IgG-antibodies to individual cytomegalovirus proteins and the peripheral blood lymphocyte subset profile in patients with anterior uveitis of varying severity

Full Text

Введение

Увеиты — заболевания сосудистой оболочки глаза, различающиеся по этиологии (инфекционные, неинфекционные), локализации (передние, периферические, задние, генерализованные), активности и тяжести. При переднем увеите (ПУ) интраокулярное воспаление локализуется в радужке и цилиарном теле. Одним из показателей тяжести ПУ является наличие в передней камере глаза клеточного экссудата — гипопиона, состоящего в основном из лейкоцитов.

Вирусы герпеса человека (ВГЧ), в частности цитомегаловирус (CMV), играют важную роль в этиологической структуре инфекционных ПУ, причем преобладают увеиты, вызванные не первичной инфекцией, а реактивацией пожизненно персистирующего в организме вируса [6].

Устанавливающаяся после первичного заражения пожизненная персистенция ВГЧ в клетках инфицированного хозяина — результат сложных взаимоотношений между иммунной системой человека и вирусом: с одной стороны, она связана со способностью вируса уклоняться от иммунного надзора хозяина, а с другой, с возможностью иммунной системы ограничивать литическую фазу инфекции [14].

CMV — самый крупный из вирусов герпеса человека, известно более 200 разных белков, участвующих в его жизненном цикле. Наиболее активно изучаются предранние белки, инициирующие литическую фазу инфекции, фосфопротеины тегумента (аморфного белкового слоя, расположенного между нуклеокапсидом и наружной оболочкой-суперкапсидом), участвующие в разных стадиях репликативного цикла, гликопротеины суперкапсида, облегчающие проникновение вируса во все типы клеток и его межклеточное распространение [13].

Цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ) у иммунокомпетентных лиц характеризуется динамичным взаимодействием вируса с иммунной системой хозяина на протяжении всей жизни, при этом иммунная система, особенно Т-лимфоциты, сдерживают репликацию вируса и развитие заболевания, но не элиминируют вирус и не предотвращают его передачу другому человеку [14, 15].

Проведенное Vescovini R. и соавт. [15] с интервалом в 5 лет обследование здоровых доноров показало достоверное увеличение уровня IgG-антител к CMV и количества специфических CD8+ клеток памяти. Авторы полагают, что даже при отсутствии клинических признаков заболевания CMV модулирует состав иммунокомпетентных клеток за счет увеличения специфических клеток памяти.

Оппортунистический характер ЦМВИ проявляется в склонности к реактивации под влия- нием различных экзо- и эндогенных факторов, в частности заболеваний другой этиологии, не только в условиях иммуносупрессии, но и у иммунокомпетентных лиц.

В последнее время обсуждается роль CMV в патогенезе неинфекционных увеитов.

Длительное время напряженность клеточного и гуморального иммунитета к CMV исследовали с использованием лизатов инфицированных клеток или смеси разных вирусных белков. Sylwester A.W. и соавт. [14] изучили иммуногенность пептидов, кодируемых 213 открытыми рамками считывания (ОРС) CMV, и выявили, что продукты 151 ОРС были иммуногенными для CD4+ и/или CD8+ Т-клеток. Причем у серопозитивных людей общий ответ популяции CMV-специфичных Т-лимфоцитов формировал приблизительно 10% CD4+ и/или CD8+ Т-клеток памяти периферической крови. Проанализировав литературу, авторы заключили, что у здоровых серопозитивных людей частота выявления CMV-специфичных CD4+ и/или CD8+Т-лимфоцитов значительно превышала частоту, обнаруживаемую при инфицировании такими распространенными вирусами, как вирусы кори, эпидемического паротита, гриппа, аденовирусами, поксвирусами и даже другими вирусами герпеса человека (вирус простого герпеса, вирус варицелла зостер).

Активное участие индивидуальных белков CMV в репликации вируса, их высокая иммуногенность вызывают интерес к роли каждого из них в иммунопатогенезе заболеваний разной этиологии.

По данным Kern F. и соавт. [9], у 40 здоровых серопозитивных к CMV доноров частота специфического ответа CD4+ и CD8+ T-лимфоцитов периферической крови на иммунодоминантный антиген (АГ) р65 различалась: у 63% выявлен специфический ответ CD4+ T-лимфоцитов, а у 83% — CD8+ T-лимфоцитов.

Цель настоящего исследования — изучить особенности антителообразования к шести индивидуальным белкам CMV и провести корреляционный анализ с показателями субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови у пациентов с ПУ, протекающими с гипопионом и без него.

