Russian Journal of Infection and ImmunityRussian Journal of Infection and ImmunityИнфекция и иммунитет2220-76192313-7398SPb RAACI1759010.15789/2220-7619-EIV-17590ORIGINAL ARTICLESОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИResearch ArticleEpidemic influenza virus nucleoprotein gene incorporated into vaccine influenza virus strain genome to optimize systemic and local T-cell immune response against live attenuated influenza vaccineОптимизация системного и локального Т-клеточного иммунного ответа на живую гриппозную вакцину при включении в состав вакцинного штамма гена нуклеопротеина от эпидемического вируса гриппаProkopenkoP. I.ПрокопенкоП. И.
Russian Federation

Junior Researcher, A.A. Smorodintsev Department of Virology

младший научный сотрудник отдела вирусологии им. А.А. Смородинцева

pi.prokopenko@gmail.comStepanovaE. A.СтепановаЕ. А.
Russian Federation

PhD (Biology), Leading Researcher, A.A. Smorodintsev Department of Virology

к.б.н., ведущий научный сотрудник отдела вирусологии им. А.А. Смородинцева

pi.prokopenko@gmail.comMatyushenkoV. A.МатюшенкоВ. А.
Russian Federation

Researcher, A.A. Smorodintsev Department of Virology

научный сотрудник отдела вирусологии им. А.А. Смородинцева

pi.prokopenko@gmail.comChistyakovaA. K.ЧистяковаА. К.
Russian Federation

Research Laboratory Assistant, A.A. Smorodintsev Department of Virology

лаборант-исследователь отдела вирусологии им. А.А. Смородинцева

pi.prokopenko@gmail.comKostromitinaA. D.КостромитинаА. Д.
Russian Federation

Research Laboratory Assistant, A.A. Smorodintsev Department of Virology

лаборант-исследователь отдела вирусологии им. А.А. Смородинцева

pi.prokopenko@gmail.comKotominaT. S.КотоминаТ. С.
Russian Federation

Researcher, A.A. Smorodintsev Department of Virology

научный сотрудник отдела вирусологии им. А.А. Смородинцева

pi.prokopenko@gmail.comRakA. Ya.РакА. Я.
Russian Federation

PhD (Biology), Senior Researcher, A.A. Smorodintsev Department of Virology

к.б.н., старший научный сотрудник отдела вирусологии им. А.А. Смородинцева

pi.prokopenko@gmail.comRubinsteinA. A.РубинштейнА. А.
Russian Federation

Junior Researcher, Cell Immunology Laboratory, Department of Immunology

младший научный сотрудник лаборатории клеточной иммунологии отдела иммунологии

pi.prokopenko@gmail.comKudryavtsevI. V.КудрявцевИ. В.
Russian Federation

PhD (Biology), Head of the Cell Immunology Laboratory, Department of Immunology

к.б.н., зав. лабораторией клеточной иммунологии отдела иммунологии

pi.prokopenko@gmail.comNovitskayaV. V.НовицкаяВ. В.
Russian Federation

Research Laboratory Assistant, A.A. Smorodintsev Department of Virology

лаборант-исследователь отдела вирусологии им. А.А. Смородинцева

pi.prokopenko@gmail.comRudenkoL. G.РуденкоЛ. Г.
Russian Federation

DSc (Medicine), Professor, Head of A.A. Smorodintsev Department of Virology

д.м.н., профессор, зав. отделом вирусологии им. А.А. Смородинцева

pi.prokopenko@gmail.comIsakova-SivakI. N.Исакова-СивакИ. Н.
Russian Federation

RAS Corresponding Member, DSc (Biology), Head of the Laboratory of Immunology and Prevention of Viral Infections, A.A. Smorodintsev Department of Virology

член-корреспондент РАН, д.б.н., зав. лабораторией иммунологии и профилактики вирусных инфекций отдела вирусологии им. А.А. Смородинцева

pi.prokopenko@gmail.comInstitute of Experimental MedicineФГБНУ Институт экспериментальной медицины25032024050620241423713800102202421032024Copyright ©; 2024, Prokopenko P.I., Stepanova E.A., Matyushenko V.A., Chistyakova A.K., Kostromitina A.D., Kotomina T.S., Rak A.Y., Rubinstein A.A., Kudryavtsev I.V., Novitskaya V.V., Rudenko L.G., Isakova-Sivak I.N.Copyright ©; 2024, Прокопенко П.И., Степанова Е.А., Матюшенко В.А., Чистякова А.К., Костромитина А.Д., Котомина Т.С., Рак А.Я., Рубинштейн А.А., Кудрявцев И.В., Новицкая В.В., Руденко Л.Г., Исакова-Сивак И.Н.2024Prokopenko P.I., Stepanova E.A., Matyushenko V.A., Chistyakova A.K., Kostromitina A.D., Kotomina T.S., Rak A.Y., Rubinstein A.A., Kudryavtsev I.V., Novitskaya V.V., Rudenko L.G., Isakova-Sivak I.N.Прокопенко П.И., Степанова Е.А., Матюшенко В.А., Чистякова А.К., Костромитина А.Д., Котомина Т.С., Рак А.Я., Рубинштейн А.А., Кудрявцев И.В., Новицкая В.В., Руденко Л.Г., Исакова-Сивак И.Н.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://iimmun.ru/iimm/article/view/17590

Introduction. Optimization of the vaccine-induced T-cell repertoire is one of the strategies to expand the spectrum of protective potential for live attenuated influenza vaccine (LAIV). LAIV cross-protective properties can be improved by introducing the nucleoprotein (NP) gene derived from epidemic parental virus into vaccine strain genome, i.e. by replacing the classical 6:2 genome formula with 5:3. The main objective of the present study was to detail evaluation for virus-specific systemic and tissue-resident memory T-cells subsets in mice immunized with seasonal H1N1 LAIV of the genome formula 6:2 and 5:3. Materials and methods. Two H1N1 LAIV strains with varying NP genes (LAIV 6:2 and LAIV 5:3) were generated using reverse genetics techniques. C57BL/6J mice were immunized intranasally with the vaccine candidates, twice, 3 weeks apart. Cells from the spleen and lung tissues were isolated 7 days after booster immunization to be stimulated with whole H1N1 influenza virus for assessing cytokine-producing memory CD44+CD62L– T-cells as well as expression of CD69 and CD103 surface markers using flow cytometry. Humoral murine serum immunity against H1N1 virus was assessed by ELISA. Results. The LAIV 5:3 vs classical 6:2 vaccine strain carrying the epidemic parental NP gene induced significantly more pronounced humoral immune response against recent influenza virus. The group of mice immunized with LAIV 5:3 demonstrated higher levels of virus-specific CD4+ and CD8+ effector memory T cells (TEM) in the spleen, including a subset of polyfunctional (IFNγ+TNFα+IL-2+) CD4+ TEM, compared to LAIV 6:2 group. Virus-specific memory T cell levels in lung tissues after immunization with LAIV 5:3 vs LAIV 6:2 also tended to increase, but no significant difference in stimulated tissue-resident CD69+CD103– and CD69+CD103+ T cells between the groups were found. Conclusion. Modification of the seasonal LAIV strain genome for updating its epitope composition allowed to enhance the virus-specific T-cell immune response both at systemic level and in lung tissues, thereby shoeing that the effectiveness of the vaccine against circulating influenza viruses can be potentially increased.

Введение. Оптимизация поствакцинального репертуара Т-клеток — один из способов расширения спектра защитного потенциала живой гриппозной вакцины (ЖГВ). Улучшить кросс-протективные свойства ЖГВ можно путем внесения в состав генома вакцинного штамма гена нуклеопротеина (NP) от эпидемического родительского вируса, то есть при замене классической формулы генома 6:2 на 5:3. Ранее на примере вирусов гриппа H1N1, H3N2 и H7N9 было показано, что вакцинные штаммы ЖГВ 5:3 стимулируют более выраженный Т-клеточный ответ к эпитопам NP эпидемического родительского вируса, чем классические варианты ЖГВ 6:2. Основной целью настоящего исследования явилась детальная оценка субпопуляций вирусспецифических системных и тканерезидентных Т-клеток памяти у мышей, иммунизированных штаммами сезонной ЖГВ подтипа H1N1 с формулами генома 6:2 и 5:3. Материалы и методы. Методами обратной генетики были сконструированы вакцинные штаммы ЖГВ подтипа H1N1, отличающихся источником гена NP (ЖГВ 6:2 и ЖГВ 5:3). Мышей линии C57BL/6J иммунизировали интраназально вакцинными кандидатами, двукратно с трехнедельным интервалом. Через 7 дней после повторной иммунизации у мышей выделяли клетки из тканей селезенки и легких, стимулировали цельным вирусом гриппа H1N1 и оценивали уровни цитокин-продуцирующих Т-клеток памяти с фенотипом CD44+CD62L– методами проточной цитометрии. Для клеток, выделенных из легких, также определяли экспрессию поверхностных маркеров CD69 и CD103. Гуморальный иммунитет к вирусу H1N1 оценивали в иммуноферментном анализе сывороток крови мышей, собранных через 3 недели после повторной иммунизации. Результаты. Вакцинный штамм ЖГВ 5:3, несущий NP ген от эпидемического родителя, индуцировал достоверно более выраженный гуморальный иммунный ответ к актуальному вирусу гриппа, чем классический вариант ЖГВ 6:2. В группе мышей, привитых ЖГВ 5:3, наблюдались более высокие уровни вирусспецифических CD4+ и CD8+ Т-клеток эффекторной памяти (ТЕМ) в селезенках мышей, включая субпопуляцию полифункциональных (IFNγ+TNFα+IL-2+) CD4+ ТЕМ, по сравнению с группой ЖГВ 6:2. Также наблюдалась тенденция к выработке более высоких уровней вирусспецифических Т-клеток памяти в тканях легких при иммунизации ЖГВ 5:3 в сравнении с ЖГВ 6:2, однако достоверной разницы в стимуляции тканерезидентных Т-клеток с фенотипами CD69+CD103– и CD69+CD103+ между группами не наблюдалось. Заключение. Получены дополнительные экспериментальные свидетельства перспективности модификации генома вакцинного штамма сезонной живой гриппозной вакцины с целью актуализации эпитопного состава вакцинных вирусов, поскольку такая модификация усиливает вирусспецифический Т-клеточный иммунный ответ как на системном уровне, так и в тканях легких, что в итоге может повысить эффективность вакцины в отношении циркулирующих вирусов гриппа.

influenza viruslive influenza vaccinenucleoproteinhumoral immunityIgGeffector memoryTEMtissue-resident memory T cellsTRMвирус гриппаживая гриппозная вакцинануклеопротеингуморальный иммунитетIgGэффекторная памятьTEMтканерезидентные Т-клетки памятиTRMМинобрнаукиMinistry of Education and Science projectFGWG-2022-0001Bodewes R., Geelhoed-Mieras M.M., Wrammert J., Ahmed R., Wilson P.C., Fouchier R.A., Osterhaus A.D., Rimmelzwaan G.F. In vitro assessment of the immunological significance of a human monoclonal antibody directed to the influenza a virus nucleoprotein. Clin. Vaccine Immunol., 2013, vol. 20, no. 8, pp. 1333–1337. doi: 10.1128/CVI.00339-13Burel J.G., Apte S.H., Groves P.L., McCarthy J.S., Doolan D.L. Polyfunctional and IFN-γ monofunctional human CD4(+) T cell populations are molecularly distinct. JCI Insight, 2017, vol. 2, no 3: e87499. doi: 10.1172/jci.insight.87499Cibrian D., Sanchez-Madrid F. CD69: from activation marker to metabolic gatekeeper. Eur. J. Immunol., 2017, vol. 47, no. 6, pp. 946–953. doi: 10.1002/eji.201646837Deiss R.G., Arnold J.C., Chen W.J., Echols S., Fairchok M.P., Schofield C., Danaher P.J., McDonough E., Ridore M., Mor D., Burgess T.H., Millar E.V. Vaccine-associated reduction in symptom severity among patients with influenza A/H3N2 disease. Vaccine, 2015, vol. 33, no. 51, pp. 7160–7167. doi: 10.1016/j.vaccine.2015.11.004Flynn J.A., Weber T., Cejas P.J., Cox K.S., Touch S., Austin L.A., Ou Y., Citron M.P., Luo B., Gindy M.E., Bahl K., Ciaramella G., Espeseth A.S., Zhang L. Characterization of humoral and cell-mediated immunity induced by mRNA vaccines expressing influenza hemagglutinin stem and nucleoprotein in mice and nonhuman primates. Vaccine, 2022, vol. 40, no. 32, pp. 4412–4423. doi: 10.1016/j.vaccine.2022.03.063Godoy P., Romero A., Soldevila N., Torner N., Jane M., Martinez A., Cayla J.A., Rius C., Dominguez A., Working Group on Surveillance of Severe Influenza Hospitalized Cases in C. Influenza vaccine effectiveness in reducing severe outcomes over six influenza seasons, a case-case analysis, Spain, 2010/11 to 2015/16. Euro Surveill., 2018, vol. 23, no. 43. doi: 10.2807/1560-7917.ES.2018.23.43.1700732Isakova-Sivak I., Stepanova E., Mezhenskaya D., Matyushenko V., Prokopenko P., Sychev I., Wong P.F., Rudenko L. Influenza vaccine: progress in a vaccine that elicits a broad immune response. Expert Rev. Vaccines, 2021, vol. 20, no. 9, pp. 1097–1112. doi: 10.1016/j.virol.2016.10.027Isakova-Sivak I., Korenkov D., Smolonogina T., Tretiak T., Donina S., Rekstin A., Naykhin A., Shcherbik S., Pearce N., Chen L.M., Bousse T., Rudenko L. Comparative studies of infectivity, immunogenicity and cross-protective efficacy of live attenuated influenza vaccines containing nucleoprotein from cold-adapted or wild-type influenza virus in a mouse model. Virology, 2017, vol. 500, pp. 209–217. doi: 10.1080/14760584.2021.1964961Iuliano A.D., Roguski K.M., Chang H.H., Muscatello D.J., Palekar R., Tempia S., Cohen C., Gran J.M., Schanzer D., Cowling B.J., Wu P., Kyncl J., Ang L.W., Park M., Redlberger-Fritz M., Yu H., Espenhain L., Krishnan A., Emukule G., van Asten L., Pereira da Silva S., Aungkulanon S., Buchholz U., Widdowson M.A., Bresee J.S. Global Seasonal Influenza-associated Mortality Collaborator Network. Estimates of global seasonal influenza-associated respiratory mortality: a modelling study. Lancet, 2018, vol. 391, no. 10127, pp. 1285–1300. doi: 10.1016/S0140-6736(17)33293-2Jegaskanda S., Co M.D.T., Cruz J., Subbarao K., Ennis F.A., Terajima M. Induction of H7N9-Cross-Reactive Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Antibodies by Human Seasonal Influenza A Viruses that are Directed Toward the Nucleoprotein. J. Infect. Dis., 2017, vol. 215, no. 5, pp. 818–823. doi: 10.1093/infdis/jiw629Kang S., Brown H.M., Hwang S. Direct Antiviral Mechanisms of Interferon-Gamma. Immune Netw, 2018, vol. 18, no. 5: e33. doi: 10.4110/in.2018.18.e33Korenkov D.A., Laurie K.L., Reading P.C., Carolan L.A., Chan K.F., Isakova-Sivak I.I., Smolonogina T.A., Subbarao K., Barr I.G., Villanueva J., Shcherbik S., Bousse T., Rudenko L.G. Safety, immunogenicity and protection of A(H3N2) live attenuated influenza vaccines containing wild-type nucleoprotein in a ferret model. Infect. Genet. Evol., 2018, vol. 64, pp. 95–104. doi: 10.1016/j.meegid.2018.06.019Lee Y.