Оптимизация системного и локального Т-клеточного иммунного ответа на живую гриппозную вакцину при включении в состав вакцинного штамма гена нуклеопротеина от эпидемического вируса гриппа

Обложка


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Введение. Оптимизация поствакцинального репертуара Т-клеток — один из способов расширения спектра защитного потенциала живой гриппозной вакцины (ЖГВ). Улучшить кросс-протективные свойства ЖГВ можно путем внесения в состав генома вакцинного штамма гена нуклеопротеина (NP) от эпидемического родительского вируса, то есть при замене классической формулы генома 6:2 на 5:3. Ранее на примере вирусов гриппа H1N1, H3N2 и H7N9 было показано, что вакцинные штаммы ЖГВ 5:3 стимулируют более выраженный Т-клеточный ответ к эпитопам NP эпидемического родительского вируса, чем классические варианты ЖГВ 6:2. Основной целью настоящего исследования явилась детальная оценка субпопуляций вирусспецифических системных и тканерезидентных Т-клеток памяти у мышей, иммунизированных штаммами сезонной ЖГВ подтипа H1N1 с формулами генома 6:2 и 5:3. Материалы и методы. Методами обратной генетики были сконструированы вакцинные штаммы ЖГВ подтипа H1N1, отличающихся источником гена NP (ЖГВ 6:2 и ЖГВ 5:3). Мышей линии C57BL/6J иммунизировали интраназально вакцинными кандидатами, двукратно с трехнедельным интервалом. Через 7 дней после повторной иммунизации у мышей выделяли клетки из тканей селезенки и легких, стимулировали цельным вирусом гриппа H1N1 и оценивали уровни цитокин-продуцирующих Т-клеток памяти с фенотипом CD44+CD62L– методами проточной цитометрии. Для клеток, выделенных из легких, также определяли экспрессию поверхностных маркеров CD69 и CD103. Гуморальный иммунитет к вирусу H1N1 оценивали в иммуноферментном анализе сывороток крови мышей, собранных через 3 недели после повторной иммунизации. Результаты. Вакцинный штамм ЖГВ 5:3, несущий NP ген от эпидемического родителя, индуцировал достоверно более выраженный гуморальный иммунный ответ к актуальному вирусу гриппа, чем классический вариант ЖГВ 6:2. В группе мышей, привитых ЖГВ 5:3, наблюдались более высокие уровни вирусспецифических CD4+ и CD8+ Т-клеток эффекторной памяти (ТЕМ) в селезенках мышей, включая субпопуляцию полифункциональных (IFNγ+TNFα+IL-2+) CD4+ ТЕМ, по сравнению с группой ЖГВ 6:2. Также наблюдалась тенденция к выработке более высоких уровней вирусспецифических Т-клеток памяти в тканях легких при иммунизации ЖГВ 5:3 в сравнении с ЖГВ 6:2, однако достоверной разницы в стимуляции тканерезидентных Т-клеток с фенотипами CD69+CD103– и CD69+CD103+ между группами не наблюдалось. Заключение. Получены дополнительные экспериментальные свидетельства перспективности модификации генома вакцинного штамма сезонной живой гриппозной вакцины с целью актуализации эпитопного состава вакцинных вирусов, поскольку такая модификация усиливает вирусспецифический Т-клеточный иммунный ответ как на системном уровне, так и в тканях легких, что в итоге может повысить эффективность вакцины в отношении циркулирующих вирусов гриппа.

Полный текст

Введение

Вирусы гриппа являются высококонтагиозными респираторными патогенами, которые представляют постоянную угрозу для мирового здравоохранения. Ежегодные эпидемии гриппа вызывают до 5 млн случаев тяжелых респираторных заболеваний, до 650 000 которых приводят к летальному исходу [9]. Вакцинация является наиболее эффективным средством профилактики гриппа, поскольку она может значительно снизить риск заражения гриппом, а также тяжесть и продолжительность заболевания [4, 6].

В настоящее время в мировой практике существует большое разнообразие вакцин против вируса гриппа, однако их общим недостатком является достаточно узкая специфичность, что приводит к снижению эффективности вакцинации при циркуляции дрейфовых вариантов вируса, и, как следствие — к необходимости регулярного обновления штаммового состава вакцин [16, 17]. Лицензированные сезонные вакцины против гриппа направлены на поверхностные антигены вируса — гемагглютинин (HA) и нейраминидазу (NA). В результате вакцинации преимущественно индуцируются нейтрализующие антитела против иммунодоминантных гипервариабельных эпитопов поверхностных вирусных белков, обеспечивая ограниченную защиту от антигенно удаленных вирусов гриппа. Поэтому поиск новых подходов для повышения иммуногенности и эффективности гриппозных вакцин является приоритетной задачей здравоохранения. За последнее десятилетие был достигнут существенный прогресс в разработке противогриппозных вакцин широкого спектра действия, которые направлены на индукцию антител к консервативным вирусным антигенам, таким как HA, NA или внеклеточный домен М2 белка (M2e) [8, 29]. Кроме того, активно разрабатываются подходы на основе Т-клеток, поскольку такие вакцины имеют наибольший потенциал для индукции долгоживущих кросс-протективных факторов иммунной защиты [22]. Однако разработка новых Т-клеточных вакцин сопровождается серьезными трудностями, такими как большое разнообразие генов главного комплекса гистосовместимости в популяции, отсутствие адекватных животных моделей для тестирования таких вакцин в доклинических исследованиях, а также недостаток информации о том, какие уровни субпопуляций Т-клеток коррелируют с защитой от инфекции [8]. Соответственно, помимо создания новых вакцин, нацеленных на индукцию Т-клеток памяти к консервативным вирусным антигенам, не менее важной задачей является усовершенствование лицензированных гриппозных вакцин. В частности, одним из способов расширения спектра защитного потенциала живой гриппозной вакцины (ЖГВ) является оптимизация репертуара Т-клеток, которые образуются после вакцинации.