Материалы и методы

36 пациентов с ПУ по результатам офтальмологического обследования разделили на 2 группы: 1 группа — ПУ без гипопиона (20 пациентов, средний возраст 42,9±14,6 год), 2 группа — ПУ с гипопионом (16 пациентов, средний возраст 41,6±13,9 год). Преобладали пациенты с увеитами, вызванными вирусом простого герпеса, реже — с ревматоидными увеитами. У всех 36 пациентов отсутствовали клинические симптомы, патогномоничные для ПУ ЦМВ-этиологии. Материалом для иммунологических исследований послужили образцы сывороток крови.

Иммуноферментный анализ (ИФА). При первом обращении у пациентов брали кровь из локтевой вены, сыворотку крови (СК) разливали на аликвоты, хранили до исследования при Т –20°С. СК исследовали в ИФА на наличие IgМ- и IgG-антител к структурным поздним антигенам CMV (серологические маркеры первичной и хронической ЦМВИ соответственно). Использовали наборы реагентов «ВектоЦМВ-IgM» и «ВектоЦМВ-IgG» (Вектор-Бест). IgG-антитела к основному предраннему неструктурному белку вируса-IE (маркеры реактивации хронической ЦМВИ) исследовали с тест-системой «БиоСет-актив-ЦМВ (Биосервис). ИФА проводили на автоматическом анализаторе «Лазурит» (США) в соответствии с инструкцией производителя тест-систем. Результат ИФА учитывали по разнице оптической плотности (ΔОП) исследуемой и контрольной отрицательной сыворотки.

Линейный иммуноанализ (ЛИА). IgG-антитела в СК к индивидуальным рекомбинантным АГ CMV определяли методом линейного иммуноанализа (ЛИА) одновременно с постановкой ИФА. Рекомбинантные АГ CMV были получены в НИИВС имени И.И. Мечникова и содержали только высокоспецифичные для CMV белковые фрагменты вирусных антигенов (р): основной неструктурный предранний белок IE (IE), неструктурный предранний ДНК-связывающий белок р52 (р52), иммунодоминантные белковые фрагменты фосфопротеинов тегумента р150, р65, p28 и гликопротеина оболочки GB-AD [3].

Рекомбинантные АГ IE, р65, р160, р52, р28, АG-BD сорбировали на нитроцеллюлозных стрипах в виде индивидуальных линий. Отрицательным контрольным антигеном служила β-галактозидаза Е. cоli, для контроля правильности проведения реакции использовали иммунную сыворотку к IgG-человека. Комплекс «антитело–АГ» выявляли с помощью конъюгата моноклональных антител мыши к IgG-человека, конъюгированных с пероксидазой хрена.

Результаты оценивали визуально по интенсивности окраски линий в месте нанесения каждого антигена в сравнении с положительным и отрицательным контролем и выражали в условных единицах, «плюсах» (+). Отсутствие окрашивания линии учитывали как отрицательный результат (–); очень слабое окрашивание — сомнительный результат (±); слабое окрашивание — слабоположительный результат (1+); умеренное окрашивание — положительный результат (2+); интенсивное окрашивание — сильноположительный результат (3+) [3].

Проточная цитометрия. Методом проточной цитометрии в цельной крови определяли относительное (%) и абсолютное содержание (а.с.) субпопуляций Т-лимфоцитов (CD3+), Т-хелперов (CD3+CD4+CD8–), T-цитотоксических клеток (СD3+CD4–CD8+), дубль-позитивных Т-лимфоцитов (СD3+CD4+ CD8+), NK-клеток (CD16+СD56+), В-лимфоцитов (CD19+), рассчитывали иммунорегуляторный индекс СD4+/СD8+ (ИРИ). Кровь брали в пробирки Vacuette® с антикоагулянтом KSEDTA. Состав лимфоцитов оценивали методом лазерной проточной цитофлуориметрии (цитометр BD FACSCantoll, США). Содержание субпопуляций определяли в программе Canto (Becton Dickinson, США) с выделением региона по общей популяции, экспрессирующей CD45+ антиген, и по гранулярности клеток (CD45+PerCP-Cy5*/SSC) при помощи меченных флуорохромами антител к CD3+ (FITC), CD4+(PE-Cy7*), CD8+(APC-CY7*), позволяющих дифференцировать клетки: Т-лимфоциты (CD3+), Т-хелперы (CD3+CD4+CD8–), Т-цитотоксические (CD3+ CD4–CD8+), Т-«дубль-позитивные» (CD3+CD4+ CD8+), натуральные киллеры (CD16+CD56+), В-лимфоциты (CD19+), иммунорегуляторный индекс (CD4+/CD8+).

