена
Антиген получали самостоятельно при культивировании личинок Toxocara canis в глютамин-содержащей питательной среде. Для выделения яиц у самок токсокар отпрепаровывали матку. Яйца из матки освобождали путем гомогенизирования в фарфоровой ступке с добавлением 1 мл физиологического раствора. Суспензию с яйцами помещали в чашки Петри с питательной средой.
Яйца культивировали в течение 30 дней при комнатной температуре, естественном освещении, в аэробных условиях. Формирование жизнеспособных личинок наблюдали на 21 день культивирования. По истечении срока инкубации около 60% личинок самостоятельно освобождались от яйцевых оболочек. Культуральную среду с личинками четырехкратно пропускали через металлические фильтры до полного очищения от остатков волокон матки. Полученную суспензию центрифугировали при 2000 g в течение 10 минут с последующим удалением супернатанта. Осадок, содержащий личинки, двукратно отмывали физиологическим раствором при 1000g в течение 10 минут и использовали для получения экскреторно-секреторных антигенов.
Оставшаяся часть яиц для растворения яйцевых оболочек подвергалась воздействию панкреатина. Суспензию с инвазионными яйцами культивировали в аппарате Бермана в условиях термостата при температуре 37°С в течение суток для выхода жизнеспособных личинок из яйцевых оболочек и последующей миграции через слои марли на дно пробирки. Осевших на дно пробирки личинок отмывали забуференным физиологическим раствором от панкреатина путем центрифугирования при скорости 500g в течение 10 минут. Осадок с поверхности марли в аппарате Бермана исследовали микроскопическим методом на наличие яиц токсокар. При наличии яиц с живыми личинками материал повторно подвергали воздействию панкреатина.
Полученных личинок культивировали трое суток в глютамин-содержащей среде при температуре 37°С с ежедневным контролем их жизнеспособности. После гибели личинок экскреторно-секреторные антигены отделяли от балластных веществ путем центрифугирования при 8000g в течение 20 мин до полного просветления надосадка.
Супернатант в асептических условиях пропускали через бактериальные фильтры МФАС-П-1, разливали в стерильные флаконы объемом 5 мл, плотно закрывали резиновыми пробками и замораживали. В таких условиях при соблюдении полной герметичности экскреторно-секреторный антиген может сохранять свою активность длительное время.
В процессе культивирования разных партий личинок получено 13 образцов экскреторно-секреторных антигенов. Каждый образец после проверки флакона на целостность и эффективность герметизации контролировали на санитарно-микробиологическую чистоту.
Тестирование полученных иммунодиагностических препаратов
Для оценки диагностической ценности полученных антигенных препаратов в каждом образце определяли оптическую плотность и концентрацию белка. Показатели концентрации белка в зависимости от экстинкции исследуемого образца представлены в табл. 1. Максимальной концентрацией белка (2,49 мкг/мл) отличались образцы № 3–6, 8–13.