Известно, что, изолированного в 1957 г., вполне вероятно, что некоторые индуцированные ЖГВ Т-клетки больше не смогут распознавать эпитопы циркулирующих в настоящее время вирусов гриппа. Несмотря на достаточно высокий уровень консервативности NP среди различных вирусов гриппа А, за последние десятилетия данный белок приобрел значительное количество мутаций, входящих в иммуногенные Т-клеточные эпитопы [19, 31]. Ранее нами была показана принципиальная [7, 21].

Целью настоящего исследования явилась детальная оценка субпопуляций вирусспецифических системных и тканерезидентных Т-клеток памяти у мышей, иммунизированных штаммами сезонной ЖГВ подтипа H1N1 с формулами генома 6:2 и 5:3.

Материалы и методы

Вирусы. Экспериментальные реассортантные штаммы подтипа H1N1 были получены стандартными методами обратной генетики на основе донора аттенуации отечественной живой гриппозной вакцины (ЖГВ) A/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (Лен/17) по описанной ранее методике [21]. В качестве родительского эпидемического вируса гриппа выступал штамм A/Гуандун-Маонань/SWL1536/2019 (H1N1) [H1N1/wt], полученный из коллекции NIBSC (Великобритания). Вакцинные штаммы содержали гены PB2, PB1, PA, M, NS от донора аттенуации Лен/17, а гены гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA) — от вируса H1N1/wt. Ген нуклеопротеина (NP) у штамма ЖГВ 6:2 был унаследован от донора аттенуации Лен/17, а у штамма ЖГВ 5:3 — от эпидемического вируса H1N1/wt. Вирусы культивировали в 10–11 дневных развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) при 33°С (для вакцинных штаммов ЖГВ) или при 37°С (для эпидемического штамма H1N1/wt). Инфекционные титры определяли методом предельных разведений на РКЭ, подсчитывали по методу Рида и Менча [20] и выражали в lgЭИД50/мл.

Для проведения иммунологических тестов вирус гриппа H1N1/wt очищали методом ультрацентрифугирования на градиенте плотности сахарозы. Для этого вирусную биомассу наращивали в РКЭ, и после осаждения дебриза низкоскоростным центрифугированием надосадочную жидкость подвергали центрифугированию с ускорением 34000g в течение 2-х часов с использованием ультрацентрифуги Optima L-100 XP (Beckman Coulter, США). После этого ресуспендированный в PBS осадок очищали на ступенчатом градиенте сахарозы (30% и 60%) с ускорением 23 000g в течение 1 часа. Фракцию, содержащую вирусные частицы, собирали и ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), после чего проводили финальное центрифугирование с ускорением 23 000g в течение 1 часа. Осадок ресуспендировали в 1 мл ФСБ, аликвотили и хранили при –70°С.

Иммунизация мышей. Для эксперимента по оценке иммуногенности и кросс-протективного действия сконструированных вакцинных кандидатов подтипа H1N1 использовали самок мышей линии C57BL/6J, поставляемых из питомника Филиал Столбовая ФГБУН НЦБМТ ФМБА России. Через 3 недели после повторной иммунизации у мышей собирали сыворотки крови для оценки гуморального иммунного ответа в иммуноферментном анализе (ИФА). Исследование было одобрено Локальным этическим комитетом ФГБНУ «ИЭМ» (протокол № 1/20 от 27.02.2020).

Оценка гуморального иммунного ответа. Уровни сывороточных IgG-антител к цельному вирусу A/H1N1wt были определены с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) по стандартному протоколу. Планшеты с высокой сорбцией покрывали очищенным на градиенте плотности сахарозы вирусом гриппа A/H1N1wt. После отмывок и блокировки неспецифического связывания с помощью раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА), в лунки вносили 2-кратные разведения сывороток мышей. После инкубации и соответствующих промывок проводили детекцию связанных с антигеном IgG антител при помощи вторичных антител к IgG мыши, конъюгированных с пероксидазой хрена (BioRad, США). Проявку планшетов осуществляли с использованием субстрата 1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution (Thermo, США). Реакцию останавливали добавлением 1M раствора H2SO4, после чего измеряли оптическую плотность раствора при 450 нм (ОП450) с помощью спектрофотометра xMark (BioRad, США). За титр сыворотки принимали максимальное разведение образца, при котором ОП450 превышало в 2 раза среднее значение ОП450 контрольных лунок (антиген без добавления сыворотки).

