Obtaining immunodiagnostic preparations from Toxocara canis antigens for serodiagnostics of toxocariasis in human

Cover Page


Cite item

Full Text

Abstract

Toxocariasis is a human helminthic invasion that has a wide range of hosts with epizootic distribution. The populational seropositivity in countries with a temperate climate comprises about 37%, whereas in regions with tropical climate — up to 92%. Almost all age groups of the population are at risk of invasion by toxocars. The immunological method currently retains diagnostic significance for toxocariasis, because the reaction of immune system against helminths is accompanied by developing sensitization, and techniques as well as methods of collecting clinical material to identify the migratory form of toxocarosis in humans are time-consuming and invasive. The purpose of this study is to develop an immunobiological preparation based on excretory-secretory antigens from Toxocara canis larvae for serodiagnostics of larva migrans syndrome in human by using enzyme-linked immunoassay (ELISA). Antigens were obtained from Toxocara canis larvae by culturing its eggs isolated from the uterus of female nematodes in the glutamine-supplemented medium. The preparation was purified from ballast substances by centrifugation at 8000 g for 20 minutes followed by filtration through microfiltration membrane with a pore diameter of 0,05–0,15 microns, type MFAS-P-1 (manufactured by CJSC STC Vladipor). Blood serum of student volunteers from countries with high incidence rate of toxocariasis were tested to detect T. canis-specific antibodies. ELISA with commercial antigens Toxocara-IgG-ELISA-BEST kit was used for selection of seropositive and seronegative sera also used as a control. Diagnostic antigenic preparations with different protein concentrations were prepared to examine seropositive sera for determining optimal dose of the antigenic drugs. Results. ELISA with standard test kit allowed to detect Toxocara-IgG antibodies in 20 sera (8%) from 250 samples, what indicates about antigenic stimulation of the immune system by helminths and suspected former disease. Analyzing experimental samples allowed to find the number of seropositive data correlated with antigenic protein concentration in preparations: at a concentration of 1,96 μg/ml 5,2% of positive results were detected, 1,71 μg/ml — 3.2%, 0.33 μg/ml — 0.8% (Pearson’s correlation coefficient 0,94). The number of positive sera detected with commercial antigen in ELISA kit was identical to that of positive sera detected by an experimental antigen sample with a protein concentration of 2,49 μg/ml. Thus, the immunodiagnostic preparations obtained by the experimental method based on the excretory-secretory antigens from Toxocara canis are characterized by high sensitivity and can be used to detect Toxocara-IgG antibodies in ELISA. The antigen preparation protein concentration of at least 2.49 μg/ml is optimal and correlates whit sensitivity of the commercial antigen of the standard ELISA.

Full Text

Введение

Токсокароз — гельминтозная инвазия человека, имеющая широкий круг хозяев с эпизоотическим распространением. Серопозитивность населения в странах умеренного пояса составляет около 37%, на территориях с тропическим климатом — до 92%. Риску инвазии подвержены практически все возрастные группы населения [1].

Заражение человека происходит алиментарно при попадании инвазионных яиц токсокар от млекопитающих семейств Canidae или Felidae в продукты питания, питьевую воду, а также при несоблюдении гигиенических мер при контакте с животными, преимущественно щенками и котятами. В тонком кишечнике человека из инвазионных яиц освобождаются личинки, которые через слизистые оболочки кишечника проникают в кровоток и мигрируют в органы и ткани, вызывая миграционную форму токсокароза — синдром larva migrans. Часть личинок задерживается в легких и паренхиматозных органах, окружается реактивно-измененными тканями с формированием паразитарных гранулем. Особенности иммунного ответа при инфицировании токсокарами обусловлены характером взаимоотношений «паразит–хозяин», спецификой онтогенеза и антигенной структурой нематод. В развитии инвазионного процесса особую роль играяют гуморальные факторы защиты организма, что определяет подходы к диагностике инвазии у человека [2]. «Адаптационная толерантность» гельминтов приводит к уменьшению иммунореактивности организма и, как следствие, снижению напряженности иммунитета. Сенсибилизирующее действие метаболических антигенов определяет иммунопатогенез с развитием неспецифичной и полиморфной клинической картины.

