Markers of CD4⁺ AND CD8⁺ T-cell exhaustion in hiv/hcv coinfected immunological non-responders to antiretroviral therapy

Evgeniya V. Saidakova; Сайдакова Евгения Владимировна; L. B. Korolevskaya; Королевская Л. Б.; V. V. Vlasova; Власова В. В.; N. G. Shmagel; Шмагель Н. Г.; K. V. Shmagel; Шмагель К. В.

doi:10.15789/2220-7619-MIC-16641

Признаки функционального истощения CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток у ВИЧ/ВГС коинфицированных иммунологических неответчиков на антиретровирусную терапию

Авторы: Сайдакова Е.В.¹, Королевская Л.Б.¹, Власова В.В.¹, Шмагель Н.Г.¹, Шмагель К.В.¹
Учреждения:
1. «Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук» — филиал ФГБУН Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук
Выпуск: Том 14, № 3 (2024)
Страницы: 586-592
Раздел: КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
Дата подачи: 26.07.2024
Дата принятия к публикации: 26.07.2024
Дата публикации: 28.07.2024
URL: https://iimmun.ru/iimm/article/view/17741
DOI: https://doi.org/10.15789/2220-7619-MIC-16641
ID: 17741

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Коинфицирование вирусами иммунодефицита человека (ВИЧ) и гепатита С (ВГС) является фактором риска развития иммунологического неответа на антиретровирусную терапию. При иммунологическом неответе снижение вирусной нагрузки ВИЧ не сопровождается ростом числа CD4⁺ Т-лимфоцитов, что увеличивает риски заболеваемости и смертности инфицированных лиц. Одним из механизмов препятствующих регенерации Т-лимфоцитов у иммунологических неответчиков может быть функциональное истощение этих клеток. Целью настоящего исследования было определение показателей функционального истощения CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитов у ВИЧ/ВГС коинфицированных иммунологических неответчиков на антиретровирусную терапию. Обследованы три клинические группы: 1) ВИЧ/ВГС коинфицированные иммунологические неответчики (CD4⁺ Т-клетки < 350/мкл крови; n = 9), ВИЧ/ВГС коинфицированные лица со стандартным ответом на терапию (CD4⁺ Т-клетки > 500/мкл крови; n = 9), 3) относительно здоровые добровольцы без ВИЧ и ВГС инфекций (n = 9). В эксперименте ex vivo методом многоцветной проточной цитометрии определено количество CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток, экспрессирующих ингибиторный рецептор PD-1. В эксперименте in vitro с культурами клеток, стимулированными фитогемагглютинином в течение 7 дней, методом многоцветной проточной цитометрии установлено количество гибнущих в процессе пролиферации (CFSE^low ZombieUV⁺) CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитов. В супернатантах этих культур методом иммуноферментного анализа определено количество интерлейкина-2. Установлено, что у ВИЧ/ВГС коинфицированных иммунологических неответчиков относительно двух групп сравнения увеличено количество CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток, экспрессирующих PD-1 (фенотипический признак истощения). Также у ВИЧ/ВГС коинфицированных иммунологических неответчиков была увеличена доля гибнущих в процессе деления Т-клеток. Важно, что их количество было повышено среди CD4⁺, но не среди CD8⁺ Т-лимфоцитов. Аналогичным образом, снижение продукции интерлейкина-2 стимулированными Т-клетками было выявлено у ВИЧ/ВГС коинфицированных неответчиков в пуле CD4⁺, но не CD8⁺ Т-лимфоцитов. Таким образом, у ВИЧ/ВГС коинфицированных иммунологических неответчиков CD4⁺ Т-лимфоциты демонстрируют признаки фенотипического и функционального истощения, тогда как CD8⁺ Т-клетки, хотя и экспрессируют ингибиторные рецепторы, не проявляют признаков функциональных нарушений. По-видимому, разработка специализированной терапии ВИЧ/ВГС коинфицированных иммунологических неответчиков должна быть сосредоточена на восстановлении функциональной активности CD4⁺ Т-лимфоцитов.