Оценка Т-клеточного иммунного ответа. Определение системных и локализованных в легких Т-клеток памяти проводилось по ранее описанному методу [18] с некоторыми модификациями. В отличии от указанного исследования, где иммунный ответ оценивался путем стимуляции клеток синтетическими пептидами, соответствующими иммунодоминантным CD8+ T-клеточным эпитопам NP366 современного и устаревшего вирусов, в настоящей работе проводили стимуляцию иммунных клеток цельным очищенным вирусом A/Гуандун-Маонань/SWL1536/2019 (H1N1). Такая стимуляция лучше отражает реальную клиническую ситуацию, поскольку при гриппе организм сталкивается с циркулирующим вирусом в его естественном виде, и инфицированные клетки презентируют на комплексах MHC I и MHC II большое разнообразие Т-клеточных вирусных эпитопов. Одиночные спленоциты выделяли в среде CR-0 (RPMI-1640, с содержанием антибиотика-антимикотика, 25 мМ HEPES (все от Capricorn, Германия) и 50 мкМ 2-меркаптоэтанолом (Sigma, США)), используя фильтры с размером пор 70 мкм (BD Biosciences, США). Затем эритроциты лизировали с помощью буфера для лизиса эритроцитов (Biolegend, США). Для внутриклеточного окрашивания цитокинов (ICS) 2 × 106 клеток добавляли в стерильные микропланшеты с U-образным дном в 100 мкл среды CR-10 (среда CR-0, содержащая 10% эхмбриональной бычьей сыворотки). Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл среды CR-10, содержащей очищенный вирус H1N1/wt в дозе 2 инфекционные единицы на клетку, и инкубировали в течение 18 часов при 37°С, 5% СО2. Затем к пробам добавляли раствор GolgiPlug™ (BD Biosciences, США), в конечной концентрации 1:1000 для остановки белкового транспорта. Стимуляция форболмиристатом ацетата (PMA) (Sigma, США) использовалась в качестве положительного контроля; также были приготовлены нестимулированные контрольные образцы и образцы изотипического контроля. Клетки инкубировали в течение 5 ч при 37°C, 5% CO2, затем окрашивали в течение 20 мин при 4°C в темноте с помощью флуоресцентного красителя для фиксации живых/мертвых клеток (ZombieAqua, Invitrogen, США) и смесью следующих флюоресцентно меченных поверхностных антител: CD4-PerCP/Cy5.5, CD8-APC/Cy7, CD44-PE, и CD62LBV421 (все от BioLegend, США). Набор Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, США) использовался для фиксации/пермеабилизации, после чего клетки окрашивали антителами к цитокинам IFNγ-FITC, TNFα-APC и IL2-PE/Cy7 (все от BioLegend) в течение 20 мин при 4°C в темноте. Образцы фиксировали буфером Cytolast (Biolegend) и анализировали с помощью флуориметра «Navios» (Beckman Coulter, США).

Для обнаружения тканерезидентных Т-клеток памяти (TRM) перфузированные легкие разрезали на мелкие кусочки стерильными ножницами и обрабатывали смесью ДНКазы I и коллагеназы (обе от Sigma) в течение 40 мин при 37°C. Затем готовили суспензию отдельных клеток с помощью фильтров с размером пор 70 мкм. Эритроциты лизировали, как описано выше, а стимуляцию клеток проводили по той же процедуре, что и для спленоцитов, только для окраски поверхностных маркеров и внутриклеточных цитокинов использовали другой набор антител. Набор поверхностных антител включал CD4-PerCP/Cy5.5, CD8-APC/Cy7, CD44-APC, CD62L-BV421, CD69-PE/Cy7, и CD103-FITC (все от BioLegend, США), в то время как внутриклеточно проводили окраску на один цитокин — IFNγ-PE/Dazzle. Подсчитывали количество цитокин-позитивных клеток в стимулированных группах и вычитали уровень спонтанной секреции цитокинов в нестимулированных контрольных образцах.

Статистическая обработка результатов. Для анализа данных проточной цитометрии использовали программу Kaluza Analysis (Beckman Coulter). Для расчетов, статистического анализа и подготовки иллюстраций использовали программу GraphPad Prism 7.0. Сравнение данных проводилось с использованием дисперсионного анализа ANOVA с поправкой Тьюки или U-критерия Манна–Уитни, различия считали достоверными при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

Для данного исследования с использованием методов обратной генетики были сконструированы два вакцинных штамма ЖГВ, отличающиеcя источником гена NP. У штамма ЖГВ 6:2 гены HA и NA унаследованы от эпидемического вируса H1N1/wt, остальные гены — от донора аттенуации Лен/17. У штамма ЖГВ 5:3 три гена — HA, NA и NP — были унаследованы от H1N1/wt, остальные гены также принадлежали Лен/17. Накопленные в РКЭ вирусы характеризовались высокой инфекционной активностью: штамм ЖГВ 6:2 размножался в РКЭ при оптимальной температуре 33°С до титра 9,5 lgЭИД50/мл, а штамм ЖГВ 5:3 — до 8,9 lgЭИД50/мл. Эти данные указывают на отсутствие негативного влияния NP гена от эпидемического родителя на репликативные свойства вакцинного штамма ЖГВ.

У мышей, двукратно иммунизированных исследуемыми штаммами, собирали иммунные сыворотки и оценивали уровни IgG антител в ИФА с использованием цельного эпидемического вируса в качестве антигенной подложки. Было показано, что кандидат, несущий NP ген от эпидемического родителя (штамм ЖГВ 5:3), индуцировал достоверно более выраженный гуморальный иммунный ответ к вирусу гриппа, чем классический вариант ЖГВ 6:2 (рис. 1). Эти данные могут указывать на то, что при иммунизации ЖГВ антитела формируются не только к поверхностным антигенам вируса гриппа, но и к его нуклеопротеину. Действительно, гриппозная инфекция и вакцинация цельновирионными вакцинами (как живыми, так и инактивированными) приводит к выработке сывороточных IgG-антител к NP-белку [5], при этом они не обладают вирус-нейтрализующей активностью. Несмотря на то что этот антиген не представлен на поверхности вириона, он детектируется в большом количестве на поверхности зараженных вирусом клеток [1, 28], что делает его потенциальной мишенью для антитело-зависимых иммунных реакций, таких как антитело-зависимая клеточная цитотоксичность или комплемент-зависимая цитотоксичность [10, 27]. Поскольку NP белок донора аттенуации Лен/17 и современного эпидемического вируса H1N1 отличается на 29 аминокислотных остатка, эти различия могут оказывать существенное действие на антигенные свойства данного белка. Соответственно, анти-NP антитела, выработанные в ответ на иммунизацию вариантом ЖГВ 6:2, могут распознавать не все В-клеточные эпитопы NP белка современного вируса гриппа.

 

Рисунок 1. Выявление вирусспецифических IgG-антител в сыворотках крови мышей, иммунизированных двукратно вакцинными штаммами ЖГВ 6:2 и ЖГВ 5:3. Примечания. Уровни антител выявлялись в иммуноферментном анализе с использованием цельного вируса A/Гуандун-Маонань/SWL1536/2019 (H1N1). А. Средние значения оптической плотности в лунках при каждом разведении сывороток. Б. Значения титров антител в каждой исследуемой группе. Сравнение данных проводилось с использованием дисперсионного анализа ANOVA с поправкой Тьюки (*p < 0,05; ****р < 0,0001).

 

Основной целью настоящего исследования явилась сравнительная оценка уровней вирусспецифических Т-клеток, индуцируемых в ответ на иммунизацию штаммами ЖГВ с формулами генома 6:2 и 5:3, как на системном (в селезенках), так и на локальном уровне (в тканях легких). В более раннем исследовании нами было показано, что вакцинный штамм подтипа H1N1 с формулой генома 5:3 стимулирует более выраженный системный Т-клеточный иммунный ответ по сравнению с классическим вариантом ЖГВ 6:2, что выявлялось в результате стимуляции спленоцитов иммунизированных мышей цельным вирусом H1N1/wt [21]. При этом иммунный ответ ранее оценивался по продукции одного цитокина в ответ на стимуляцию вирусом, а именно IFNγ. Данный цитокин относится к интерферонам II типа — семейству белков, изначально ассоциированных с ингибированием вирусной репликации [30]. В настоящее время известно, что IFNγ активно продуцируется антиген-активированными Т-лимфоцитами и цитокин-активированными врожденными лимфоидными клетками группы 1 (ILC1) [11], вследствие чего именно этот цитокин чаще всего используется для выявления вирусспецифических Т-клеток в экспериментальных исследованиях. Однако не менее важно оценивать способность иммунных клеток продуцировать и другие ключевые провоспалительные цитокины, участвующие в противовирусном ответе, такие как фактор некроза опухоли альфа (TNFα) и интерлейкин 2 (IL-2). Полифункциональные Т-клетки, способные продуцировать сразу несколько цитокинов, являются более точными предикторами способности организма противостоять реинфекции, чем монофункциональные клетки с секрецией IFNγ [15], причем CD4+ Т-клетки, продуцирующие только IFNγ, значительно отличаются от полифункциональных клеток даже по транскрипционному профилю [2].

В настоящем исследовании выявляли субпопуляции полифункциональных вирусспецифических Т-клеток памяти у мышей, двукратно иммунизированных вакцинными штаммами ЖГВ 6:2 и ЖГВ 5:3. Для этого спленоциты иммунизированных животных стимулировали цельным вирусом H1N1/wt и определяли пропорции CD4+ и CD8+ Т-клеток памяти с фенотипом CD44+СD62L– (ТЕМ), отвечающих на стимуляцию продукцией цитокинов IFNγ, TNFα или IL-2 (рис. 2). Оба вакцинных штамма приводили к образованию высоких уровней CD4+ цитокин-продуцирующих Т-клеток значительно отличаясь от контрольной группы животных (рис. 2Б), что указывает на наличие в белках вакцинных штаммов консервативных Т-клеточных эпитопов, которые могут распознавать эпитопы эпидемического вируса H1N1/wt. Важно отметить, что уровень CD8+ IFNγ-продуцирующих ТЕМ в группе ЖГВ 5:3 был значительно выше такового в группе ЖГВ 6:2, что свидетельствует о более релевантном стимулировании Т-клеток памяти при иммунизации вакцинным штаммом с актуализированным геном NP (рис. 2В). Наиболее важным результатом данного раздела работы явилось обнаружение значительного уровня полифункциональных (IFNγ+TNFα+IL-2+) CD4+ ТЕМ в спленоцитах мышей, привитых ЖГВ 5:3, который значительно превышал содержание таких клеток в группе классической ЖГВ 6:2 (рис. 2Б). Для CD8+ ТЕМ клеток также была выявлена тенденция к увеличению пропорции полифункциональных Т-клеток, однако из-за небольшого количества животных в группе и высокой дисперсии различия между группами не были достоверными (рис. 2В). Таким образом, исследование системного Т-клеточного иммунитета, образованного в ответ на иммунизацию экспериментальными штаммами ЖГВ подтипа H1N1, выявило преимущества модифицированного варианта с формулой генома 5:3 по сравнению с классическим штаммом ЖГВ 6:2 в плане индукции системных моно- и полифункциональных вирусспецифических Т-клеток эффекторной памяти, что согласуется с данными, полученными нами ранее для вакцинных штаммов ЖГВ подтипа H7N9, где спленоциты были стимулированы пептидом, соответствующим иммунодоминантному эпитопу NP366 современного вируса [18].

 

Рисунок 2. Индукция системного Т-клеточного ответа в ответ на иммунизацию вакцинными штаммами ЖГВ 6:2 и ЖГВ 5:3. Примечания. А. Репрезентативные дот-плот графики данных проточной цитометрии спленоцитов мышей после стимуляции цельным вирусом H1N1/wt. Б. Уровни цитокин-продуцирующих CD4+ Т-клеток среди популяции эффекторной памяти (CD44+СD62L–). В. Уровни цитокин-продуцирующих CD8+ Т-клеток среди популяции эффекторной памяти (CD44+СD62L–). Представлены субпопуляции ТЕМ, продуцирующие IFNγ (слева), IFNγ и TNFα (посередине), и IFNγ, TNFα и IL-2 (справа) в ответ на двукратную вакцинацию. * р < 0,05, ** р < 0,01.

 

Следует отметить, что в ранних исследованиях с сезонным вирусом гриппа H1N1 не изучалось формирование субпопуляций тканерезидентных (локализующихся в тканях легких) Т-клеток памяти (TRM), которые представляют собой первую линию адаптивной клеточной защиты организма от схожего по эпитопному составу респираторного патогена [25, 26]. На предыдущем этапе исследования были изучены особенности формирования TRM клеток в ответ на иммунизацию вакцинным штаммом ЖГВ 5:3 подтипа H7N9, однако в том случае стимуляцию клеток, выделенных из легких иммунизированных мышей, стимулировали одним пептидом, соответствующим иммунодоминантному эпитопу NP366 [18]. В настоящем эксперименте с вакцинными штаммами сезонной ЖГВ подтипа H1N1 представлялось важным оценить субпопуляции TRM клеток к полному протеому эпидемического вируса гриппа, то есть при стимуляции иммунных клеток цельным живым вирусом H1N1/wt. В легких изучали фенотип лимфоцитов, продуцирующих интерферон в ответ на стимуляцию очищенным вирусом гриппа, в том числе оценивали экспрессию интерферонпродуцирующими клетками маркеров тканерезидентных клеток памяти CD69 и CD103. Лектин CD69 является классическим ранним маркером активации лимфоцитов благодаря своему быстрому появлению на поверхности плазматической мембраны после стимуляции, а также считается маркером тканевой локализации клеток за счет противодействия S1P1 рецептору, тем самым препятствуя выходу лимфоцитов в кровоток [3, 14, 23]. Молекула CD103 представляет собой альфа-субъединицу интегрина αEβ7, связывающегося с молекулой клеточной адгезии E-кадгерином, активно экспрессируемой эпителиальными клетками для поддержания целостности барьерных тканей. Соответственно, экспрессия маркера CD103 на TRM клетках способствует их удержанию в эпителиальном пласте [13, 24, 31].

Соответственно, на 7-е сутки после двукратной иммунизации вакцинными штаммами ЖГВ H1N1 6:2 и ЖГВ H1N1 5:3 у мышей выделяли клетки из тканей легких и стимулировали цельным вирусом H1N1/wt с последующим выявлением вирусспецифических (то есть IFNγ+) Т-клеток эффекторной памяти (CD44+CD62L–), экспрессирующих маркеры тканерезидентности (CD69+CD103+). Было показано, что ТЕМ клетки мышей, иммунизированных штаммом ЖГВ 5:3, имеют тенденцию к экспрессии более высоких уровней IFNγ в ответ на стимуляцию цельным вирусом H1N1/wt, по сравнению с группой ЖГВ 6:2, что говорит о большей интенсивности клеточного ответа после иммунизации модифицированной вакциной (рис. 3А, Г). Эти данные указывают на более выраженную индукцию вирусспецифических Т-клеток памяти, локализующихся в легких мышей, при иммунизации вакцинным прототипом ЖГВ 5:3, по сравнению с классическим вариантом ЖГВ 6:2. Среди интерферон-продуцирующих Т-клеток эффекторной памяти более 70% экспрессировали маркер СD69 (рис. 3Б, Д). Кроме того, значительное количество CD8+CD69+ TEM клеток несли маркер CD103+, свидетельствующий о локализации данных клеток в барьерных тканях, в непосредственной близости от потенциального места проникновения патогена (рис. 3Е).

 

Рисунок 3. Уровни тканерезидентных CD4+ (верхняя панель) и CD8+ (нижняя панель) Т-клеток памяти у мышей, иммунизированных ЖГВ 6:2 и ЖГВ 5:3, а также получивших препарат плацебо (ФСБ). Примечания. Количество клеток, экспрессирующих IFNγ среди популяции CD4+ (А) и CD8+ (Г) Т-клеток эффекторной памяти (СD44+CD62L–) в образцах легких иммунизированных мышей. Второй столбец: представлена доля CD69+ клеток среди соответствующих популяций (Б, Д). Третий столбец: доля СD69+CD103+ клеток (В, Е). Достоверные различия между группами (критерий Манна–Уитни) показаны на рисунках, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

 

Таким образом, в настоящем исследовании были получены подтверждающие экспериментальные свидетельства о перспективности модификации генома вакцинного штамма сезонной живой гриппозной вакцины с целью актуализации эпитопного состава вакцинных штаммов. Достаточно простой для практической реализации способ — замена гена нуклеопротеина с устаревшего (от донора аттенуации Лен/17) на актуальный (от эпидемического родительского вируса) — приводит к существенному повышению уровней вирусспецифических Т-клеток памяти, как на системном уровне, так и в тканях легких, что должно повысить эффективность вакцины в отношении циркулирующих вирусов гриппа. Также ранее была продемонстрирована безопасность вакцинных штаммов ЖГВ с формулой генома 5:3 с использованием разных животных моделей [7, 12, 21], что обосновывает перспективность их дальнейшего изучения в клинических исследованиях на добровольцах.