Иммунологический метод в настоящее время сохраняет преимущественное диагностическое значение при синдроме larva migrans, так как реакция иммунной системы на антигены гельминтов сопровождается формированием сенсибилизации, а техники и способы отбора клинического материала для выявления миграционной формы токсокароза у человека трудоемкие и инвазивные.

Разработкой иммунодиагностических тестов при токсокарозе занимались российские и зарубежные ученые в ветеринарной и медицинской практике [6, 7, 8, 9]. Тем не менее используемые в ветеринарии иммунореагенты недостаточно адаптированы для диагностики миграционной формы токсокароза у человека, иммунореагенты на основе тканевых компонентов токсокар дают перекрестные реакции с антигенными детерминантами гельминтов близких в филогенетическом отношении родов. Наиболее специфичными для иммунодиагностики токсокароза у человека являются экскреторно-секреторные антигены личинок токсокар. Коммерческий набор «Токсокара-IgG-ИФА-БЕСТ» позволяет провести ретроспективный анализ инвазии токсокарами, но мало пригоден для выявления миграционной формы токсокароза [7].

В ходе разработки иммунодиагностических препаратов на основе экскреторно-секреторных антигенов токсокар нами ранее были отработаны и модифицированы условия культивирования личинок. Изучено влияние дезинфицирующих веществ на эмбриональное развитие Toxocara canis in vitro [4, 5].

Цель настоящего исследования — разработка иммунобиологического препарата на основе экскреторно-секреторных антигенов личинок Toxocara canis для серодиагностики синдрома larva migrans у человека в реакции иммуноферментного анализа.

Материалы и методы

Исследования проведены в 2019–2020 гг. на базе кафедры микробиологии ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России.

Экскреторно-секреторные антигены получали при культивировании личинок токсокар в питательной среде, содержащей 16 г 1%-ного глутамина, 500 тыс. ЕД нистатина и 2,5 мг гентамицина [6]. Яйца выделяли из маток половозрелых самок, полученных после дегельминтизации трех-четырехмесячных щенков свободного выгула. Эмбриональное развитие контролировали с использованием бинокулярного микроскопа «Микмед-5» (ЛОМО, Санкт-Петербург, Россия) при увеличении ок. 15 × об. 10. Выход личинок из яиц обеспечивали воздействием раствора панкреатина (240 ЕД/мл) в термостате ТС-1/20 СПУ. Отмывание антигенов от балластных веществ производили на центрифуге J2-HS Beckman Coulter.

Оценка стерильности полученных антигенных препаратов проведена ФБУЗ Центр гигиены и эпидемиологии в Рязанской области согласно «Государственной фармакопее РФ» в соответствии с СанПин 2.1.3.2630-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к организациям, осуществляющим медицинскую деятельность». Все предоставленные образцы антигенов стерильны и безопасны (протокол лабораторных исследований № 4414 от 14.04.2021).

Для каждой партии препарата определяли оптическую плотность на спектрофотометре СФ-2000 с последующим расчетом концентрации белка по формуле Калькара (ОФС 1.2.300.12 «Определение белка спектрофотометрическим методом»).

Верификация диагностической значимости приготовленных антигенных препаратов производилась методом параллельного тестирования 250 сывороток крови от клинически здоровых студентов-добровольцев ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием полистироловых планшетов, сенсибилизированных опытными образцами антигенов токсокар, и стандартизированной тест-системы «Токсокара-IgG-ИФА-БЕСТ» (АО «Вектор-Бест», г. Новосибирск, Россия) [3, 7].

