Усиление генерации гидроксильных радикалов лейкоцитами человека в присутствии бактериальных диаминов как проявление иммуномодулирующего влияния микробных метаболитов

Полный текст

В современной микробиологии наблюдается смена лидирующих тенденций: возбудители острых инфекционных заболеваний отходят на второй план, в то время как этиология и патогенез состояний со стертой клиникой, а тем более бессимптомная инфекция или носительство, оставаясь по сей день относительно малоизученными, привлекают все большее внимание исследователей. Отчасти такие метаморфозы связаны с наращиванием условно патогенной микрофлорой персистентного потенциала. Еще в середине прошлого века сначала Hobby G.L. (1942), а позднее Bigger J.W. обратили внимание на отсутствие полной стерилизации пенициллином культур Staphylococcus аureus [7]. Именно Bigger J.W. впервые применил к выжившей субпопуляции бактерий название клетки-персисторы («неделящиеся, бездействующие клетки») [7]. Однако лишь через несколько десятков лет была осознана значимость проблемы персистенции микроорганизмов [11, 16].

Персистентный потенциал обеспечивается различными приспособительными механизмами, выработанными бактериями в процессе эволюции, и универсален как для патогенов, так и для представителей индигенной микрофлоры [1]. Памятуя о том, что противомикробную защиту в организме человека, наряду с гуморальными факторами, осуществляют иммунокомпетентные клетки [10], логично предположить наличие у персистирующих бактерий метаболитов, оказывающих определенное влияние непосредственно на функциональную активность клеточных эффекторов иммунитета.

В последнее время возрастает интерес к исследованию роли полиаминов (ПА) в межклеточных взаимоотношениях, особенно в очаге воспаления, где наблюдается накопление этих поликатионов [14, 19]. Привлекают внимание в этом плане ПА микробного происхождения — кадаверин и путресцин [23]. Показано, что такие факторы, как дефицит питательных веществ, действие антимикробных и других реактантов, которые в очаге воспаления представлены в большом количестве, увеличивает скорость синтеза кадаверина и путресцина Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio cholerae [5, 6, 21]. Описана роль ПА как «скавенджеров» свободных радикалов [13], но до сих пор нет данных об их влиянии на радикал-продуцирующую активность лейкоцитов. Известно, что генерация активных форм кислорода (пероксид водорода, супероксидный анион-радикал, синглетный кислород, гидроксильный радикал, гипохлорид) является ключевым звеном деструкции фагоцитированных объектов [18]. Нарушение этого компонента фагоцитоза приводит к его незавершенности, когда микроорганизмы успешно персистируют в цитоплазме фагоцитов [12, 24].

Цель исследования — изучение особенностей генерации гидроксильных радикалов лейкоцитами человека под влиянием полиаминов микробного происхождения.

Материалы и методы

Пробы периферической венозной крови были получены от 20 практически здоровых доноров. Для оценки продукции гидроксильных радикалов проводили реакцию люминолзависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ) с лейкоцитами крови [22], выделенными методом седиментации с 0,1% метилцеллюлозой (Sigma-Aldrich, США), с последующей прединкубацией с кадаверином (0,01 М) и путресцином (0,01 М) в течение 60 мин при 37°С. При постановке реакции ЛЗХЛ использовали 2 × 10^–4 M натриевой соли люминола (Sigma, США), предобработанные ПА клетки (25 × 10⁶/мл) и неопсонизированный зимозан (конечные концентрации 15, 150 и 1500 мкг/мл). Измерение проводили на люминометре Luminoskan Ascent^® (Thermo Labsystems, США) в течение 180 мин. Для статистического анализа использовали интегральный показатель хемилюминисценции за весь период измерения (RLU).

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета Statistica 7.0. Для проверки нормальности распределения использовали критерий Шапиро–Уилка. В случае распределения, приближенного к нормальному, использовали t-критерий Стьюдента, в остальных случаях — критерий Манна–Уитни для оценки значимости различий. За пороговый уровень значимости принимали величину p < 0,05. Результаты представлены в виде среднего и его ошибки (M±m).

Результаты и обсуждение

При оценке радикал-продуцирующей функции лейкоцитов показано, что классический стимулятор зимозан оказывал дозозависимое влияние на синтез активных форм кислорода (рис., А). Средняя площадь под кривой, описывающей генерацию радикалов при использовании зимозана в концентрации 15 мг/мл, составила 3,1±0,4 у.е., 150 мг/мл — 5,5±1,2 у.е. (p = 0,05) и 1500 мг/мл — 9,1±1,3 у.е. (p < 0,05 к концентрации 15 и 150 мг/мл).

 

Рисунок. Влияние зимозана (А), кадаверина и путресцина (Б) на радикал-продуцирующую активность лейкоцитов

Примечание. По оси ординат — интегральный показатель хемилюминисценции за весь период измерения (RLU), по оси абсцисс — минуты.

 

Прединкубация клеток с ПА оказывала неоднозначное действие на способность лейкоцитов к продукции радикалов. Так, действие кадаверина сопоставимо с таковым при максимальной концентрации зимозана (рис., Б). Усредненная площадь под кривой составила 6,7±0,7 у.е. (p < 0,05 к пробам с зимозаном в концентрации 15 мг/мл). В противоположность этому, после предобработки клеток путресцином максимальный уровень радикал-продуцирующей активности не достигал такового при минимальной концентрации зимозана (рис., Б). Площадь под кривой в пробах лейкоцитов, предобработанных путресцином — 2,8±0,4 у.е. (p < 0,05 к пробам с зимозаном в концентрации 150 и 1500 мг/мл).

Синтез полиаминов бактериальными клетками в очаге воспаления необходим по ряду причин и основная среди них — защита от активных форм кислорода, которые в большом количестве продуцируются лейкоцитами. В такой ситуации логично предположить повышение уровня полиаминов микробного происхождения в очаге, что было зарегистрировано нами ранее [2, 4]. Кроме этого нами показано влияние путресцина и кадаверина на поглотительную активность нейтрофилов и моноцитов [3]. На этом фоне выявленное в настоящем исследовании увеличение продукции радикалов предобработанными нейтрофилами и моноцитами кажется парадоксальным, но среди причин такой ситуации можно рассматривать и непосредственное влияние поликатионов на механизмы генерации радикалов [18], и активность диаминоксидазы лейкоцитов. Этот фермент катализирует превращение диаминов в аминоальдегид, что сопровождается выделением перекиси водорода, которая взаимодействует с люминолом [20], присутствующим в реакционной смеси. Повышение активности диаминоксидазы при активации лейкоцитов является закономерным феноменом. В исследованиях Houen G. и соавт. [15] показано, что активность диаминоксидазы увеличивается практически сразу после активации фагоцитирующих клеток. При этом фермент выполняет антимедиаторную противовоспалительную функцию, инактивируя гистамин и другие диамины, в том числе кадаверин и путресцин [9]. Такая ситуация является благоприятной для микроорганизмов, когда их структуры защищены избытком полиаминов и они в свою очередь активируют антимедиаторный фермент, результатом деятельности которого в итоге будет снижение активности воспаления [8, 25], что и было прослежено нами в исследованиях in vivo [2].

Различия в степени воздействия кадаверина и путресцина возможно связаны с разными механизмами их влияния на фагоцитирующие клетки. Путресцин — исходное соединение для синтеза двух физиологически активных полиаминов — спермидина и спермина [17], которые могут оказывать ингибирующее влияние на генерацию кислородсодержащих продуктов.

Заключение

Таким образом, предложенная нами ранее гипотеза о том, что ПА представляют собой рецептор-независимый фактор микробной агрессии [3], с одной стороны, благодаря полученным результатам, находит свое подтверждение, но в то же время прослеживается полифункциональность этих соединений. Кадаверин и путресцин, продукция которых осуществляется микроорганизмами в зависимости от условий микроокружения, очевидно, можно рассматривать в качестве медиаторов, опосредующих мало- или бессимптомное течение воспалительных заболеваний, что способствует реализации персистентного потенциала бактерий.

Об авторах

Анатолий Петрович Годовалов

ФГБОУ ВО Пермский государственный медицинский университет им. акад. Е.А. Вагнера Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: AGodovalov@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-5112-2003
SPIN-код: 4482-4378
Scopus Author ID: 632987

к.м.н., ведущий научный сотрудник ЦНИЛ, доцент кафедры микробиологии и вирусологии

Россия, г. Пермь

Тамара Исаковна Карпунина

ФГБОУ ВО Пермский государственный медицинский университет им. акад. Е.А. Вагнера Минздрава России

Email: karpuninapsma@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2511-4656
SPIN-код: 2542-8015
Scopus Author ID: 148127

д.б.н., профессор, профессор кафедры микробиологии и вирусологии

Россия, г. Пермь

Илья Андреевич Морозов

ФГБОУ ВО Пермский государственный медицинский университет им. акад. Е.А. Вагнера Минздрава России

Email: Lonny8@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-4233-3711

студент лечебного факультета

Россия, г. Пермь

Список литературы

Дополнительные файлы