×

Об авторах

П. И. Прокопенко

ФГБНУ Институт экспериментальной медицины

Автор, ответственный за переписку.
Email: pi.prokopenko@gmail.com

младший научный сотрудник отдела вирусологии им. А.А. Смородинцева

Россия, Санкт-Петербург

Е. А. Степанова

ФГБНУ Институт экспериментальной медицины

Email: pi.prokopenko@gmail.com

к.б.н., ведущий научный сотрудник отдела вирусологии им. А.А. Смородинцева

Россия, Санкт-Петербург

В. А. Матюшенко

ФГБНУ Институт экспериментальной медицины

Email: pi.prokopenko@gmail.com

научный сотрудник отдела вирусологии им. А.А. Смородинцева

Россия, Санкт-Петербург

А. К. Чистякова

ФГБНУ Институт экспериментальной медицины

Email: pi.prokopenko@gmail.com

лаборант-исследователь отдела вирусологии им. А.А. Смородинцева

Россия, Санкт-Петербург

А. Д. Костромитина

ФГБНУ Институт экспериментальной медицины

Email: pi.prokopenko@gmail.com

лаборант-исследователь отдела вирусологии им. А.А. Смородинцева

Россия, Санкт-Петербург

Т. С. Котомина

ФГБНУ Институт экспериментальной медицины

Email: pi.prokopenko@gmail.com

научный сотрудник отдела вирусологии им. А.А. Смородинцева

Россия, Санкт-Петербург

А. Я. Рак

ФГБНУ Институт экспериментальной медицины

Email: pi.prokopenko@gmail.com

к.б.н., старший научный сотрудник отдела вирусологии им. А.А. Смородинцева

Россия, Санкт-Петербург

А. А. Рубинштейн

ФГБНУ Институт экспериментальной медицины

Email: pi.prokopenko@gmail.com

младший научный сотрудник лаборатории клеточной иммунологии отдела иммунологии

Россия, Санкт-Петербург

И. В. Кудрявцев

ФГБНУ Институт экспериментальной медицины

Email: pi.prokopenko@gmail.com

к.б.н., зав. лабораторией клеточной иммунологии отдела иммунологии

Россия, Санкт-Петербург

В. В. Новицкая

ФГБНУ Институт экспериментальной медицины

Email: pi.prokopenko@gmail.com

лаборант-исследователь отдела вирусологии им. А.А. Смородинцева

Россия, Санкт-Петербург

Л. Г. Руденко

ФГБНУ Институт экспериментальной медицины

Email: pi.prokopenko@gmail.com

д.м.н., профессор, зав. отделом вирусологии им. А.А. Смородинцева

Россия, Санкт-Петербург

И. Н. Исакова-Сивак

ФГБНУ Институт экспериментальной медицины

Email: pi.prokopenko@gmail.com

член-корреспондент РАН, д.б.н., зав. лабораторией иммунологии и профилактики вирусных инфекций отдела вирусологии им. А.А. Смородинцева