Для аспирации исследуемых образцов и последующей промывки применяли автоматический вошер Wellwash Versa (Thermo Fisher Scientific, США). Учет результатов ИФА проводили с помощью ImmunoChem-2100 Microplate Reader [3].

Результаты и обсуждение

Отработка параметров культивирования личинок токсокар и получения антигена

Антиген получали самостоятельно при культивировании личинок Toxocara canis в глютамин-содержащей питательной среде. Для выделения яиц у самок токсокар отпрепаровывали матку. Яйца из матки освобождали путем гомогенизирования в фарфоровой ступке с добавлением 1 мл физиологического раствора. Суспензию с яйцами помещали в чашки Петри с питательной средой.

Яйца культивировали в течение 30 дней при комнатной температуре, естественном освещении, в аэробных условиях. Формирование жизнеспособных личинок наблюдали на 21 день культивирования. По истечении срока инкубации около 60% личинок самостоятельно освобождались от яйцевых оболочек. Культуральную среду с личинками четырехкратно пропускали через металлические фильтры до полного очищения от остатков волокон матки. Полученную суспензию центрифугировали при 2000 g в течение 10 минут с последующим удалением супернатанта. Осадок, содержащий личинки, двукратно отмывали физиологическим раствором при 1000g в течение 10 минут и использовали для получения экскреторно-секреторных антигенов.

Оставшаяся часть яиц для растворения яйцевых оболочек подвергалась воздействию панкреатина. Суспензию с инвазионными яйцами культивировали в аппарате Бермана в условиях термостата при температуре 37°С в течение суток для выхода жизнеспособных личинок из яйцевых оболочек и последующей миграции через слои марли на дно пробирки. Осевших на дно пробирки личинок отмывали забуференным физиологическим раствором от панкреатина путем центрифугирования при скорости 500g в течение 10 минут. Осадок с поверхности марли в аппарате Бермана исследовали микроскопическим методом на наличие яиц токсокар. При наличии яиц с живыми личинками материал повторно подвергали воздействию панкреатина.

Полученных личинок культивировали трое суток в глютамин-содержащей среде при температуре 37°С с ежедневным контролем их жизнеспособности. После гибели личинок экскреторно-секреторные антигены отделяли от балластных веществ путем центрифугирования при 8000g в течение 20 мин до полного просветления надосадка.

Супернатант в асептических условиях пропускали через бактериальные фильтры МФАС-П-1, разливали в стерильные флаконы объемом 5 мл, плотно закрывали резиновыми пробками и замораживали. В таких условиях при соблюдении полной герметичности экскреторно-секреторный антиген может сохранять свою активность длительное время.

В процессе культивирования разных партий личинок получено 13 образцов экскреторно-секреторных антигенов. Каждый образец после проверки флакона на целостность и эффективность герметизации контролировали на санитарно-микробиологическую чистоту.

Тестирование полученных иммунодиагностических препаратов

Для оценки диагностической ценности полученных антигенных препаратов в каждом образце определяли оптическую плотность и концентрацию белка. Показатели концентрации белка в зависимости от экстинкции исследуемого образца представлены в табл. 1. Максимальной концентрацией белка (2,49 мкг/мл) отличались образцы № 3–6, 8–13.

 

Таблица 1. Зависимость концентрации белка в опытных образцах от величины оптической плотности

Table 1. A relation between protein concentration in the test samples and optical density