Таблица 1. Зависимость концентрации белка в опытных образцах от величины оптической плотности
Table 1. A relation between protein concentration in the test samples and optical density
Длина волны, нм Wavelength, nm | 260 | 280 | 480 | 580 | 680 | 780 | Концентрация белка, мкг/мл Protein concentration, μg/ml |
№ образца Sample number | Величина оптической плотности Magnitude of optical density | ||||||
1 | 3,0852 | 2,7777 | 2,9205 | 3,0549 | 2,5386 | 1,6221 | 1,960683 |
2 | 3,0075 | 2,5799 | 2,9545 | 3,1549 | 2,9247 | 1,9445 | 1,713145 |
3 | 3,1549 | 3,1549 | 3,1549 | 3,1549 | 2,0202 | 1,2351 | 2,492371 |
4 | 3,1549 | 3,1549 | 3,1549 | 1,9695 | 1,0935 | 0,6620 | 2,492371 |
5 | 3,1549 | 3,1549 | 3,1549 | 2,5982 | 1,518 | 1,6241 | 2,492371 |
6 | 3,1549 | 3,1549 | 3,1549 | 2,5796 | 1,6853 | 1,2472 | 2,492371 |
7 | 3,1549 | 1,7647 | 0,5606 | 0,2220 | 0,1126 | 0,0883 | 0,337561 |
8 | 3,1549 | 3,1549 | 1,4937 | 0,9530 | 0,6762 | 0,4937 | 2,492371 |
9 | 3,1549 | 3,1549 | 2,8857 | 1,9136 | 1,4494 | 1,1684 | 2,492371 |
10 | 3,1549 | 3,1549 | 2,3133 | 1,5725 | 1,2850 | 1,0904 | 2,492371 |
11 | 3,1549 | 3,1549 | 2,3133 | 1,5725 | 1,2850 | 1,0904 | 2,492371 |
12 | 3,1549 | 3,1549 | 2,3987 | 2,1996 | 1,8691 | 1,4774 | 2,492371 |
13 | 3,1549 | 3,1549 | 3,1549 | 3,1526 | 2,9550 | 2,8658 | 2,492371 |
Все полученные образцы антигена использовали для сенсибилизации иммунологических планшетов и дальнейшей постановки ИФА. Антигены иммобилизировали в лунках полистиролового планшета путем «пассивной сорбции» в течение 60 минут при температуре 37°С. Отрицательным и положительным контролем служили стандартные тест-сыворотки из набора «Токсокара-IgG-ИФА-БЕСТ».
Сыворотки крови от клинически здоровых студентов-добровольцев из тропических стран, где частота заболеваемости токсокарозом по литературным данным стабильно высокая, тестировали на наличие антител к токсокарам параллельно в стандартной тест-системе АО «Вектор-Бест» и с использованием экспериментальных партий антигенов.
Результаты иммуноферментного анализа с использованием стандартной тест-системы показали 20 серопозитивных проб из 250 — 8%. При постановке ИФА с опытными образцами антигенов количество серопозитивных проб коррелировало с концентрацией белка в антигенных препаратах. Результаты представлены в табл. 2.
Таблица 2. Количество серопозитивных сывороток крови при использовании опытных образцов антигена с различной концентрацией белка
Table 2. The number of seropositive blood serum samples after using test antigen samples at varying protein concentrations
№ образца Sample number | Концентрация белка, мкг/мл Protein concentration, μg/ml | Количество серопозитивных результатов Number of seropositive results | Количество серонегативных результатов Number of seronegative results |
1 | 1,960683 | 13 | 237 |
2 | 1,713145 | 8 | 242 |
3 | 2,492371 | 20 | 230 |
4 | 2,492371 | 20 | 230 |
5 | 2,492371 | 20 | 230 |
6 | 2,492371 | 20 | 230 |
7 | 0,337561 | 2 | 248 |
8 | 2,492371 | 20 | 230 |
9 | 2,492371 | 20 | 230 |
10 | 2,492371 | 20 | 230 |
11 | 2,492371 | 20 | 230 |
12 | 2,492371 | 20 | 230 |
13 | 2,492371 | 20 | 230 |
При низких концентрациях белка выявлено меньшее количество серопозитивных проб по сравнению со стандартной тест-системой: 1,96 мкг/мл — 5,2%, 1,71 мкг/мл — 3,2%, 0,33 мкг/мл — 0,8% (коэффициент корреляции Пирсона — 0,94). При сенсибилизации иммунологических планшетов образцами антигена с концентрацией белка 2,49 мкг/мл количество положительных результатов совпало с показателями ИФА в стандартной тест-системе.
Основными характеристиками диагностического препарата являются степень его чувствительности, специфичности и воспроизводимости результатов. Указанные свойства можно оценить по способности препарата выявлять как положительные, так и отрицательные результаты при серологическом исследовании крови пациентов. Для исключения перекрестных реакций между нематодами разных родов целесообразно использование экскреторно-секреторных компонентов с высокой молекулярной массой, что подтверждается другими исследователями [6, 7, 8].
Уровень специфичности тест-системы определяется опытным путем при рандомном исследовании сывороток крови пациентов с наибольшей степенью вероятности заболевания.
Все обследованные в ходе эксперимента люди принадлежат к группе высокого риска, так как согласно эпидемиологическим данным в странах тропического пояса уровень инвазирования населения токсокарами достаточно высок [1]. Наиболее часто миграционная форма токсокароза встречается в детском возрасте. Выявление токсокара-IgG-антител в 20 сыворотках (8%) свидетельствует об антигенной стимуляции иммунной системы гельминтами и ранее перенесенном заболевании.
Достоверность результатов при иммунодиагностике токсокароза у человека обеспечивается специфичностью и чистотой антигенных фракций диагностического препарата. В ряде экспериментов в серологических реакциях применяли соматические антигены токсокар от взрослых особей [8, 9]. Однако они обладают низкой специфичностью и показывают ложноположительные результаты при паразитировании других нематод.
Высокой диагностической значимостью при миграционной форме токсокароза характеризуются серологические тесты с использованием экскреторно-секреторных антигенов личиночных стадий. Причем концентрация белка в диагностическом препарате играет ведущую роль в выборе образца, пригодного для постановки иммунодиагностических реакций.
Антитела к экскреторно-секреторным антигенам и циркулирующие иммунные комплексы после завершения инвазионного процесса могут длительное время сохраняться в организме человека. Подтверждение диагноза «токсокароз» возможно при достижении диагностического титра и наличии патогномоничной симптоматики. Положительные результаты ИФА (наличие иммуноглобулинов класса G) при отсутствии явной клинической симптоматики могут свидетельствовать о перенесенном в анамнезе токсокарозе или недавней элиминации гельминтов из организма.
Как подтверждающая методика при диагностике токсокароза у человека используется иммуноблоттинг в тест-системе TOXOCARA Western Blot IgG. В качестве мишеней в этом тесте выступают белки со сложной структурой, что позволяет точно дифференцировать наличие антительного ответа на специфические и неспецифические детерминанты нематод [7]. Однако надо учитывать, что вестерн-блот достаточно трудоемкий и дорогостоящий метод диагностики гельминтозных инвазий.
Для диагностики токсокароза у человека наиболее удобным в использовании, унифицированным и быстрым скрининговым методом является ИФА. Эта реакция сочетает сохранение стабильности всех компонентов системы в течение рекомендуемого срока использования, высокую чувствительность и легкость в интерпретации результатов.
Заключение
Таким образом, полученные в результате эксперимента иммунодиагностические препараты на основе экскреторно-секреторных антигенов личинок Toxocara canis характеризуются высокой чувствительностью и могут быть использованы для выявления токсокара-IgG антител в иммуноферментном анализе у человека. Концентрация белка в антигенном препарате не менее 2,49 мкг/мл является оптимальной и по чувствительности совпадает с коммерческим антигеном стандартной тест-системы.
Об авторах
Ирина Владимировна Канина
ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. академика И.П. Павлова
Email: Kanina.irina1987@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-8419-1697
аспирант кафедры микробиологии
Россия, 390026, Рязань, Высоковольтная ул., 9А. И. Новак
ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. академика И.П. Павлова
Email: marieta69@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0345-7316
д.б.н., доцент, профессор кафедры микробиологии
Россия, 390026, Рязань, Высоковольтная ул., 9М. Д. Новак
ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. академика И.П. Павлова
Email: marieta69@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1421-0039
д.б.н., профессор, профессор кафедры эпидемиологии
Россия, 390026, Рязань, Высоковольтная ул., 9О. В. Евдокимова
ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. академика И.П. Павлова
Автор, ответственный за переписку.