Ключевые слова

ВИЧ/ВГС коинфекция, антиретровирусная терапия, иммунологический неответ, Т-лимфоциты, истощение, PD-1, пролиферация, клеточная смерть, интерлекин-2

Полный текст

Введение

У 10–40% ВИЧ-инфицированных больных, получающих антиретровирусную терапию (АРТ), снижение вирусной нагрузки ВИЧ не сопровождается приростом численности CD4⁺ Т-лимфоцитов [12]. У этих пациентов, известных как «иммунологические неответчики» (ИН), глубокая хроническая лимфопения увеличивает риск развития СПИД-ассоциированных заболеваний и госпитализации, приводит к ранней утрате трудоспособности и инвалидизации, грозит преждевременной смертью [8].

Причины нарушения регенерации CD4⁺ Т-клеток у получающих лечение ВИЧ-инфи цированных лиц остаются не до конца понятными. Известно, что коинфекция вирусом гепатита С (ВГС) является значимым фактором риска развития этого феномена. Так, иммунологический неответ на АРТ встречается в 3,5 раза чаще у ВИЧ/ВГС коинфицированных больных, чем у пациентов без ВГС коинфекции [7].

Ранее мы показали, что у ВИЧ/ВГС коинфицированных субъектов пул периферических Т-лимфоцитов насыщен клетками, экспрессирующими ингибиторные рецепторы [10]. Их наличие на Т-лимфоцитах тесно связано с функциональным истощением [6]. Для истощенных Т-клеток характерна потеря способности к продукции цитокинов и пролиферации [11], что может объяснить низкую регенераторную способность лимфоцитов. Следует отметить, что у ВИЧ/ВГС коинфицированных больных фенотипические признаки истощения в виде экспрессии ингибиторных рецепторов на поверхности демонстрируют и CD4⁺, и CD8⁺ Т-клетки. Однако, в отличие от CD4⁺ Т-лимфоцитов, пул CD8⁺ Т-клеток увеличивается в размере на фоне коинфекции ВГС [2]. При иммунологическом неответе на АРТ количество CD8⁺ Т-лимфоцитов также не снижается [2]. Очевидно, что истощенный фенотип клеток не в полной мере отражает их функциональное состояние. Для понимания роли истощения в нарушении регенерации Т-клеток у ВИЧ/ВГС коинфицированных ИН необходимо исследовать не только фенотип Т-лимфоцитов, но и их способность к пролиферации и продукции цитокинов.

Целью настоящей работы было определение показателей функционального истощения CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитов у ВИЧ/ВГС коинфицированных иммунологических неответчиков на АРТ.

Проведение исследования было одобрено этическим комитетом Пермского краевого центра по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями (рег. № комитета IRB00008964). Каждый участник подписал информированное согласие. Включенные в исследование пациенты соответствовали следующим требованиям: подтвержденные диагнозы ВИЧ и ВГС инфекций, приверженность АРТ в течение двух и более лет, вирусная нагрузка ВИЧ менее 250 копий/мл (предел чувствительности тест-систем), отсутствие лечения интерферонами или анти-ВГС препаратами прямого действия.

Были сформированы три клинические группы:

ВИЧ/ВГС коинфицированные иммунологические неответчики (ИН; n = 9) с числом CD4⁺ Т-лимфоцитов менее 350/мкл крови;
ВИЧ/ВГС коинфицированные иммунологические ответчики (ИО; n = 9) с числом CD4⁺ Т-клеток более 500/мкл крови.
относительно здоровые добровольцы (К; n = 9) без ВИЧ и ВГС инфекций.

Кровь объемом до 30 мл забирали натощак из кубитальной вены в вакуумные пробирки, содержащие литий гепарин (Weihai Hongyu Medical Devices Cj., Ltd., Китай).