Длина волны, нм

Wavelength, nm

260

280

480

580

680

780

Концентрация белка, мкг/мл

Protein concentration, μg/ml

№ образца

Sample number

Величина оптической плотности

Magnitude of optical density

1

3,0852

2,7777

2,9205

3,0549

2,5386

1,6221

1,960683

2

3,0075

2,5799

2,9545

3,1549

2,9247

1,9445

1,713145

3

3,1549

3,1549

3,1549

3,1549

2,0202

1,2351

2,492371

4

3,1549

3,1549

3,1549

1,9695

1,0935

0,6620

2,492371

5

3,1549

3,1549

3,1549

2,5982

1,518

1,6241

2,492371

6

3,1549

3,1549

3,1549

2,5796

1,6853

1,2472

2,492371

7

3,1549

1,7647

0,5606

0,2220

0,1126

0,0883

0,337561

8

3,1549

3,1549

1,4937

0,9530

0,6762

0,4937

2,492371

9

3,1549

3,1549

2,8857

1,9136

1,4494

1,1684

2,492371

10

3,1549

3,1549

2,3133

1,5725

1,2850

1,0904

2,492371

11

3,1549

3,1549

2,3133

1,5725

1,2850

1,0904

2,492371

12

3,1549

3,1549

2,3987

2,1996

1,8691

1,4774

2,492371

13

3,1549

3,1549

3,1549

3,1526

2,9550

2,8658

2,492371

 

Все полученные образцы антигена использовали для сенсибилизации иммунологических планшетов и дальнейшей постановки ИФА. Антигены иммобилизировали в лунках полистиролового планшета путем «пассивной сорбции» в течение 60 минут при температуре 37°С. Отрицательным и положительным контролем служили стандартные тест-сыворотки из набора «Токсокара-IgG-ИФА-БЕСТ».

Сыворотки крови от клинически здоровых студентов-добровольцев из тропических стран, где частота заболеваемости токсокарозом по литературным данным стабильно высокая, тестировали на наличие антител к токсокарам параллельно в стандартной тест-системе АО «Вектор-Бест» и с использованием экспериментальных партий антигенов.

Результаты иммуноферментного анализа с использованием стандартной тест-системы показали 20 серопозитивных проб из 250 — 8%. При постановке ИФА с опытными образцами антигенов количество серопозитивных проб коррелировало с концентрацией белка в антигенных препаратах. Результаты представлены в табл. 2.

 

Таблица 2. Количество серопозитивных сывороток крови при использовании опытных образцов антигена с различной концентрацией белка

Table 2. The number of seropositive blood serum samples after using test antigen samples at varying protein concentrations

№ образца

Sample number

Концентрация белка, мкг/мл

Protein concentration, μg/ml

Количество серопозитивных результатов

Number of seropositive results

Количество серонегативных результатов

Number of seronegative results

1

1,960683

13

237

2

1,713145

8

242

3

2,492371

20

230

4

2,492371

20

230

5

2,492371

20

230

6

2,492371

20

230

7

0,337561

2

248

8

2,492371

20

230

9

2,492371

20

230

10

2,492371

20

230

11

2,492371

20

230

12

2,492371

20

230

13

2,492371

20

230

 

При низких концентрациях белка выявлено меньшее количество серопозитивных проб по сравнению со стандартной тест-системой: 1,96 мкг/мл — 5,2%, 1,71 мкг/мл — 3,2%, 0,33 мкг/мл — 0,8% (коэффициент корреляции Пирсона — 0,94). При сенсибилизации иммунологических планшетов образцами антигена с концентрацией белка 2,49 мкг/мл количество положительных результатов совпало с показателями ИФА в стандартной тест-системе.

Основными характеристиками диагностического препарата являются степень его чувствительности, специфичности и воспроизводимости результатов. Указанные свойства можно оценить по способности препарата выявлять как положительные, так и отрицательные результаты при серологическом исследовании крови пациентов. Для исключения перекрестных реакций между нематодами разных родов целесообразно использование экскреторно-секреторных компонентов с высокой молекулярной массой, что подтверждается другими исследователями [6, 7, 8].

Уровень специфичности тест-системы определяется опытным путем при рандомном исследовании сывороток крови пациентов с наибольшей степенью вероятности заболевания.

