Enhanced hydroxyl radical generation by human leukocytes exposed to bacterial diamines highlighting immunomodulatory effect of microbial metabolites

Full Text

В современной микробиологии наблюдается смена лидирующих тенденций: возбудители острых инфекционных заболеваний отходят на второй план, в то время как этиология и патогенез состояний со стертой клиникой, а тем более бессимптомная инфекция или носительство, оставаясь по сей день относительно малоизученными, привлекают все большее внимание исследователей. Отчасти такие метаморфозы связаны с наращиванием условно патогенной микрофлорой персистентного потенциала. Еще в середине прошлого века сначала Hobby G.L. (1942), а позднее Bigger J.W. обратили внимание на отсутствие полной стерилизации пенициллином культур Staphylococcus аureus [7]. Именно Bigger J.W. впервые применил к выжившей субпопуляции бактерий название клетки-персисторы («неделящиеся, бездействующие клетки») [7]. Однако лишь через несколько десятков лет была осознана значимость проблемы персистенции микроорганизмов [11, 16].

Персистентный потенциал обеспечивается различными приспособительными механизмами, выработанными бактериями в процессе эволюции, и универсален как для патогенов, так и для представителей индигенной микрофлоры [1]. Памятуя о том, что противомикробную защиту в организме человека, наряду с гуморальными факторами, осуществляют иммунокомпетентные клетки [10], логично предположить наличие у персистирующих бактерий метаболитов, оказывающих определенное влияние непосредственно на функциональную активность клеточных эффекторов иммунитета.

В последнее время возрастает интерес к исследованию роли полиаминов (ПА) в межклеточных взаимоотношениях, особенно в очаге воспаления, где наблюдается накопление этих поликатионов [14, 19]. Привлекают внимание в этом плане ПА микробного происхождения — кадаверин и путресцин [23]. Показано, что такие факторы, как дефицит питательных веществ, действие антимикробных и других реактантов, которые в очаге воспаления представлены в большом количестве, увеличивает скорость синтеза кадаверина и путресцина Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio cholerae [5, 6, 21]. Описана роль ПА как «скавенджеров» свободных радикалов [13], но до сих пор нет данных об их влиянии на радикал-продуцирующую активность лейкоцитов. Известно, что генерация активных форм кислорода (пероксид водорода, супероксидный анион-радикал, синглетный кислород, гидроксильный радикал, гипохлорид) является ключевым звеном деструкции фагоцитированных объектов [18]. Нарушение этого компонента фагоцитоза приводит к его незавершенности, когда микроорганизмы успешно персистируют в цитоплазме фагоцитов [12, 24].

Цель исследования — изучение особенностей генерации гидроксильных радикалов лейкоцитами человека под влиянием полиаминов микробного происхождения.

Материалы и методы

Пробы периферической венозной крови были получены от 20 практически здоровых доноров. Для оценки продукции гидроксильных радикалов проводили реакцию люминолзависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ) с лейкоцитами крови [22], выделенными методом седиментации с 0,1% метилцеллюлозой (Sigma-Aldrich, США), с последующей прединкубацией с кадаверином (0,01 М) и путресцином (0,01 М) в течение 60 мин при 37°С. При постановке реакции ЛЗХЛ использовали 2 × 10^–4 M натриевой соли люминола (Sigma, США), предобработанные ПА клетки (25 × 10⁶/мл) и неопсонизированный зимозан (конечные концентрации 15, 150 и 1500 мкг/мл). Измерение проводили на люминометре Luminoskan Ascent^® (Thermo Labsystems, США) в течение 180 мин. Для статистического анализа использовали интегральный показатель хемилюминисценции за весь период измерения (RLU).

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета Statistica 7.0. Для проверки нормальности распределения использовали критерий Шапиро–Уилка. В случае распределения, приближенного к нормальному, использовали t-критерий Стьюдента, в остальных случаях — критерий Манна–Уитни для оценки значимости различий. За пороговый уровень значимости принимали величину p < 0,05. Результаты представлены в виде среднего и его ошибки (M±m).

Результаты и обсуждение

При оценке радикал-продуцирующей функции лейкоцитов показано, что классический стимулятор зимозан оказывал дозозависимое влияние на синтез активных форм кислорода (рис., А). Средняя площадь под кривой, описывающей генерацию радикалов при использовании зимозана в концентрации 15 мг/мл, составила 3,1±0,4 у.е., 150 мг/мл — 5,5±1,2 у.е. (p = 0,05) и 1500 мг/мл — 9,1±1,3 у.е. (p < 0,05 к концентрации 15 и 150 мг/мл).