Мононуклеарные клетки выделяли путем центрифугирования двукратно разведенной фосфатно-солевым буферным раствором Дульбекко (DPBS, Gibco; США) крови в градиенте плотности Диаколла (1,077 г/мл, Диаэм; Россия). Выделенные клетки собирали, дважды отмывали раствором DPBS, подсчитывали в камере Горяева, после чего подвергали контролируемому замораживанию в жидком азоте в среде, содержащей 90% термоинактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС, Gibco, Колумбия) и 10% диметилсульфоксида (AppliChem, Германия). Перед проведением исследования клетки размораживали.

Для фенотипического анализа истощенных клеток образцы окрашивали витальным красителем Zombie UV (Biolegend, США) и коктейлем анти-CD3-BV605, анти-CD4-PE, анти-CD8-BV510 и анти-PD1-PB антител (Biolegend, США). Окрашенные клетки анализировали с использованием проточного цитофлюориметра CytoFLEX S (Beckman Coulter, США).

Для определения продуктивности деления стимулированных Т-лимфоцитов образцы окрашивали 5 мкМ 5,6-карбоксифлуоресцеина диацетат-N-сукцинимидилового эфира (CFSE; Biolegend, США), дважды отмывали средой RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, США), содержащей 20% ЭТС, и затем стимулировали фитогемагглютинином (ФГА, Serva, Германия) в конечной концентрации 15 мкг/мл. Лейкоциты культивировали в полной питательной среде (ППС), содержащей RPMI-1640, 10% ЭТС, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Thermo Fisher Scientific, Inc., США), в течение 7 суток (+37°С, 5% СО₂) с заменой культуральной среды на 3–4 сутки. По окончании времени инкубации клетки собирали и окрашивали анти-CD3-BV605, анти-CD4-PE и анти-CD8-BV510 антителами (Biolegend, США) и витальным красителем Zombie UV (Biolegend, США). Лейкоциты гейтировали согласно логике, представленной на рис. 1.

Рисунок 1. Логика гейтирования лейкоцитов при определении жизнеспособности делящихся Т-клеток

Figure 1. Leukocyte gating logic for assessing the viability of dividing T-cells

Примечание. А — выделение CD3⁺ Т-клеток; Б — разделение Т-клеток на субпопуляции CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитов; В — установка гейта в нестимулированном образце; Г — анализ единовременного окрашивания витальным красителем Zombie UV и трекинговым красителем CFSE стимулированного образца. Представлены типовые диаграммы светорассеяния.

Note. A — isolation of CD3⁺ T-cells; B — division of T-cells into CD4⁺ and CD8⁺ T-lymphocyte subsets; C — setting the gate in the unstimulated sample; D — analysis of stimulated cells stained with vital dye Zombie UV and tracking dye CFSE. Typical light scattering diagrams are presented.

Для определения цитокин-продуцирующей способности Т-лимфоцитов из образцов выделяли CD4⁺ и CD8⁺ Т-клетки. Негативную селекцию проводили с использованием коммерчес ких наборов Dynabeads Untouched Human CD4 T cells (Invitrogen, США) и MagCellect Human CD8⁺ T Cell Isolation Kit (R&D Systems, Inc., США) согласно инструкциям производителей. Долю CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитов в пуле клеток, прошедших процедуру магнитной сепарации, оценивали на проточном цитофлюориметре CytoFLEX S с использованием моноклональных анти-CD3-PerCP, анти-CD4-BV605 и анти-CD8-APC-Fire750 антител (BioLegend, США). Чистота выделенных субпопуляций составила более 92%. Затем изолированные CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоциты стимулировали магнитными частицами Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 (Gibco, США) и культивировали в ППС, в течение 72 ч (+37°С, 5% СО₂). Контролем служили нестимулированные клетки. По истечении времени инкубации собирали супернатанты, в которых определяли концентрации интерлейкина-2 (IL-2) методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческого набора «Интерлейкин-2-ИФА-БЕСТ» (Вектор БЕСТ, Россия). Концентрацию цитокина выражали в нг/мл.

Статистический анализ и визуализацию данных проводили с помощью программного обеспечения «GraphPad Prism 8» (GraphPad Software, США). Количественные данные в тексте и таблицах представлены в виде медиан и их интерквартильных размахов; категориальные данные — в виде процентов. Для сравнения нескольких групп количественных данных использовали однофакторный дисперсионный анализ; множественные сравнения между группами проводили с помощью критерия Тьюки. Для сравнения групп категориальных данных использовали критерий согласия Пирсона (χ²). Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез приняли равным 0.05.

Группы обследованных не имели статистически значимых отличий по возрасту, полу, продолжительности ВИЧ-инфекции и АРТ, а также вирусной нагрузке ВИЧ (табл. 1). Основным отличием между группами было количество CD4⁺ Т-клеток периферической крови в момент исследования.

(

Таблица 1. Клинические характеристики ВИЧ/ВГС коинфицированных и здоровых людей

Table 1. Clinical characteristics of HIV/HCV coinfected individuals and healthy controls

Параметры/Parameters	ИН/INR	ИО/IR	К/HC
Количество обследованных, n \| Number of participants, n	9	9	9
Возраст, лет \| Age, years	38,0 (32,0–40,5)	36,0 (34,5–42,0)	40,0 (32,5–43,5)
Женщины, % \| Women, %	22,2	44,4	44,4
Продолжительность АРТ, лет \| ART duration, years	6,0 (3,5–12,5)	4,0 (3,0–7,0)	–
Коинфекция ВГС, % \| HCV coinfection, %	100	100	0
Численность CD4⁺Т-лимфоцитов, клеток/мкл CD4⁺ T-cell count, cells/ul	226 (188–303) P_1–2 < 0,001 P_1–3 < 0,001	538 (449–648) P_2–3 < 0,05	682 (633–756)
Вирусная нагрузка ВИЧ, копий/мл \| HIV viral load, copies/ml	< 250	< 250	–

Примечание. указаны медианы и интерквартильные размахи. Группы количественных данных сравнивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа; для множественных сравнений использовали критерий Тьюки. Группы категориальных данных сравнивали с помощью критерия согласия Пирсона (χ²). ВИЧ — вирус иммунодефицита человека; ВГС — вирус гепатита С; АРТ — антиретровирусная терапия; ИН — иммунологические неответчики; ИО — иммунологические ответчики; К — контроль (здоровые доноры крови).

Note. Medians and interquartile ranges are shown. Groups of quantitative data were compared using ordinary one-way ANOVA followed by Tukey’s post-hoc test. Groups of categorical data were compared using the Pearson’s chi-square test (χ²). HIV — human immunodeficiency virus; HCV — hepatitis C virus; ART — antiretroviral therapy; INR — immunological non-responders; IR — immunological responders; HC — healthy controls.

Фенотипический анализ лейкоцитов ex vivo показал следующее (рис. 2). При ВИЧ/ВГС коинфекции в крови пациентов повышается относительное количество CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток, экспрессирующих ингибиторные рецепторы PD-1. Величина пула PD-1-позитивных Т-лимфоцитов зависит от эффективности иммунологического ответа больных на АРТ: наиболее высокое процентное содержание CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток, экспрессирующих PD-1, было выявлено в группе ИН. Поверхностную экспрессию молекулы PD-1 принято считать одним из ключевых маркеров истощения Т-лимфоцитов, которое ассоциировано с прогрессирующей потерей Т-клетками их эффекторных функций, в том числе способности к делению, продукции цитокинов и поддержанию жизнеспособности [3, 11].

Рисунок 2. Процентное содержание PD-1-позитивных Т-лимфоцитов в периферической крови ВИЧ/ВГС коинфицированных больных с различной эффективностью регенерации иммунитета

Figure 2. Percentage of PD-1-positive T-lymphocytes in the peripheral blood of HIV/HCV coinfected patients with different levels of immune reconstitution efficiency

Примечание. Указаны медианы и интерквартильные размахи. ИН — иммунологические неответчики; ИО — иммунологические ответчики; К — контроль. * — p < 0,05; *** — p < 0,001 (однофакторный дисперсионный анализ с последующим сравнением с помощью критерия Тьюки).

Note. Medians and interquartile ranges are shown. INR — immunological non-responders; IR — immunological responders; HC — healthy controls. * — p < 0.05; *** — p < 0.001 (ordinary one-way ANOVA followed by Tukey’s post-hoc test).

На основании полученных нами результатов можно предположить наличие истощения пулов CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитов у ВИЧ/ВГС коинфицированных ИН. Вместе с тем оценка экспрессии единственного фенотипического маркера не позволяет определенно судить о функциональности Т-клеток. Молекула PD-1 временно экспрессируется на активированных лимфоцитах после получения ими сигнала через Т-клеточный рецептор [14]. Этот механизм отрицательной обратной связи защищает организм от чрезмерных и нежелательных реакций, и потому экспрессия PD-1 не может рассматриваться как однозначный признак истощения Т-лимфоцитов. Для подтверждения того, что у ИН увеличение доли PD-1-позитивных CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитов свидетельствует об их истощении, были проведены дополнительные исследования жизнеспособности и цитокинпродуцирующей активности клеток, стимулированных в условиях in vitro.

Было установлено, что у ИН среди пролиферирующих в культуре лимфоцитов значительно увеличивается доля гибнущих Т-клеток (рис. 3). Примечательно, что это было характерно для CD4⁺ Т-лимфоцитов, но не для CD8⁺ Т-клеток.

Рисунок 3. Склонность к гибели пролиферирующих Т-лимфоцитов ВИЧ/ВГС коинфицированных больных с различной эффективностью регенерации иммунитета

Figure 3. Susceptibility to death of proliferating T-lymphocytes in HIV/HCV coinfected patients with different levels of immune reconstitution efficiency

Примечание. Указаны медианы и интерквартильные размахи. ИН — иммунологические неответчики; ИО — иммунологические ответчики; К — контроль. * — p < 0,05 (однофакторный дисперсионный анализ с последующим сравнением с помощью критерия Тьюки).

Note. Medians and interquartile ranges are shown. INR — immunological non-responders; IR — immunological responders; HC — healthy controls. * — p < 0.05 (ordinary one-way ANOVA followed by Tukey’s post-hoc test).

Ранее в ходе культуральных исследований нами было установлено, что CD4⁺ Т-клетки ИН чаще, чем аналогичные лимфоциты ИО и К не запускают процесс деления после стимуляции митогенами, но остаются в состоянии покоя [1]. Более того, было показано, что у ИН CD4⁺ Т-лимфоциты, вступившие в организме в процесс гомеостатической пролиферации, оказываются неспособны завершить его с образованием дочерних клеток [13]. Такое нарушение продуктивности деления сопровождается экспрессией генов, ассоциированных с апоптозом, и, в целом, с низкой жизнеспособностью пролиферирующих лимфоцитов [9, 13]. Перечисленные исследования были проведены на клетках ВИЧ моноинфицированных пациентов. Опираясь на данные настоящей работы, можно предположить, что схожие нарушения свойственны и Т-лимфоцитам ВИЧ/ВГС коинфицированных ИН.

Мы исследовали способность CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток ВИЧ/ВГС коинфицированных пациентов с различной эффективностью регенерации иммунитета на фоне АРТ продуцировать IL-2 в ответ на стимуляцию in vitro. Оценка концентрации данного цитокина в супернатантах нестимулированных клеточных культур показала относительно невысокое его содержание, которое в среднем составило 0,012 нг/мл (0,012–0,013 нг/мл). Во всех клинических группах нестимулированные CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоциты секретировали почти одинаковое количество IL-2 (p > 0,05). На фоне стимуляции продукция данного цитокина Т-клетками увеличивалась в 1000 и более раз (p < 0,001). Во всех исследованных группах активированные CD4⁺ Т-лимфоциты являлись основными продуцентами IL-2 и по сравнению с аналогичными CD8⁺ Т-клетками секретировали больше этого цитокина (рис. 4; p < 0,001). Важно отметить, что у ИН по сравнению с ИО и К была снижена продукция IL-2 стимулированными CD4⁺ Т-клетками (p < 0,05), но не CD8⁺ Т-лимфоцитами (p > 0,05). Полученные данные свидетельствуют о том, что у ИН нарушена способность активированных CD4⁺ Т-клеток эффективно продуцировать IL-2.

Рисунок 4. Содержание интерлейкина-2 в супернатантах стимулированных культур CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитов ВИЧ/ВГС коинфицированных больных с различной эффективностью регенерации иммунитета

Figure 4. Interleukin-2 levels in supernatants of stimulated CD4⁺ and CD8⁺ T-lymphocyte cultures in HIV/HCV coinfected patients with different levels of immune reconstitution efficiency

Ранее нами было установлено [1], что Т-лим фоциты, выделенные из периферичес кой крови ВИЧ моноинфицированных ИН и стимулированные в течение 5 сут. анти-CD3/анти-CD28 антителами, продуцируют меньше IL-2, чем Т-клетки ИО (p > 0,05) или К (p < 0,01). Снижение уровня продукции данного цитокина сопровождалось уменьшением доли CD4⁺ Т-лимфоцитов, поделившихся под действием стимулирующего агента. Опираясь на данные литературы о том, что аутокринное и паракринное действие IL-2, синтезируемого Т-клетками, необходимо для выполнения ими эффекторных функций таких как деление [5], мы предположили, что CD4⁺ Т-лимфоциты ИН снижают пролиферативную активность из-за дефицита IL-2. Однако на тот момент нам не удалось выявить субпопуляцию Т-клеток, в которой происходит нарушение продукции данного цитокина. В настоящем исследовании мы показали, что у ВИЧ/ВГС коинфицированных ИН продукция IL-2 снижена именно в активированных CD4⁺ Т-клетках.

Истощение Т-лимфоцитов является препятствием в борьбе с хроническими заболевания ми, такими как ВИЧ-инфекция и гепатит С. Истощенные Т-клетки не могут эффективно бороться с вирусами, что способствует ускоренному развитию СПИД. Восстановление функциональности Т-клеток путем подавления экспрессии ингибиторных рецепторов и блокирования соответствующих сигнальных путей может быть перспективным методом терапии [4]. Однако необходимо убедиться, что клетки-мишени действительно истощены. В настоящем исследовании мы установили, что по сравнению с ИО и К среди периферических CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитов ВИЧ/ВГС коинфицированных ИН увеличена доля клеток с фенотипом, характерным для истощения. В то же время мы показали, что только у ИН делящиеся CD4⁺, но не CD8⁺ Т-клетки, характеризуются сниженной жизнеспособностью и цитокин-продуцирующей активностью. Таким образом, у ВИЧ/ВГС коинфицированных ИН CD4⁺ Т-лимфоциты демонстрируют признаки фенотипического и функционального истощения, тогда как CD8⁺ Т-клетки, хотя и экспрессируют ингибиторные рецепторы, не проявляют признаков функциональных нарушений. По-видимому, разработка специализированной терапии ВИЧ/ВГС коинфицированных ИН должна быть сосредоточена на восстановлении функциональной активности CD4⁺ Т-лимфоцитов.

Об авторах

Евгения Владимировна Сайдакова

«Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук» — филиал ФГБУН Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: radimira@list.ru

доктор биологических наук, доцент, зав. лабораторией молекулярной иммунологии