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

  1. Bodewes R., Geelhoed-Mieras M.M., Wrammert J., Ahmed R., Wilson P.C., Fouchier R.A., Osterhaus A.D., Rimmelzwaan G.F. In vitro assessment of the immunological significance of a human monoclonal antibody directed to the influenza a virus nucleoprotein. Clin. Vaccine Immunol., 2013, vol. 20, no. 8, pp. 1333–1337. doi: 10.1128/CVI.00339-13
  2. Burel J.G., Apte S.H., Groves P.L., McCarthy J.S., Doolan D.L. Polyfunctional and IFN-γ monofunctional human CD4(+) T cell populations are molecularly distinct. JCI Insight, 2017, vol. 2, no 3: e87499. doi: 10.1172/jci.insight.87499
  3. Cibrian D., Sanchez-Madrid F. CD69: from activation marker to metabolic gatekeeper. Eur. J. Immunol., 2017, vol. 47, no. 6, pp. 946–953. doi: 10.1002/eji.201646837
  4. Deiss R.G., Arnold J.C., Chen W.J., Echols S., Fairchok M.P., Schofield C., Danaher P.J., McDonough E., Ridore M., Mor D., Burgess T.H., Millar E.V. Vaccine-associated reduction in symptom severity among patients with influenza A/H3N2 disease. Vaccine, 2015, vol. 33, no. 51, pp. 7160–7167. doi: 10.1016/j.vaccine.2015.11.004
  5. Flynn J.A., Weber T., Cejas P.J., Cox K.S., Touch S., Austin L.A., Ou Y., Citron M.P., Luo B., Gindy M.E., Bahl K., Ciaramella G., Espeseth A.S., Zhang L. Characterization of humoral and cell-mediated immunity induced by mRNA vaccines expressing influenza hemagglutinin stem and nucleoprotein in mice and nonhuman primates. Vaccine, 2022, vol. 40, no. 32, pp. 4412–4423. doi: 10.1016/j.vaccine.2022.03.063
  6. Godoy P., Romero A., Soldevila N., Torner N., Jane M., Martinez A., Cayla J.A., Rius C., Dominguez A., Working Group on Surveillance of Severe Influenza Hospitalized Cases in C. Influenza vaccine effectiveness in reducing severe outcomes over six influenza seasons, a case-case analysis, Spain, 2010/11 to 2015/16. Euro Surveill., 2018, vol. 23, no. 43. doi: 10.2807/1560-7917.ES.2018.23.43.1700732
  7. Isakova-Sivak I., Stepanova E., Mezhenskaya D., Matyushenko V., Prokopenko P., Sychev I., Wong P.F., Rudenko L. Influenza vaccine: progress in a vaccine that elicits a broad immune response. Expert Rev. Vaccines, 2021, vol. 20, no. 9, pp. 1097–1112. doi: 10.1016/j.virol.2016.10.027
  8. Isakova-Sivak I., Korenkov D., Smolonogina T., Tretiak T., Donina S., Rekstin A., Naykhin A., Shcherbik S., Pearce N., Chen L.M., Bousse T., Rudenko L. Comparative studies of infectivity, immunogenicity and cross-protective efficacy of live attenuated influenza vaccines containing nucleoprotein from cold-adapted or wild-type influenza virus in a mouse model. Virology, 2017, vol. 500, pp. 209–217. doi: 10.1080/14760584.2021.1964961
  9. Iuliano A.D., Roguski K.M., Chang H.H., Muscatello D.J., Palekar R., Tempia S., Cohen C., Gran J.M., Schanzer D., Cowling B.J., Wu P., Kyncl J., Ang L.W., Park M., Redlberger-Fritz M., Yu H., Espenhain L., Krishnan A., Emukule G., van Asten L., Pereira da Silva S., Aungkulanon S., Buchholz U., Widdowson M.A., Bresee J.S. Global Seasonal Influenza-associated Mortality Collaborator Network. Estimates of global seasonal influenza-associated respiratory mortality: a modelling study. Lancet, 2018, vol. 391, no. 10127, pp. 1285–1300. doi: 10.1016/S0140-6736(17)33293-2
  10. Jegaskanda S., Co M.D.T., Cruz J., Subbarao K., Ennis F.A., Terajima M. Induction of H7N9-Cross-Reactive Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Antibodies by Human Seasonal Influenza A Viruses that are Directed Toward the Nucleoprotein. J. Infect. Dis., 2017, vol. 215, no. 5, pp. 818–823. doi: 10.1093/infdis/jiw629
  11. Kang S., Brown H.M., Hwang S. Direct Antiviral Mechanisms of Interferon-Gamma. Immune Netw, 2018, vol. 18, no. 5: e33. doi: 10.4110/in.2018.18.e33
  12. Korenkov D.A., Laurie K.L., Reading P.C., Carolan L.A., Chan K.F., Isakova-Sivak I.I., Smolonogina T.A., Subbarao K., Barr I.G., Villanueva J., Shcherbik S., Bousse T., Rudenko L.G. Safety, immunogenicity and protection of A(H3N2) live attenuated influenza vaccines containing wild-type nucleoprotein in a ferret model. Infect. Genet. Evol., 2018, vol. 64, pp. 95–104. doi: 10.1016/j.meegid.2018.06.019
  13. Lee Y.-T., Suarez-Ramirez J.E., Wu T., Redman J.M., Bouchard K., Hadley G.A., Cauley L.S. Environmental and antigen receptor-derived signals support sustained surveillance of the lungs by pathogen-specific cytotoxic T lymphocytes. J. Virol., 2011, vol. 85, no. 9, pp. 4085–4094. doi: 10.1128/JVI.02493-10
  14. Mackay L.K., Braun A., Macleod B.L., Collins N., Tebartz C., Bedoui S., Carbone F.R., Gebhardt T. Cutting edge: CD69 interference with sphingosine-1-phosphate receptor function regulates peripheral T cell retention. J. Immunol., 2015, vol. 194, no. 5, pp. 2059–2063. doi: 10.4049/jimmunol.1402256
  15. Makedonas G., Betts M.R. Polyfunctional analysis of human t cell responses: importance in vaccine immunogenicity and natural infection. Springer Semin. Immunopathol., 2006, vol. 28, no. 3, pp. 209–219. doi: 10.1007/s00281-006-0025-4
  16. Okoli G.N., Racovitan F., Abdulwahid T., Hyder S.K., Lansbury L., Righolt C.H., Mahmud S.M., Nguyen-Van-Tam J.S. Decline in Seasonal Influenza Vaccine Effectiveness With Vaccination Program Maturation: A Systematic Review and Meta-analysis. Open Forum Infect. Dis., 2021, vol. 8, no. 3: ofab069. doi: 10.1093/ofid/ofab069
  17. Osterholm M.T., Kelley N.S., Sommer A., Belongia E.A. Efficacy and effectiveness of influenza vaccines: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect. Dis., 2012, vol. 12, no. 1, pp. 36–44. doi: 10.1016/S1473-3099(11)70295-X
  18. Prokopenko P., Matyushenko V., Rak A., Stepanova E., Chistyakova A., Goshina A., Kudryavtsev I., Rudenko L., Isakova-Sivak I. Truncation of NS1 Protein Enhances T Cell-Mediated Cross-Protection of a Live Attenuated Influenza Vaccine Virus Expressing Wild-Type Nucleoprotein. Vaccines, 2023, vol. 11, no. 3: 501. doi: 10.3390/vaccines11030501
  19. Rak A., Isakova-Sivak I., Rudenko L. Nucleoprotein as a Promising Antigen for Broadly Protective Influenza Vaccines. Vaccines, 2023, vol. 11, no. 12: 1747. doi: 10.3390/vaccines11121747
  20. Reed L.J., Muench H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Epidemiol., 1938, vol. 27, no. 3, pp. 493–497. doi: 10.1093/oxfordjournals.aje.a118408
  21. Rekstin A., Isakova-Sivak I., Petukhova G., Korenkov D., Losev I., Smolonogina T., Tretiak T., Donina S., Shcherbik S., Bousse T., Rudenko L. Immunogenicity and Cross Protection in Mice Afforded by Pandemic H1N1 Live Attenuated Influenza Vaccine Containing Wild-Type Nucleoprotein. Biomed. Res. Int., 2017, vol. 2017: 9359276. doi: 10.1155/2017/9359276
  22. Schmidt A., Lapuente D. T Cell Immunity against Influenza: The Long Way from Animal Models Towards a Real-Life Universal Flu Vaccine. Viruses, 2021, vol. 13, no. 2: 199. doi: 10.3390/v13020199
  23. Skon C.N., Lee J.-Y., Anderson K.G., Masopust D., Hogquist K.A., Jameson S.C. Transcriptional downregulation of S1pr1 is required for the establishment of resident memory CD8+ T cells. Nat. Immunol., 2013, vol. 14, no. 12, pp. 1285–1293. doi: 10.1038/ni.2745
  24. Szabo P.A., Miron M., Farber D.L. Location, location, location: Tissue resident memory T cells in mice and humans. Sci. Immunol., 2019, vol. 4, no. 34. doi: 10.1126/sciimmunol.aas9673
  25. Takamura S. Persistence in Temporary Lung Niches: A Survival Strategy of Lung-Resident Memory CD8(+) T Cells. Viral Immunol., 2017, vol. 30, no. 6, pp. 438–450. doi: 10.1089/vim.2017.0016
  26. Topham D.J., Reilly E.C. Tissue-Resident Memory CD8(+) T Cells: From Phenotype to Function. Front. Immunol., 2018, vol. 9: 515. doi: 10.3389/fimmu.2018.00515
  27. Vanderven H.A., Ana-Sosa-Batiz F., Jegaskanda S., Rockman S., Laurie K., Barr I., Chen W., Wines B., Hogarth P.M., Lambe T., Gilbert S.C., Parsons M.S., Kent S.J. What Lies Beneath: Antibody Dependent Natural Killer Cell Activation by Antibodies to Internal Influenza Virus Proteins. EBioMedicine, 2016, vol. 8, pp. 277–290. doi: 10.1016/j.ebiom.2016.04.029
  28. Virelizier J.L., Allison A.C., Oxford J.S., Schild G.C. Early presence of ribonucleoprotein antigen on surface of influenza virus-infected cells. Nature, 1977, vol. 266, no. 5597, pp. 52–54. doi: 10.1038/266052a0
  29. Wang W.C., Sayedahmed E.E., Sambhara S., Mittal S.K. Progress towards the development of a universal influenza vaccine. Viruses, 2022, vol. 14, no. 8: 1684. doi: 10.3390/v14081684
  30. Wheelock E.F. Interferon-Like Virus-Inhibitor Induced in Human Leukocytes by Phytohemagglutinin. Science, 1965, vol. 149, no. 3681, pp. 310–311. doi: 10.1126/science.149.3681.310
  31. Zhong W., Liu F., Dong L., Lu X., Hancock K., Reinherz E.L., Katz J.M., Sambhara S. Significant impact of sequence variations in the nucleoprotein on CD8 T cell-mediated cross-protection against influenza A virus infections. PLoS One, 2010, vol. 5, no. 5: e10583. doi: 10.1371/journal.pone.0010583