Email: olartemyeva@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5035-7302
к.м.н., доцент, зав. кафедрой микробиологии
Россия, 390026, Рязань, Высоковольтная ул., 9Список литературы
- Адаменко Г.П., Никулин Ю.Т. Токсокароз — актуальная проблема здравоохранения // Медицинские новости. 2004. № 2. С. 31–36. [Adamenko G.P., Nikulin Yu.T. Toxocariasis is an urgent problem of public health. Meditsinskie novosti = Medical News, 2004, no. 2, pp. 31–36. (In Russ.)]
- Даугалиева Э.Х. Иммунитет при гельминтозах // Труды ВИГИС. 2000. Т. 36. С. 27–49. [Daugalieva E.Kh. Immunity in helminthiasis. Trudy VIGIS = Works of All-Russian Scientific Research Institute for Fundamental and Applied Parasitology of Animals and Plant, 2000, vol. 36, рр. 27–49. (In Russ.)]
- Иванская Н.В., Кислых Е.Н., Максименок Е.В., Раевская Г.Е., Пилипенко В.Г. Практическое пособие по иммуноферментному анализу. Киев: Диапроф-Мед, 2003. С. 54–68. [Ivanskaya N.V., Kislykh E.N., Maksimenok E.V., Raevskaya G.E., Pilipenko V.G. A practical guide to enzyme immunoassay. Kiev: Diaprof-Med, 2003. Pр. 54–68. (In Russ.)]
- Канина И.В., Новак А.И., Евдокимова О.В. Овицидная активность дезинфицирующих средтсв в отношении яиц Toxocara canis // Проблемы медицинской микологии. 2021. Т. 23, № 2. С. 86–87. [Kanina I.V., Novak A.I., Evdokimova O.V. Ovicidal activity of disinfectants against Toxocara canis eggs. Problemy meditsinskoy mikologii = Problems of Medical Mycology, 2021, vol. 23, no. 2, рр. 86–87. (In Russ.)]
- Канина И.В., Новак А.И., Новак М.Д., Евдокимова О.В. Подбор оптимальных доз антимикробных препаратов при культивировании личинок Toxocara canis // Проблемы медицинской микологии. 2020. Т. 22, № 3. C. 85–86. [Kanina I.V., Novak A.I., Novak M.D., Evdokimova O.V. Selection of optimal doses of antimicrobial drugs in the cultivation of Toxocara canis larvae. Problemy meditsinskoy mikologii = Problems of Medical Mycology, 2020, vol. 22, no. 3, рр. 85–86. (In Russ.)]
- Новак М.Д., Солопов П.А. Иммуноферментный анализ и реакция непрямой гемагглютинации для диагностики имагинального и ларвального токсокароза собак // Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями. 2009. № 10. С. 286–287. [Novak M.D., Solopov P.A. Immunoassay and indirect hemagglutination reaction for the diagnosis of imaginal and larval toxocariasis in dogs. Teoriya i praktika borby s parazitarnymi bolezniami = Theory and Practice of Combating Parasitic Diseases, 2009, no. 10, pp. 286–287. (In Russ.)]
- Новиков П.Д., Никулин Ю.Т., Хотетовская Ж.В., Новиков Д.К. Иммунодиагностика токсокароза // Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2007. № 2. С. 65–72. [Novikov P.D., Nikulin Yu.T., Hotetovskaya Zh.V., Novikov D.K. Immunodiagnosis of toxocariasis. Immunopatologiya, allergologiya, infektologiya = Immunopathology, Allergology, Infectology, 2007, no. 2, рр. 65–72. (In Russ.)]
- Annen J.M., Eckert J., Hess U. Simple method for obtaining Toxocara canis antigen for the indirect immunofluorescence technic [In German]. Acta Trop., 1975, vol. 1, no. 3, pp. 37–47.
- Zarnowska-Prymek H. Enhancement of laboratory diagnosis specificity in human toxocariasis [In Polish]. Wiad. Parazytol, 2001, vol. 47, no. 3, рр. 489–496.
Дополнительные файлы
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).