Статистический анализ.

Использовали программу StatTech v. 3.0.2 (разработчик — ООО «Статтех»).

Количественные показатели оценивали на предмет соответствия нормальному распределению с помощью критерия Шапиро–Уилка (при числе исследуемых менее 50) или критерия Колмогорова–Смирнова (при числе исследуемых более 50). Количественные показатели, имеющие нормальное распределение, описывались с помощью средних арифметических величин (M) и стандартных отклонений (SD), границ 95% доверительного интервала (95% ДИ). В случае отсутствия нормального распределения количественные данные описывались с помощью медианы (Me) и нижнего и верхнего квартилей (Q1–Q3).

Сравнение двух групп по количественному показателю, имеющему нормальное распределение, при условии равенства дисперсий, выполнялось с помощью t-критерия Стьюдента. Сравнение двух групп по количественному показателю, распределение которого отличалось от нормального, выполнялось с помощью U-критерия Манна–Уитни.

Направление и теснота корреляционной связи между двумя количественными показателями оценивались с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена (при распределении показателей, отличном от нормального).

Прогностическая модель, характеризующая зависимость количественной переменной от факторов, разрабатывалась с помощью метода линейной регрессии.

Качественную оценку тесноты связи двух показателей оценивали по значению коэффициента корреляции (r) с помощью шкалы Чеддока: слабая — 0,1 < r < 0,3; умеренная — 0,3 ≤ r < 0,5; заметная — 0,5 ≤ r < 0,7; высокая — 0,7 ≤ r <0,9; весьма высокая — 0,9 ≤ r < 1,0. Направление связи: прямая (+) и обратная (–). Определяли также достоверность выявленного коэффициента корреляции (р < 0,05).

Результаты

Серологический анализ (ИФА). IgG-антитела к поздним структурным антигенам CMV выявили у 36 (100%) пациентов обеих групп, что свидетельствовало о наличии у них хронической ЦМВ-инфекции (ХЦМВИ). Уровни IgG-антител к пулу поздних антигенов у отдельных больных в обеих группах колебались от 0,9 до > 3,5 ΔОП, средние показатели в обеих группах существенно не отличались (р > 0,05). Слабоположительные серологические маркеры реактивации ХЦМВИ (IgG-антитела к IE-антигену) обнаружены у 3 из 20 (15%) пациентов 1 группы и у 2 из 16 (12,5%) пациентов 2 группы (р > 0,05).

Продукция IgG-антител к индивидуальным рекомбинантным АГ CMV у пациентов обеих групп (ЛИА). Частота выявления и средние уровни (медиана) IgG-антител к каждому из исследованных индивидуальных АГ CMV в обеих группах также достоверно не отличалась (р > 0,05) (табл. 1 и 2).

 

Таблица 1. Частота выявления IgG-антител (интенсивность окрашивания линии 1+, 2+, 3+) к рекомбинантным вирусным антигенам у CMV-серопозитивных пациентов с передними увеитами без и с наличием гипопиона (линейный иммуноанализ)

Table 1. Detection rate of IgG antibodies (bands 1+, 2+, 3+) against CMV recombinant antigens in CMV-seropositive patients with anterior uveitis without and with hypopion (Line Immunoassay)

Передний увеит Anterior uveitis	Всего обследовано Total examined	Антигены ЦМВ CMV antigens
		IE n (%)*	p150 n (%)	р52 n (%)	p65 n (%)	p28 n (%)	GB-AD n (%)
Без гипопиона Without hypopion	20	3 (15)	18 (90)	11 (55)	17 (85)	15 (75)	7 (35)
С гипопионом With hypopion	16	2 (12,5)	14 (87,5)	10 (62,5)	15 (94)	11 (68,8)	9 (56)
р		> 0,05	> 0,05	> 0,05	> 0,05	> 0,05	> 0,05

Примечание. *n (%) — число пациентов (%), серопозитивных к данному рекомбинантному антигену; ** р < 0,05 — достоверность отличия показателей между двумя группами ПУ.

Note. n (%) — number (%) of patients seropositive for specific recombinant antigen; **p < 0.05 — significant inter-group differences in parameters.

 

Таблица 2. Cредний уровень антител (Ме) к рекомбинантным антигенам CMV в группах пациентов с передними увеитами без (I) и с наличием гипопиона (II) (линейный иммуноанализ)

Table 2. Average level of antibodies (Mе) against recombinant CMV antigens in groups of patients with anterior uveitis without (I) and with hypopyon (II) (Line Immunoassay)

Антигены ЦМВ CMV-antigen	Группа передних увеитов Group оf anterior uveitis	n***	Me****	Q1–Q3*****	p******
IE	I*	20	0,0	0,0–0,5	0,840
	II******	16	0,0	0,0–0,1
р150	I	20	2,0	1,0–2,0	0,944
	II	16	2,0	1,0–2,0
р52	I	20	1,0	0,0–1,2	0,764
	II	16	1,0	0,0–1,2
р65	I	19	2,0	1,0–2,0	0,489
	II	16	1,0	1,0–2,0
GB-AD	I	20	0,5	0,4–1,0	0,273
	II	16	1,0	0,5–1,0
р28	I	20	1,0	0,9–2,0	0,252
	II	16	1,0	0,4–1,0

Примечание. *I — группа пациентов с передними увеитами без гипопиона; **II — группа увеитов с передними увеитами с гипопионом; ***n — число пациентов; ****Ме (медиана) — средний уровень антител к рекомбинантному антигену; *****Q1–Q3 — нижний и верхний квартиль; ******р < 0,05 — cтатистически значимое отличие.

Note. *I — anterior uveitis without hypopyon; **II — anterior uveitis with hypopyon ***n — number of patients; ****Me (median) — average level of antibodies specific to recombinant antigen; *****Q1–Q3 — lower and upper quartiles; ******p < 0.05 — significant difference between I and II groups of anterior uveitis

 

Особенности субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови у пациентов 1 и 2 групп. Обнаружено статистически значимое снижение абсолютного количества Т-цитотоксических клеток CD3+CD8+(р = 0,033) и тенденция к снижению их процентного содержания (р = 0,059), достоверное повышение процентного содержания натуральных киллеров CD16+CD56+ (р = 0,023), повышение регуляторного индекса (р = 0,033) в группе 1 (ПУ без гипопиона) по сравнению с группой 2 (ПУ с гипопионом) (табл. 3).

 

Таблица 3. Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови у пациентов с передними увеитами без (I) и с наличием гипопиона (II)

Table 3. Peripheral blood lymphocyte subset profile in patients with anterior uveitis without (I) and with hypopion (II)

Показатель* Index	Группа Group	M±SD/Me**	95% ДИ/Q1–Q***	Обследовано человек Persons examined	Р****
CD3+, %	I	74,5	67,8–76,2	20	0,911
	II	73,0	69,5–76,5	16
CD3+, абс.|abs.	I	1488,3±479,7	1263,8–1712,8	20	0,185
	II	1799,3±879,6	1330,5–2268,0	16
CD3+CD8+, %	I	23,3±5,8	20,5–26,0	20	0,059
	II	27,3±6,4	23,8–30,7	16
CD3+CD8+, абс.|abs.	I	↓474,3	346,7–556,0	20	0,033****
	II	647,5	394,2–765,0	16
CD3+CD4+, %	I	48,2±8,0	44,4–51,9	20	0,129
	II	44,2±7,2	40,3–48,0	16
CD3+CD4+, абс.|abs.	I	1007,3±413,8	813,6–1200,9	20	0,523
	II	1107,5±519,7	830,6–1384,4	16
CD3+CD4+CD8+, %	I	0,6	0,5–1,0	20	0,143
	II	1,0	0,8–1,3	16
CD3+CD4+CD8+, абс.|abs.	I	12,8	7,1–24,2	20	0,077
	II	18,5	14,0–31,0	16
CD16+CD56+, %	I	↑13,5	10,8–15,1	20	0,023****
	II	7,8	6,9–10,3	16
CD16+CD56+, абс.|abs.	I	223,3	180,7–357,0	20	0,239
	II	188,0	160,0–254,3	16
CD19+, %	I	14,0±7,0	10,8–17,3	20	0,145
	II	17,6±7,3	13,7–21,5	16
CD19+, абс.|abs.	I	257,5	157,2–385,2	20	0,092
	II	393,5	246,5–611,8	16
CD45+, абс.|abs.	I	2069,3±695,6	1743,7–2394,9	20	0,189
	II	2457,0±1034,4	1905,8–3008,2	16
CD4/CD8, абс.|abs.	I	↑2,2	1,7–2,6	20	0,033****
	II	1,6	1,4–2,2	16

Примечание. * — субпопуляции лимфоцитов; **М±SD — среднее арифметическое±стандартное отклонение/Ме — медиана; ***Q1–Q3 — нижний и верхний квартиль; ****р < 0,05 — статистически значимые различия показателей между I и II группами.

Note. * — lymphocyte subsets; М±SD — arithmetic mean±standard deviation/Ме — median; ***Q1–Q3 — lower and upper quartiles; **** p < 0.05 — significant difference between I and II groups of anterior uveitis.

 

Корреляционный анализ абсолютного и относительного содержания различных субпопуляций лимфоцитов в периферической крови с уровнем антител к отдельным рекомбинантным АГ CMV выявил некоторые отличия в группе пациентов с ПУ без гипопиона и с его наличием (табл. 4).

В группе 1 у пациентов с ПУ без гипопиона выявлена умеренная прямая достоверная (r = 0,472; р = 0,036) корреляционная связь между уровнем антител к IE-антигену CMV и абсолютным количеством CD45+-лимфоцитов и тенденция (р = 0,055) к умеренной прямой (r = 0,435) корреляционной связи между уровнем антител к IE-антигену CMV и абсолютным количеством CD19. Таким образом, показано, что у пациентов с ПУ без гипопиона реактивация CMV сопровождается повышением общего количества лимфоцитов и тенденцией к повышению числа CD19 В-лимфоцитов (табл. 4).

Корреляционный анализ выявил также достоверную умеренную прямую связь между уровнем антител к АГ CMV р65 и абсолютным количеством цитотоксических CD3+CD8+ Т-лимфоцитов (r = 0,458; р = 0,049), а также достоверную умеренную обратную связь между уровнем антител к р65 и процентным содержанием CD16+CD56+(r = –0,478; р = 0,038). Повышение уровня антител к р65 достоверно коррелировало с повышением абсолютного количества цитотоксических Т-лимфоцитов и снижением процентного содержания натуральных киллеров. Также отмечена умеренная достоверная обратная связь между уровнем антител к GB-AD и процентным содержанием натуральных киллеров (r = –0,499) (табл. 3).

Реакция на увеличение уровня антител к основному иммунодоминантному белку тегумента р65 и белку оболочки GB-AD заключалась в достоверном умеренном снижении процентного содержания натуральных киллеров.

Во 2 группе (ПУ с гипопионом) выявлена достоверная заметная прямая корреляционная связь между процентным содержанием дубль-позитивных лимфоцитов (CD3+CD4+CD8+) и уровнем антител к предраннему (IE) антигену CMV (r = 0,566, р = 0,022); абсолютным числом CD3+CD4+CD8+-лимфоцитов и уровнем антител к белку тегумента р65 (r = 0,551, р = 0,027), а также процентным содержанием и абсолютным числом CD3+CD4+CD8+ и уровнем антител к белку тегумента р28 (r = 0,670, р = 0,005; r = 0,563, р = 0,023, соответственно) (табл. 4).

 

Таблица 4. Статистически значимые корреляционные cвязи между уровнем антител к индивидуальным антигенам CMV и субпопуляциями лимфоцитов периферической крови у пациентов с передними увеитами без и с наличием гипопиона

Table 4. Significant correlations between level of antibodies specific to individual CMV antigens and peripheral blood lymphocyte subsets in patients with anterior uveitis without and with hypopion

Уровни антител к антигенам CMV Antibody levels to CMV antigens	Группа 1. Передние увеиты без гипопиона Group I. Anterior uveitis without hypopion		Группа 2. Передние увеиты с гипопионом Group II. Anterior uveitis with hypopion
	Прямая умеренная связь Direct moderate correlation	Обратная умеренная связь Inverse moderate correlation	Прямая заметная связь Direct significant correlation	Обратная заметная связь Inverse significant correlation
IE	СD45+ (абс.|abs.) r = 0,472 р = 0,036		CD3+CD4+CD8+ (%) r = 0,566 р = 0,022	СD19+ (%) r = –0,533 р = 0,033
p52				СD19+ (%) r = –0,501 р = 0,048
р65	CD3+CD8+(абс.|abs.) r = 0,458 р = 0,049	CD16+CD56+ (%) r = –0,478 р = 0,038	CD3+СD4+CD8+(абс.|abs.) r = 0,551 р = 0,027	CD19+ (%) r = –0,564 р = 0,023
GB-AD		CD16+CD56+ (%) r = –0,499 р = 0,025
p28			CD3+СD4+CD8+ (%) r = 0,670 р = 0,005 CD3+СD4+CD8+(абс.|abs.) r = 0,563 р = 0,023

Примечание. абс. — абсолютное количество лимфоцитов; % — процентное содержание лимфоцитов; r — коэффициент корреляции; p < 0,05 статистически значимые значения для коэффициента корреляции.