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рисунок 1. Выявление вирусспецифических IgG-антител в сыворотках крови мышей, иммунизированных двукратно вакцинными штаммами ЖГВ 6:2 и ЖГВ 5:3. Примечания. Уровни антител выявлялись в иммуноферментном анализе с использованием цельного вируса A/Гуандун-Маонань/SWL1536/2019 (H1N1). А. Средние значения оптической плотности в лунках при каждом разведении сывороток. Б. Значения титров антител в каждой исследуемой группе. Сравнение данных проводилось с использованием дисперсионного анализа ANOVA с поправкой Тьюки (*p < 0,05; ****р < 0,0001).

Скачать (134KB)
Метаданные
3. Рисунок 2. Индукция системного Т-клеточного ответа в ответ на иммунизацию вакцинными штаммами ЖГВ 6:2 и ЖГВ 5:3. Примечания. А. Репрезентативные дот-плот графики данных проточной цитометрии спленоцитов мышей после стимуляции цельным вирусом H1N1/wt. Б. Уровни цитокин-продуцирующих CD4+ Т-клеток среди популяции эффекторной памяти (CD44+СD62L–). В. Уровни цитокин-продуцирующих CD8+ Т-клеток среди популяции эффекторной памяти (CD44+СD62L–). Представлены субпопуляции ТЕМ, продуцирующие IFNγ (слева), IFNγ и TNFα (посередине), и IFNγ, TNFα и IL-2 (справа) в ответ на двукратную вакцинацию. * р < 0,05, ** р < 0,01.

Скачать (349KB)
Метаданные
4. Рисунок 3. Уровни тканерезидентных CD4+ (верхняя панель) и CD8+ (нижняя панель) Т-клеток памяти у мышей, иммунизированных ЖГВ 6:2 и ЖГВ 5:3, а также получивших препарат плацебо (ФСБ). Примечания. Количество клеток, экспрессирующих IFNγ среди популяции CD4+ (А) и CD8+ (Г) Т-клеток эффекторной памяти (СD44+CD62L–) в образцах легких иммунизированных мышей. Второй столбец: представлена доля CD69+ клеток среди соответствующих популяций (Б, Д). Третий столбец: доля СD69+CD103+ клеток (В, Е). Достоверные различия между группами (критерий Манна–Уитни) показаны на рисунках, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Скачать (174KB)
Метаданные

© Прокопенко П.И., Степанова Е.А., Матюшенко В.А., Чистякова А.К., Костромитина А.Д., Котомина Т.С., Рак А.Я., Рубинштейн А.А., Кудрявцев И.В., Новицкая В.В., Руденко Л.Г., Исакова-Сивак И.Н., 2024

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 64788 от 02.02.2016.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах