Markers of CD4⁺ AND CD8⁺ T-cell exhaustion in hiv/hcv coinfected immunological non-responders to antiretroviral therapy

Full Text

Введение

У 10–40% ВИЧ-инфицированных больных, получающих антиретровирусную терапию (АРТ), снижение вирусной нагрузки ВИЧ не сопровождается приростом численности CD4⁺ Т-лимфоцитов [12]. У этих пациентов, известных как «иммунологические неответчики» (ИН), глубокая хроническая лимфопения увеличивает риск развития СПИД-ассоциированных заболеваний и госпитализации, приводит к ранней утрате трудоспособности и инвалидизации, грозит преждевременной смертью [8].

Причины нарушения регенерации CD4⁺ Т-клеток у получающих лечение ВИЧ-инфи цированных лиц остаются не до конца понятными. Известно, что коинфекция вирусом гепатита С (ВГС) является значимым фактором риска развития этого феномена. Так, иммунологический неответ на АРТ встречается в 3,5 раза чаще у ВИЧ/ВГС коинфицированных больных, чем у пациентов без ВГС коинфекции [7].

Ранее мы показали, что у ВИЧ/ВГС коинфицированных субъектов пул периферических Т-лимфоцитов насыщен клетками, экспрессирующими ингибиторные рецепторы [10]. Их наличие на Т-лимфоцитах тесно связано с функциональным истощением [6]. Для истощенных Т-клеток характерна потеря способности к продукции цитокинов и пролиферации [11], что может объяснить низкую регенераторную способность лимфоцитов. Следует отметить, что у ВИЧ/ВГС коинфицированных больных фенотипические признаки истощения в виде экспрессии ингибиторных рецепторов на поверхности демонстрируют и CD4⁺, и CD8⁺ Т-клетки. Однако, в отличие от CD4⁺ Т-лимфоцитов, пул CD8⁺ Т-клеток увеличивается в размере на фоне коинфекции ВГС [2]. При иммунологическом неответе на АРТ количество CD8⁺ Т-лимфоцитов также не снижается [2]. Очевидно, что истощенный фенотип клеток не в полной мере отражает их функциональное состояние. Для понимания роли истощения в нарушении регенерации Т-клеток у ВИЧ/ВГС коинфицированных ИН необходимо исследовать не только фенотип Т-лимфоцитов, но и их способность к пролиферации и продукции цитокинов.

Целью настоящей работы было определение показателей функционального истощения CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитов у ВИЧ/ВГС коинфицированных иммунологических неответчиков на АРТ.

Проведение исследования было одобрено этическим комитетом Пермского краевого центра по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями (рег. № комитета IRB00008964). Каждый участник подписал информированное согласие. Включенные в исследование пациенты соответствовали следующим требованиям: подтвержденные диагнозы ВИЧ и ВГС инфекций, приверженность АРТ в течение двух и более лет, вирусная нагрузка ВИЧ менее 250 копий/мл (предел чувствительности тест-систем), отсутствие лечения интерферонами или анти-ВГС препаратами прямого действия.

Были сформированы три клинические группы:

• ВИЧ/ВГС коинфицированные иммунологические неответчики (ИН; n = 9) с числом CD4⁺ Т-лимфоцитов менее 350/мкл крови;
• ВИЧ/ВГС коинфицированные иммунологические ответчики (ИО; n = 9) с числом CD4⁺ Т-клеток более 500/мкл крови.
• относительно здоровые добровольцы (К; n = 9) без ВИЧ и ВГС инфекций.

Кровь объемом до 30 мл забирали натощак из кубитальной вены в вакуумные пробирки, содержащие литий гепарин (Weihai Hongyu Medical Devices Cj., Ltd., Китай).

Мононуклеарные клетки выделяли путем центрифугирования двукратно разведенной фосфатно-солевым буферным раствором Дульбекко (DPBS, Gibco; США) крови в градиенте плотности Диаколла (1,077 г/мл, Диаэм; Россия). Выделенные клетки собирали, дважды отмывали раствором DPBS, подсчитывали в камере Горяева, после чего подвергали контролируемому замораживанию в жидком азоте в среде, содержащей 90% термоинактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС, Gibco, Колумбия) и 10% диметилсульфоксида (AppliChem, Германия). Перед проведением исследования клетки размораживали.

Для фенотипического анализа истощенных клеток образцы окрашивали витальным красителем Zombie UV (Biolegend, США) и коктейлем анти-CD3-BV605, анти-CD4-PE, анти-CD8-BV510 и анти-PD1-PB антител (Biolegend, США). Окрашенные клетки анализировали с использованием проточного цитофлюориметра CytoFLEX S (Beckman Coulter, США).

Для определения продуктивности деления стимулированных Т-лимфоцитов образцы окрашивали 5 мкМ 5,6-карбоксифлуоресцеина диацетат-N-сукцинимидилового эфира (CFSE; Biolegend, США), дважды отмывали средой RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, США), содержащей 20% ЭТС, и затем стимулировали фитогемагглютинином (ФГА, Serva, Германия) в конечной концентрации 15 мкг/мл. Лейкоциты культивировали в полной питательной среде (ППС), содержащей RPMI-1640, 10% ЭТС, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Thermo Fisher Scientific, Inc., США), в течение 7 суток (+37°С, 5% СО₂) с заменой культуральной среды на 3–4 сутки. По окончании времени инкубации клетки собирали и окрашивали анти-CD3-BV605, анти-CD4-PE и анти-CD8-BV510 антителами (Biolegend, США) и витальным красителем Zombie UV (Biolegend, США). Лейкоциты гейтировали согласно логике, представленной на рис. 1.

 

Рисунок 1. Логика гейтирования лейкоцитов при определении жизнеспособности делящихся Т-клеток

Figure 1. Leukocyte gating logic for assessing the viability of dividing T-cells

Примечание. А — выделение CD3⁺ Т-клеток; Б — разделение Т-клеток на субпопуляции CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитов; В — установка гейта в нестимулированном образце; Г — анализ единовременного окрашивания витальным красителем Zombie UV и трекинговым красителем CFSE стимулированного образца. Представлены типовые диаграммы светорассеяния.

Note. A — isolation of CD3⁺ T-cells; B — division of T-cells into CD4⁺ and CD8⁺ T-lymphocyte subsets; C — setting the gate in the unstimulated sample; D — analysis of stimulated cells stained with vital dye Zombie UV and tracking dye CFSE. Typical light scattering diagrams are presented.

 

Для определения цитокин-продуцирующей способности Т-лимфоцитов из образцов выделяли CD4⁺ и CD8⁺ Т-клетки. Негативную селекцию проводили с использованием коммерчес ких наборов Dynabeads Untouched Human CD4 T cells (Invitrogen, США) и MagCellect Human CD8⁺ T Cell Isolation Kit (R&D Systems, Inc., США) согласно инструкциям производителей. Долю CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитов в пуле клеток, прошедших процедуру магнитной сепарации, оценивали на проточном цитофлюориметре CytoFLEX S с использованием моноклональных анти-CD3-PerCP, анти-CD4-BV605 и анти-CD8-APC-Fire750 антител (BioLegend, США). Чистота выделенных субпопуляций составила более 92%. Затем изолированные CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоциты стимулировали магнитными частицами Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 (Gibco, США) и культивировали в ППС, в течение 72 ч (+37°С, 5% СО₂). Контролем служили нестимулированные клетки. По истечении времени инкубации собирали супернатанты, в которых определяли концентрации интерлейкина-2 (IL-2) методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческого набора «Интерлейкин-2-ИФА-БЕСТ» (Вектор БЕСТ, Россия). Концентрацию цитокина выражали в нг/мл.

Статистический анализ и визуализацию данных проводили с помощью программного обеспечения «GraphPad Prism 8» (GraphPad Software, США). Количественные данные в тексте и таблицах представлены в виде медиан и их интерквартильных размахов; категориальные данные — в виде процентов. Для сравнения нескольких групп количественных данных использовали однофакторный дисперсионный анализ; множественные сравнения между группами проводили с помощью критерия Тьюки. Для сравнения групп категориальных данных использовали критерий согласия Пирсона (χ²). Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез приняли равным 0.05.

Группы обследованных не имели статистически значимых отличий по возрасту, полу, продолжительности ВИЧ-инфекции и АРТ, а также вирусной нагрузке ВИЧ (табл. 1). Основным отличием между группами было количество CD4⁺ Т-клеток периферической крови в момент исследования.

(

Таблица 1. Клинические характеристики ВИЧ/ВГС коинфицированных и здоровых людей

Table 1. Clinical characteristics of HIV/HCV coinfected individuals and healthy controls

Параметры/Parameters	ИН/INR	ИО/IR	К/HC
Количество обследованных, n | Number of participants, n	9	9	9
Возраст, лет | Age, years	38,0 (32,0–40,5)	36,0 (34,5–42,0)	40,0 (32,5–43,5)
Женщины, % | Women, %	22,2	44,4	44,4
Продолжительность АРТ, лет | ART duration, years	6,0 (3,5–12,5)	4,0 (3,0–7,0)	–
Коинфекция ВГС, % | HCV coinfection, %	100	100	0
Численность CD4⁺ Т-лимфоцитов, клеток/мкл CD4⁺ T-cell count, cells/ul	226 (188–303) P1–2 < 0,001 P1–3 < 0,001	538 (449–648) P2–3 < 0,05	682 (633–756)
Вирусная нагрузка ВИЧ, копий/мл | HIV viral load, copies/ml	< 250	< 250	–

Примечание. указаны медианы и интерквартильные размахи. Группы количественных данных сравнивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа; для множественных сравнений использовали критерий Тьюки. Группы категориальных данных сравнивали с помощью критерия согласия Пирсона (χ²). ВИЧ — вирус иммунодефицита человека; ВГС — вирус гепатита С; АРТ — антиретровирусная терапия; ИН — иммунологические неответчики; ИО — иммунологические ответчики; К — контроль (здоровые доноры крови).

Note. Medians and interquartile ranges are shown. Groups of quantitative data were compared using ordinary one-way ANOVA followed by Tukey’s post-hoc test. Groups of categorical data were compared using the Pearson’s chi-square test (χ²). HIV — human immunodeficiency virus; HCV — hepatitis C virus; ART — antiretroviral therapy; INR — immunological non-responders; IR — immunological responders; HC — healthy controls.

 

Фенотипический анализ лейкоцитов ex vivo показал следующее (рис. 2). При ВИЧ/ВГС коинфекции в крови пациентов повышается относительное количество CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток, экспрессирующих ингибиторные рецепторы PD-1. Величина пула PD-1-позитивных Т-лимфоцитов зависит от эффективности иммунологического ответа больных на АРТ: наиболее высокое процентное содержание CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток, экспрессирующих PD-1, было выявлено в группе ИН. Поверхностную экспрессию молекулы PD-1 принято считать одним из ключевых маркеров истощения Т-лимфоцитов, которое ассоциировано с прогрессирующей потерей Т-клетками их эффекторных функций, в том числе способности к делению, продукции цитокинов и поддержанию жизнеспособности [3, 11].

 

Рисунок 2. Процентное содержание PD-1-позитивных Т-лимфоцитов в периферической крови ВИЧ/ВГС коинфицированных больных с различной эффективностью регенерации иммунитета

Figure 2. Percentage of PD-1-positive T-lymphocytes in the peripheral blood of HIV/HCV coinfected patients with different levels of immune reconstitution efficiency

Примечание. Указаны медианы и интерквартильные размахи. ИН — иммунологические неответчики; ИО — иммунологические ответчики; К — контроль. * — p < 0,05; *** — p < 0,001 (однофакторный дисперсионный анализ с последующим сравнением с помощью критерия Тьюки).

Note. Medians and interquartile ranges are shown. INR — immunological non-responders; IR — immunological responders; HC — healthy controls. * — p < 0.05; *** — p < 0.001 (ordinary one-way ANOVA followed by Tukey’s post-hoc test).

 

На основании полученных нами результатов можно предположить наличие истощения пулов CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитов у ВИЧ/ВГС коинфицированных ИН. Вместе с тем оценка экспрессии единственного фенотипического маркера не позволяет определенно судить о функциональности Т-клеток. Молекула PD-1 временно экспрессируется на активированных лимфоцитах после получения ими сигнала через Т-клеточный рецептор [14]. Этот механизм отрицательной обратной связи защищает организм от чрезмерных и нежелательных реакций, и потому экспрессия PD-1 не может рассматриваться как однозначный признак истощения Т-лимфоцитов. Для подтверждения того, что у ИН увеличение доли PD-1-позитивных CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитов свидетельствует об их истощении, были проведены дополнительные исследования жизнеспособности и цитокинпродуцирующей активности клеток, стимулированных в условиях in vitro.

Было установлено, что у ИН среди пролиферирующих в культуре лимфоцитов значительно увеличивается доля гибнущих Т-клеток (рис. 3). Примечательно, что это было характерно для CD4⁺ Т-лимфоцитов, но не для CD8⁺ Т-клеток.

 

Рисунок 3. Склонность к гибели пролиферирующих Т-лимфоцитов ВИЧ/ВГС коинфицированных больных с различной эффективностью регенерации иммунитета

Figure 3. Susceptibility to death of proliferating T-lymphocytes in HIV/HCV coinfected patients with different levels of immune reconstitution efficiency

Примечание. Указаны медианы и интерквартильные размахи. ИН — иммунологические неответчики; ИО — иммунологические ответчики; К — контроль. * — p < 0,05 (однофакторный дисперсионный анализ с последующим сравнением с помощью критерия Тьюки).

Note. Medians and interquartile ranges are shown. INR — immunological non-responders; IR — immunological responders; HC — healthy controls. * — p < 0.05 (ordinary one-way ANOVA followed by Tukey’s post-hoc test).

 

Ранее в ходе культуральных исследований нами было установлено, что CD4⁺ Т-клетки ИН чаще, чем аналогичные лимфоциты ИО и К не запускают процесс деления после стимуляции митогенами, но остаются в состоянии покоя [1]. Более того, было показано, что у ИН CD4⁺ Т-лимфоциты, вступившие в организме в процесс гомеостатической пролиферации, оказываются неспособны завершить его с образованием дочерних клеток [13]. Такое нарушение продуктивности деления сопровождается экспрессией генов, ассоциированных с апоптозом, и, в целом, с низкой жизнеспособностью пролиферирующих лимфоцитов [9, 13]. Перечисленные исследования были проведены на клетках ВИЧ моноинфицированных пациентов. Опираясь на данные настоящей работы, можно предположить, что схожие нарушения свойственны и Т-лимфоцитам ВИЧ/ВГС коинфицированных ИН.

Мы исследовали способность CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток ВИЧ/ВГС коинфицированных пациентов с различной эффективностью регенерации иммунитета на фоне АРТ продуцировать IL-2 в ответ на стимуляцию in vitro. Оценка концентрации данного цитокина в супернатантах нестимулированных клеточных культур показала относительно невысокое его содержание, которое в среднем составило 0,012 нг/мл (0,012–0,013 нг/мл). Во всех клинических группах нестимулированные CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоциты секретировали почти одинаковое количество IL-2 (p > 0,05). На фоне стимуляции продукция данного цитокина Т-клетками увеличивалась в 1000 и более раз (p < 0,001). Во всех исследованных группах активированные CD4⁺ Т-лимфоциты являлись основными продуцентами IL-2 и по сравнению с аналогичными CD8⁺ Т-клетками секретировали больше этого цитокина (рис. 4; p < 0,001). Важно отметить, что у ИН по сравнению с ИО и К была снижена продукция IL-2 стимулированными CD4⁺ Т-клетками (p < 0,05), но не CD8⁺ Т-лимфоцитами (p > 0,05). Полученные данные свидетельствуют о том, что у ИН нарушена способность активированных CD4⁺ Т-клеток эффективно продуцировать IL-2.

 

Рисунок 4. Содержание интерлейкина-2 в супернатантах стимулированных культур CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитов ВИЧ/ВГС коинфицированных больных с различной эффективностью регенерации иммунитета

Figure 4. Interleukin-2 levels in supernatants of stimulated CD4⁺ and CD8⁺ T-lymphocyte cultures in HIV/HCV coinfected patients with different levels of immune reconstitution efficiency

Примечание. Указаны медианы и интерквартильные размахи. ИН — иммунологические неответчики; ИО — иммунологические ответчики; К — контроль. * — p < 0,05 (однофакторный дисперсионный анализ с последующим сравнением с помощью критерия Тьюки).

Note. Medians and interquartile ranges are shown. INR — immunological non-responders; IR — immunological responders; HC — healthy controls. * — p < 0.05 (ordinary one-way ANOVA followed by Tukey’s post-hoc test).

 

Ранее нами было установлено [1], что Т-лим фоциты, выделенные из периферичес кой крови ВИЧ моноинфицированных ИН и стимулированные в течение 5 сут. анти-CD3/анти-CD28 антителами, продуцируют меньше IL-2, чем Т-клетки ИО (p > 0,05) или К (p < 0,01). Снижение уровня продукции данного цитокина сопровождалось уменьшением доли CD4⁺ Т-лимфоцитов, поделившихся под действием стимулирующего агента. Опираясь на данные литературы о том, что аутокринное и паракринное действие IL-2, синтезируемого Т-клетками, необходимо для выполнения ими эффекторных функций таких как деление [5], мы предположили, что CD4⁺ Т-лимфоциты ИН снижают пролиферативную активность из-за дефицита IL-2. Однако на тот момент нам не удалось выявить субпопуляцию Т-клеток, в которой происходит нарушение продукции данного цитокина. В настоящем исследовании мы показали, что у ВИЧ/ВГС коинфицированных ИН продукция IL-2 снижена именно в активированных CD4⁺ Т-клетках.

Истощение Т-лимфоцитов является препятствием в борьбе с хроническими заболевания ми, такими как ВИЧ-инфекция и гепатит С. Истощенные Т-клетки не могут эффективно бороться с вирусами, что способствует ускоренному развитию СПИД. Восстановление функциональности Т-клеток путем подавления экспрессии ингибиторных рецепторов и блокирования соответствующих сигнальных путей может быть перспективным методом терапии [4]. Однако необходимо убедиться, что клетки-мишени действительно истощены. В настоящем исследовании мы установили, что по сравнению с ИО и К среди периферических CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитов ВИЧ/ВГС коинфицированных ИН увеличена доля клеток с фенотипом, характерным для истощения. В то же время мы показали, что только у ИН делящиеся CD4⁺, но не CD8⁺ Т-клетки, характеризуются сниженной жизнеспособностью и цитокин-продуцирующей активностью. Таким образом, у ВИЧ/ВГС коинфицированных ИН CD4⁺ Т-лимфоциты демонстрируют признаки фенотипического и функционального истощения, тогда как CD8⁺ Т-клетки, хотя и экспрессируют ингибиторные рецепторы, не проявляют признаков функциональных нарушений. По-видимому, разработка специализированной терапии ВИЧ/ВГС коинфицированных ИН должна быть сосредоточена на восстановлении функциональной активности CD4⁺ Т-лимфоцитов.

About the authors

Evgeniya V. Saidakova

Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Perm Federal Research Center of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: radimira@list.ru

DSc (Biology), Associate Professor, Head of the Laboratory of Molecular Immunology

Russian Federation, 614081, Perm, Goleva str., 13

L. B. Korolevskaya

Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Perm Federal Research Center of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: radimira@list.ru

PhD (Medicine), Researcher, Laboratory of Ecological Immunology

Russian Federation, 614081, Perm, Goleva str., 13

V. V. Vlasova

Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Perm Federal Research Center of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: radimira@list.ru

Junior Researcher, Laboratory of Molecular Immunology

Russian Federation, 614081, Perm, Goleva str., 13

N. G. Shmagel

Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Perm Federal Research Center of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: radimira@list.ru

DSc (Medicine), Senior Researcher, Laboratory of Ecological Immunology

Russian Federation, 614081, Perm, Goleva str., 13

K. V. Shmagel

Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Perm Federal Research Center of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: radimira@list.ru

DSc (Medicine), Head of the Laboratory of Ecological Immunology

Russian Federation, 614081, Perm, Goleva str., 13

References

Supplementary files