-T., Suarez-Ramirez J.E., Wu T., Redman J.M., Bouchard K., Hadley G.A., Cauley L.S. Environmental and antigen receptor-derived signals support sustained surveillance of the lungs by pathogen-specific cytotoxic T lymphocytes. J. Virol., 2011, vol. 85, no. 9, pp. 4085–4094. doi: 10.1128/JVI.02493-10Mackay L.K., Braun A., Macleod B.L., Collins N., Tebartz C., Bedoui S., Carbone F.R., Gebhardt T. Cutting edge: CD69 interference with sphingosine-1-phosphate receptor function regulates peripheral T cell retention. J. Immunol., 2015, vol. 194, no. 5, pp. 2059–2063. doi: 10.4049/jimmunol.1402256Makedonas G., Betts M.R. Polyfunctional analysis of human t cell responses: importance in vaccine immunogenicity and natural infection. Springer Semin. Immunopathol., 2006, vol. 28, no. 3, pp. 209–219. doi: 10.1007/s00281-006-0025-4Okoli G.N., Racovitan F., Abdulwahid T., Hyder S.K., Lansbury L., Righolt C.H., Mahmud S.M., Nguyen-Van-Tam J.S. Decline in Seasonal Influenza Vaccine Effectiveness With Vaccination Program Maturation: A Systematic Review and Meta-analysis. Open Forum Infect. Dis., 2021, vol. 8, no. 3: ofab069. doi: 10.1093/ofid/ofab069Osterholm M.T., Kelley N.S., Sommer A., Belongia E.A. Efficacy and effectiveness of influenza vaccines: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect. Dis., 2012, vol. 12, no. 1, pp. 36–44. doi: 10.1016/S1473-3099(11)70295-XProkopenko P., Matyushenko V., Rak A., Stepanova E., Chistyakova A., Goshina A., Kudryavtsev I., Rudenko L., Isakova-Sivak I. Truncation of NS1 Protein Enhances T Cell-Mediated Cross-Protection of a Live Attenuated Influenza Vaccine Virus Expressing Wild-Type Nucleoprotein. Vaccines, 2023, vol. 11, no. 3: 501. doi: 10.3390/vaccines11030501Rak A., Isakova-Sivak I., Rudenko L. Nucleoprotein as a Promising Antigen for Broadly Protective Influenza Vaccines. Vaccines, 2023, vol. 11, no. 12: 1747. doi: 10.3390/vaccines11121747Reed L.J., Muench H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Epidemiol., 1938, vol. 27, no. 3, pp. 493–497. doi: 10.1093/oxfordjournals.aje.a118408Rekstin A., Isakova-Sivak I., Petukhova G., Korenkov D., Losev I., Smolonogina T., Tretiak T., Donina S., Shcherbik S., Bousse T., Rudenko L. Immunogenicity and Cross Protection in Mice Afforded by Pandemic H1N1 Live Attenuated Influenza Vaccine Containing Wild-Type Nucleoprotein. Biomed. Res. Int., 2017, vol. 2017: 9359276. doi: 10.1155/2017/9359276Schmidt A., Lapuente D. T Cell Immunity against Influenza: The Long Way from Animal Models Towards a Real-Life Universal Flu Vaccine. Viruses, 2021, vol. 13, no. 2: 199. doi: 10.3390/v13020199Skon C.N., Lee J.-Y., Anderson K.G., Masopust D., Hogquist K.A., Jameson S.C. Transcriptional downregulation of S1pr1 is required for the establishment of resident memory CD8+ T cells. Nat. Immunol., 2013, vol. 14, no. 12, pp. 1285–1293. doi: 10.1038/ni.2745Szabo P.A., Miron M., Farber D.L. Location, location, location: Tissue resident memory T cells in mice and humans. Sci. Immunol., 2019, vol. 4, no. 34. doi: 10.1126/sciimmunol.aas9673Takamura S. Persistence in Temporary Lung Niches: A Survival Strategy of Lung-Resident Memory CD8(+) T Cells. Viral Immunol., 2017, vol. 30, no. 6, pp. 438–450. doi: 10.1089/vim.2017.0016Topham D.J., Reilly E.C. Tissue-Resident Memory CD8(+) T Cells: From Phenotype to Function. Front. Immunol., 2018, vol. 9: 515. doi: 10.3389/fimmu.2018.00515Vanderven H.A., Ana-Sosa-Batiz F., Jegaskanda S., Rockman S., Laurie K., Barr I., Chen W., Wines B., Hogarth P.M., Lambe T., Gilbert S.C., Parsons M.S., Kent S.J. What Lies Beneath: Antibody Dependent Natural Killer Cell Activation by Antibodies to Internal Influenza Virus Proteins. EBioMedicine, 2016, vol. 8, pp. 277–290. doi: 10.1016/j.ebiom.2016.04.029Virelizier J.L., Allison A.C., Oxford J.S., Schild G.C. Early presence of ribonucleoprotein antigen on surface of influenza virus-infected cells. Nature, 1977, vol. 266, no. 5597, pp. 52–54. doi: 10.1038/266052a0Wang W.C., Sayedahmed E.E., Sambhara S., Mittal S.K. Progress towards the development of a universal influenza vaccine. Viruses, 2022, vol. 14, no. 8: 1684. doi: 10.3390/v14081684Wheelock E.F. Interferon-Like Virus-Inhibitor Induced in Human Leukocytes by Phytohemagglutinin. Science, 1965, vol. 149, no. 3681, pp. 310–311. doi: 10.1126/science.149.3681.310Zhong W., Liu F., Dong L., Lu X., Hancock K., Reinherz E.L., Katz J.M., Sambhara S. Significant impact of sequence variations in the nucleoprotein on CD8 T cell-mediated cross-protection against influenza A virus infections. PLoS One, 2010, vol. 5, no. 5: e10583. doi: 10.1371/journal.pone.0010583