Note. abs. — absolute count of lymphocytes; % — percentage of lymphocytes; r — correlation coefficient; p < 0.05 — significant correlation coefficient.

 

В этой группе отмечена также достоверная заметная обратная корреляция между процентным содержанием CD19+ В-лимфоцитов и уровнем антител к трем рекомбинантным АГ CMV: IЕ (r = –0,533, р = 0,033), р52 (r = –0,501 р = 0,048), р65 (r = 0,564, р = 0,023) (табл. 3)

Обсуждение

Цитомегаловирус — самый крупный из вирусов герпеса человека, вирион которого состоит из внешней мембранозной оболочки (суперкапсида), белкового слоя, называемого тегументом, и икосаэдрического капсида, который содержит сжатый, большой (> 240 кб) геном ДНК. Попав в организм, CMV вызывает пожизненную инфекцию, реактивации которой способствуют многочисленные экзо- и эндогенные факторы, в первую очередь — иммуносупрессия.

Передний увеит — воспаление переднего отрезка увеального тракта глаза (радужки, цилиарного тела) — вызывается как инфекционными, так и неинфекционными факторами. Доказана этиологическая роль CMV при острых (протекающих с глаукомо-циклитическими кризами или с секторальной атрофией радужки) и хронических формах ПУ не только в условиях иммуносупрессии, но и у иммунокомпетентных людей [6].

Среди обследованных нами пациентов типичной для CMV клинической картины ПУ не выявлено ни в одном случае, хотя все 36 (100%) пациентов были хронически инфицированы ЦМВ. Субклинические серологические маркеры реактивации CMV (IgG-антитела к IE-антигену) обнаружены у 5 (11%) из них.

Накоплено много данных, свидетельствующих о ведущей роли Т-лимфоцитов в ограничении реактивации персистирующего ЦМВ [8, 14]. Мы провели анализ субпопуляционного состава циркулирующих лимфоцитов у пациентов с ПУ в зависимости от тяжести клинического течения и от специфического гуморального ответа к 6 индивидуальным антигенам CMV.

Общий анализ среднего уровня отдельных субпопуляций лимфоцитов выявил достоверное отличие между более легким (ПУ без гипопиона) и более тяжелым течением ПУ (с гипопионом): ПУ без гипопиона характеризовался достоверно более высоким содержанием натуральных киллеров и более низким содержанием Т-цитотоксических клеток; в этой группе значимо повышался регуляторный индекс.

Анализ корреляционной связи между содержанием отдельных субпопуляций лимфоцитов и уровнем антител к индивидуальным антигенам CMV выявил ряд отличий между двумя группами. У пациентов с ПУ без гипопиона обнаружена достоверная умеренная обратная корреляционная связь между процентным содержанием натуральных киллеров (CD16+CD56+(%)) в периферической крови и уровнями IgG-антител к антигенам CMV: GB-AD (р = 0,025) и многофункциональному антигену p65 (р = 0,038). NК-лимфоциты осуществляют лизис клеток, инфицированных вирусами, и участвуют в регуляции врожденного и адаптивного иммунного ответа [4, 10]. Усиление экспрессии некоторых антигенов является одним из факторов, индуцирующих выраженный иммунный ответ на них. Повышенная экспрессия доминантного иммуногенного антигена CMV р65, играющего важную роль в уклонении от иммунного надзора человека [9], и иммуногенного гликопротеина оболочки — GB-АD, облегчающего проникновение вируса во все типы клеток [13], коррелировало со снижением содержания в крови натуральных киллеров, участвующих в противовирусной защите клеток.

При повышении уровня антител к основному предраннему вирусному белку (маркеров реактивации CMV), повышалось абсолютное количество лимфоцитов в крови (прямая умеренная достоверная связь, р = 0,036) (табл. 3), что может свидетельствовать об усилении линии противовирусной защиты организма в начале реактивации ЦМВИ. При повышении уровня антител к р65, которое можно рассматривать как свидетельство усиления экспрессии вирусного антигена, играющего важную роль в репликации CMV, напрямую повышается уровень цитотоксических лимфоцитов CD3+CD8+ (р = 0,049).

По-видимому, у пациентов с ПУ без гипопиона ослабление врожденного иммунного ответа компенсировалось усилением специфического клеточного ответа за счет повышения количества Т-цитотоксических лимфоцитов, что ограничивало риск развития клинической CMV-симптоматики, но не исключало более длительного и торпидного течения увеита. Полученные данные согласуются с результатами Jackson S.E. и соавт. [8], показавшими, что у серопозитивных к CMV доноров специфичные к ЦМВ CD8+ Т-лимфоциты обладают высокой антивирусной активностью и могут преодолевать имеющиеся у вируса механизмы уклонения от иммунного ответа хозяина.

Ряд исследователей полагает, что CMV даже в отсутствии клинических признаков заболевания модулирует состав иммунокомпетентных клеток, увеличивая количество клеток памяти, специфичных для CMV [9].

В группе II пациентов ПУ протекал тяжелее, с наличием клеточного экссудата в передней камере глаза — гипопиона. В этой группе выявлена достоверная заметная прямая корреляция продукции антител на несколько индивидуальных антигенов CMV и содержанием в крови (процентным и/или абсолютным) малой субпопуляции лимфоцитов — дубль-позитивных клеток (CD3+CD4+CD8+): уровень антител к IE коррелировал с их процентным содержанием, к антигену р65 — с абсолютным количеством; к р28 — с их абсолютным числом и процентным содержанием. Фосфопротеин тегумента рр28, наряду с рр65, активно участвует на разных стадиях репликации ЦМВ, в частности при внутриклеточной передаче вируса и при выходе вириона из клетки [9, 11].

Мембранные молекулы CD4+ и CD8+ являются основными рецепторами для Т-хелперов и Т-цитотоксических лимфоцитов. Полагали, что одновременная экспрессия обеих молекул на мембране Т-лимфоцитов происходит только на этапе селекции в тимусе. Дубль-позитивные CD3+CD4+CD8+ Т-лимфоциты у человека впервые обнаружили Blue M.L. и др. в 1986 г. [5], и первоначально их появление в периферической крови связывали с преждевременным выходом незрелых лимфоцитов из тимуса [2, 14].

В настоящее время считают, что субпопуляция дубль-позитивных лимфоцитов образована высокодифференцированными клетками памяти. CD3+CD4+CD8+-клетки присутствуют в периферической крови у 1–3% практически здоровых людей, встречаются при аутоиммунных и хронических инфекционных болезнях [15]. Их количество постепенно увеличивается с возрастом, особенно после 65 лет. При хронических вирусных инфекциях они имеют фенотип эффекторных клеток памяти и проявляют антигенную специфичность [16]. Их уровень в крови может повышаться у лиц, инфицированных вирусом иммунодефицита человека, вирусами герпеса человека 6 типа, лимфоцитарного хориоменингита, Т-клеточного лейкоза человека и др. [17].

Если роль Т-хелперов и Т-цитотоксических клеток в иммунопатогенезе ЦМВИ активно изучалась [14], то функциональное значение CD3+CD4+CD8+-клеток не ясно, хотя не исключается их важное участие в адаптивном иммунном ответе на разные инфекционные агенты. Отмечается их гетерогенность. Часть исследователей считает, что источником CD3+CD4+CD8+-лимфоцитов являются CD4+ Т-клетки [12], другие — что CD8+-лимфоциты [14, 16, 17]. По данным Zhang H. и соавт. [17], у пациентов с хантавирусной геморрагической лихорадкой с почечным синдромом дубль-позитивные Т-клетки по своим характеристикам сходны с цитотоксическими Т-лимфоцитами и обладают антивирусными свойствами.

Giraldo N.A. и соавт. [7] обнаружили в крови пациентов с хронической болезнью Шагаса (вызванной простейшим вида Trypanosoma cruzi) увеличение относительного (%) содержания дубль-позитивных лимфоцитов по сравнению со здоровыми лицами, а также наличие в сердечной мышце больных с кардиомиопатией антигенспецифических CD3+CD4+CD8+-клеток.

Показано, что увеличение количества CD3+CD4+CD8+ дубль-позитивных Т-клеток в периферической крови имеет важное патогенетическое значение как фактор риска возникновения тяжелого (вплоть до летального исхода) осложнения лихорадки Денге — плазмореи [16]. По мнению авторов, CD3+CD4+CD8+ дубль-позитивные Т-клетки относятся к эффекторным Т-клеткам, которые по транскриптому ближе к CD3+CD8+ Т-лимфоцитам, чем к CD3+CD4+ Т-лимфоцитам [16]. Противоречива и оценка функций дубль-позитивных клеток крови: от цитотоксической до супрессивной [12].

Несмотря на то, что механизмы развития гипопиона при ПУ и плазмореи при лихорадке Денге во многом различаются, оба симптома начинаются с нарушения проницаемости сосудов и характеризуют более тяжелую форму заболевания. При лихорадке Денге с плазмореей отмечено увеличение количества дубль-положительных лимфоцитов в крови по сравнению с легкой формой болезни. При ПУ с гипопионом отмечено прямое влияние нескольких антигенов CMV на уровень CD3+CD4+CD8+ Т-лимфоцитов в отличие от более легких форм ПУ без гипопиона.

Одно из первых исследований роли CD3+ CD4+CD8+-лимфоцитов в патогенезе тяжелой патологии сетчатки глаза — возрастной макулярной дегенерации (ВМД) показало повышение абсолютного и относительного количества этих клеток и высокую частоту их выявления в крови пациентов с начальной и промежуточной стадиями ВМД, что позволило авторам предположить их возможную роль в патогенезе ВМД [1]. Следует отметить, что изучение роли дубль-позитивных лимфоцитов в офтальмопатологии только начинается.

Заключение

Несмотря на то, что наши результаты получены на ограниченном материале, они позволили выявили корреляционные связи между показателями гуморального иммунного ответа на индивидуальные антигены CMV и отдельными показателями субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови у пациентов с передними увеитами в зависимости от тяжести течения заболевания. Из 6 исследованных АГ CMV наиболее иммунореактивными оказались предранний антиген (IE), инициирующий начало литического цикла, и иммунодоминантный белок р65, участвующий в разных стадиях репликативного цикла вируса и в осуществлении программы ускользания СMV от иммунного ответа человека. Обнаружена статистически значимая заметная корреляционная связь между дубль-позитивными CD3+CD4+CD8+-клетками и CD19+-лимфоцитами и антителообразованием к четырем антигенам CMV у пациентов с гипопионом: прямая связь между дубль-позитивными лимфоцитами и антигенами IE, p65 и р28, обратная — между CD19+-лимфоцитами и антигенами IE, р52 и р65. Эти данные указывают на возможное влияние индивидуальных антигенов CMV на субпопуляционный состав лимфоцитов и иммунопатогенез передних увеитов. Полученные результаты показали перспективность выбранного направления исследований.

About the authors

Galina I. Krichevskaya

Helmholtz National Medical Research Center of Eye Diseases

Author for correspondence.
Email: gkri@yandex.ru

PhD (Medicine), Leading Researcher, Department of Immunology and Virology

Russian Federation, 105062, Moscow, Sadovaya-Chernogryazskaya str., 14/19

Natalya V. Balatskaya

Helmholtz National Medical Research Center of Eye Diseases

Email: gkri@yandex.ru

PhD (Biology), Leading Researcher, Department of Immunology and Virology, Head of the Department of Immunology and Virology

Russian Federation, 105062, Moscow, Sadovaya-Chernogryazskaya str., 14/19

Galina I. Alatortseva

I.I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Email: gkri@yandex.ru

PhD (Biology), Head of the Laboratory for Cloning Viral Genomes

Russian Federation, 105064, Москва, Малый Казенный переулок, д.5а

Ekaterina S. Sorozhkina

Helmholtz National Medical Research Center of Eye Diseases

Email: gkri@yandex.ru

Researcher, Department of Immunology and Virolog

Russian Federation, 105062, Moscow, Sadovaya-Chernogryazskaya str., 14/19

Lyudmila A. Kovaleva

Helmholtz National Medical Research Center of Eye Diseases

Email: gkri@yandex.ru

PhD (Medicine), Researcher, Department of Infectious and Allergic Eye Diseases

Russian Federation, 105062, Moscow, Sadovaya-Chernogryazskaya str., 14/19

Irina G. Kulikova

Helmholtz National Medical Research Center of Eye Diseases

Email: gkri@yandex.ru

Senior Researcher, Department of Immunology and Virology

Russian Federation, 105062, Moscow, Sadovaya-Chernogryazskaya str., 14/19

Vera V. Dotsenko

I.I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Email: gkri@yandex.ru

PhD (Biology), Senior Researcher, Laboratory for Cloning Viral Genomes

Russian Federation, 105064, Москва, Малый Казенный переулок, д.5а

Lyubov N. Nesterenko

I.I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Email: gkri@yandex.ru

PhD (Chemistry), Leading Researcher, Laboratory for Cloning Viral Genomes

Russian Federation, 105064, Moscow, Maly Kazenny Lane, 5a

Lyudmila N. Lukhverchik

I.I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Email: gkri@yandex.ru

PhD (Biology), Leading Researcher, Laboratory for Cloning Viral Genomes

Russian Federation, 105064, Москва, Малый Казенный переулок, д.5а

References

Supplementary files