 

Рисунок. Влияние зимозана (А), кадаверина и путресцина (Б) на радикал-продуцирующую активность лейкоцитов

Примечание. По оси ординат — интегральный показатель хемилюминисценции за весь период измерения (RLU), по оси абсцисс — минуты.

 

Прединкубация клеток с ПА оказывала неоднозначное действие на способность лейкоцитов к продукции радикалов. Так, действие кадаверина сопоставимо с таковым при максимальной концентрации зимозана (рис., Б). Усредненная площадь под кривой составила 6,7±0,7 у.е. (p < 0,05 к пробам с зимозаном в концентрации 15 мг/мл). В противоположность этому, после предобработки клеток путресцином максимальный уровень радикал-продуцирующей активности не достигал такового при минимальной концентрации зимозана (рис., Б). Площадь под кривой в пробах лейкоцитов, предобработанных путресцином — 2,8±0,4 у.е. (p < 0,05 к пробам с зимозаном в концентрации 150 и 1500 мг/мл).

Синтез полиаминов бактериальными клетками в очаге воспаления необходим по ряду причин и основная среди них — защита от активных форм кислорода, которые в большом количестве продуцируются лейкоцитами. В такой ситуации логично предположить повышение уровня полиаминов микробного происхождения в очаге, что было зарегистрировано нами ранее [2, 4]. Кроме этого нами показано влияние путресцина и кадаверина на поглотительную активность нейтрофилов и моноцитов [3]. На этом фоне выявленное в настоящем исследовании увеличение продукции радикалов предобработанными нейтрофилами и моноцитами кажется парадоксальным, но среди причин такой ситуации можно рассматривать и непосредственное влияние поликатионов на механизмы генерации радикалов [18], и активность диаминоксидазы лейкоцитов. Этот фермент катализирует превращение диаминов в аминоальдегид, что сопровождается выделением перекиси водорода, которая взаимодействует с люминолом [20], присутствующим в реакционной смеси. Повышение активности диаминоксидазы при активации лейкоцитов является закономерным феноменом. В исследованиях Houen G. и соавт. [15] показано, что активность диаминоксидазы увеличивается практически сразу после активации фагоцитирующих клеток. При этом фермент выполняет антимедиаторную противовоспалительную функцию, инактивируя гистамин и другие диамины, в том числе кадаверин и путресцин [9]. Такая ситуация является благоприятной для микроорганизмов, когда их структуры защищены избытком полиаминов и они в свою очередь активируют антимедиаторный фермент, результатом деятельности которого в итоге будет снижение активности воспаления [8, 25], что и было прослежено нами в исследованиях in vivo [2].

Различия в степени воздействия кадаверина и путресцина возможно связаны с разными механизмами их влияния на фагоцитирующие клетки. Путресцин — исходное соединение для синтеза двух физиологически активных полиаминов — спермидина и спермина [17], которые могут оказывать ингибирующее влияние на генерацию кислородсодержащих продуктов.

Заключение

Таким образом, предложенная нами ранее гипотеза о том, что ПА представляют собой рецептор-независимый фактор микробной агрессии [3], с одной стороны, благодаря полученным результатам, находит свое подтверждение, но в то же время прослеживается полифункциональность этих соединений. Кадаверин и путресцин, продукция которых осуществляется микроорганизмами в зависимости от условий микроокружения, очевидно, можно рассматривать в качестве медиаторов, опосредующих мало- или бессимптомное течение воспалительных заболеваний, что способствует реализации персистентного потенциала бактерий.

About the authors

Anatoliy P. Godovalov

E.A. Vagner Perm State Medical University

Author for correspondence.
Email: AGodovalov@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-5112-2003
SPIN-code: 4482-4378
Scopus Author ID: 632987

PhD (Medicine), Leading Researcher of the Central Scientific Laboratory; Associate Professor, Department of Microbiology and Virology

Россия, Perm

Tamara I. Karpunina

E.A. Vagner Perm State Medical University

Email: karpuninapsma@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2511-4656
SPIN-code: 2542-8015
Scopus Author ID: 148127

PhD, MD (Biology), Professor, Professor of the Department of Microbiology and Virology

Россия, Perm

I. A. Morozov

E.A. Vagner Perm State Medical University

Email: Lonny8@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-4233-3711

Student of Medical Faculty

Россия, Perm

References

Supplementary files