Все обследованные в ходе эксперимента люди принадлежат к группе высокого риска, так как согласно эпидемиологическим данным в странах тропического пояса уровень инвазирования населения токсокарами достаточно высок [1]. Наиболее часто миграционная форма токсокароза встречается в детском возрасте. Выявление токсокара-IgG-антител в 20 сыворотках (8%) свидетельствует об антигенной стимуляции иммунной системы гельминтами и ранее перенесенном заболевании.

Достоверность результатов при иммунодиагностике токсокароза у человека обеспечивается специфичностью и чистотой антигенных фракций диагностического препарата. В ряде экспериментов в серологических реакциях применяли соматические антигены токсокар от взрослых особей [8, 9]. Однако они обладают низкой специфичностью и показывают ложноположительные результаты при паразитировании других нематод.

Высокой диагностической значимостью при миграционной форме токсокароза характеризуются серологические тесты с использованием экскреторно-секреторных антигенов личиночных стадий. Причем концентрация белка в диагностическом препарате играет ведущую роль в выборе образца, пригодного для постановки иммунодиагностических реакций.

Антитела к экскреторно-секреторным антигенам и циркулирующие иммунные комплексы после завершения инвазионного процесса могут длительное время сохраняться в организме человека. Подтверждение диагноза «токсокароз» возможно при достижении диагностического титра и наличии патогномоничной симптоматики. Положительные результаты ИФА (наличие иммуноглобулинов класса G) при отсутствии явной клинической симптоматики могут свидетельствовать о перенесенном в анамнезе токсокарозе или недавней элиминации гельминтов из организма.

Как подтверждающая методика при диагностике токсокароза у человека используется иммуноблоттинг в тест-системе TOXOCARA Western Blot IgG. В качестве мишеней в этом тесте выступают белки со сложной структурой, что позволяет точно дифференцировать наличие антительного ответа на специфические и неспецифические детерминанты нематод [7]. Однако надо учитывать, что вестерн-блот достаточно трудоемкий и дорогостоящий метод диагностики гельминтозных инвазий.

Для диагностики токсокароза у человека наиболее удобным в использовании, унифицированным и быстрым скрининговым методом является ИФА. Эта реакция сочетает сохранение стабильности всех компонентов системы в течение рекомендуемого срока использования, высокую чувствительность и легкость в интерпретации результатов.

Заключение

Таким образом, полученные в результате эксперимента иммунодиагностические препараты на основе экскреторно-секреторных антигенов личинок Toxocara canis характеризуются высокой чувствительностью и могут быть использованы для выявления токсокара-IgG антител в иммуноферментном анализе у человека. Концентрация белка в антигенном препарате не менее 2,49 мкг/мл является оптимальной и по чувствительности совпадает с коммерческим антигеном стандартной тест-системы.

×

About the authors

Irina V. Kanina

Ryazan State Medical University named after academician I.P. Pavlov

Email: Kanina.irina1987@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-8419-1697

PhD Student, Department of Microbiology

Россия, 390026, Ryazan, Vysokovoltnaya str., 9

A. I. Novak

Ryazan State Medical University named after academician I.P. Pavlov

Email: marieta69@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0345-7316

PhD, MD (Biology), Associate Professor, Professor of the Department of Microbiology

Россия, 390026, Ryazan, Vysokovoltnaya str., 9

M. D. Novak

Ryazan State Medical University named after academician I.P. Pavlov

Email: marieta69@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1421-0039

PhD, MD (Biology), Professor, Professor of the Department of Epidemiology

Россия, 390026, Ryazan, Vysokovoltnaya str., 9

O. V. Evdokimova

Ryazan State Medical University named after academician I.P. Pavlov

Author for correspondence.
Email: olartemyeva@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5035-7302

PhD, MD (Medicine), Associate Professor, Head of the Department of Microbiology

Россия, 390026, Ryazan, Vysokovoltnaya str., 9

References

  1. Адаменко Г.П., Никулин Ю.Т. Токсокароз — актуальная проблема здравоохранения // Медицинские новости. 2004. № 2. С. 31–36. [Adamenko G.P., Nikulin Yu.T. Toxocariasis is an urgent problem of public health. Meditsinskie novosti = Medical News, 2004, no. 2, pp. 31–36. (In Russ.)]
  2. Даугалиева Э.Х. Иммунитет при гельминтозах // Труды ВИГИС. 2000. Т. 36. С. 27–49. [Daugalieva E.Kh. Immunity in helminthiasis. Trudy VIGIS = Works of All-Russian Scientific Research Institute for Fundamental and Applied Parasitology of Animals and Plant, 2000, vol. 36, рр. 27–49. (In Russ.)]
  3. Иванская Н.В., Кислых Е.Н., Максименок Е.В., Раевская Г.Е., Пилипенко В.Г. Практическое пособие по иммуноферментному анализу. Киев: Диапроф-Мед, 2003. С. 54–68. [Ivanskaya N.V., Kislykh E.N., Maksimenok E.V., Raevskaya G.E., Pilipenko V.G. A practical guide to enzyme immunoassay. Kiev: Diaprof-Med, 2003. Pр. 54–68. (In Russ.)]
  4. Канина И.В., Новак А.И., Евдокимова О.В. Овицидная активность дезинфицирующих средтсв в отношении яиц Toxocara canis // Проблемы медицинской микологии. 2021. Т. 23, № 2. С. 86–87. [Kanina I.V., Novak A.I., Evdokimova O.V. Ovicidal activity of disinfectants against Toxocara canis eggs. Problemy meditsinskoy mikologii = Problems of Medical Mycology, 2021, vol. 23, no. 2, рр. 86–87. (In Russ.)]
  5. Канина И.В., Новак А.И., Новак М.Д., Евдокимова О.В. Подбор оптимальных доз антимикробных препаратов при культивировании личинок Toxocara canis // Проблемы медицинской микологии. 2020. Т. 22, № 3. C. 85–86. [Kanina I.V., Novak A.I., Novak M.D., Evdokimova O.V. Selection of optimal doses of antimicrobial drugs in the cultivation of Toxocara canis larvae. Problemy meditsinskoy mikologii = Problems of Medical Mycology, 2020, vol. 22, no. 3, рр. 85–86. (In Russ.)]
  6. Новак М.Д., Солопов П.А. Иммуноферментный анализ и реакция непрямой гемагглютинации для диагностики имагинального и ларвального токсокароза собак // Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями. 2009. № 10. С. 286–287. [Novak M.D., Solopov P.A. Immunoassay and indirect hemagglutination reaction for the diagnosis of imaginal and larval toxocariasis in dogs. Teoriya i praktika borby s parazitarnymi bolezniami = Theory and Practice of Combating Parasitic Diseases, 2009, no. 10, pp. 286–287. (In Russ.)]
  7. Новиков П.Д., Никулин Ю.Т., Хотетовская Ж.В., Новиков Д.К. Иммунодиагностика токсокароза // Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2007. № 2. С. 65–72. [Novikov P.D., Nikulin Yu.T., Hotetovskaya Zh.V., Novikov D.K. Immunodiagnosis of toxocariasis. Immunopatologiya, allergologiya, infektologiya = Immunopathology, Allergology, Infectology, 2007, no. 2, рр. 65–72. (In Russ.)]
  8. Annen J.M., Eckert J., Hess U. Simple method for obtaining Toxocara canis antigen for the indirect immunofluorescence technic [In German]. Acta Trop., 1975, vol. 1, no. 3, pp. 37–47.
  9. Zarnowska-Prymek H. Enhancement of laboratory diagnosis specificity in human toxocariasis [In Polish]. Wiad. Parazytol, 2001, vol. 47, no. 3, рр. 489–496.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) 2022 Kanina I.V., Novak A.I., Novak M.D., Evdokimova O.V.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 64788 от 02.02.2016.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies