Adhesiveness of the specific phages to yersiniae cells assessed by optical trapping

Full Text

Введение

Род Yersinia включает три вида патогенных для человека грамотрицательных бактерий: Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis, Y. pestis. Первые два вида являются энтеропатогенами, входными воротами для которых служит слизистая тонкого кишечника. Передаваясь алиментарным путем (с загрязненной пищей или водой), они вызывают сочетанный энтероколит с поражением Пейеровых бляшек и регионарных лимфатических узлов, нередко переходящий в хроническую форму [12, 15]. У пациентов с иммунодефицитными состояниями отмечается генерализованная септическая форма, смертность от которой составляет около 50% для кишечного иерсиниоза [5] и более 75% для псевдотуберкулеза [6]. Бактерии Y. pestis вызывают тяжелое системное заболевание, передаваемое либо через укус блох, либо аэрогенно.

Наряду с симптоматическими средствами в терапии иерсинозов успешно применяются антибиотики — главным образом цефалоспорины, макролиды и фторхинолоны. В последние годы описаны случаи резистентности иерсиний к препаратам налидиксовой кислоты [4]; ампициллину, левомицетину, тетрациклину [11] и доксициклину [3]. В связи с этим актуальна разработка иных, в том числе комбинированных, схем лечения бактериальных инфекций, основанных на использовании бактериофагов наряду с антибиотиками.

Преимуществами фаготерапии можно считать ее высокую специфичность, малую вероятность возникновения побочных эффектов, сохранение нормофлоры кишечника и слизистых оболочек [14]. Разработка средств фаготерапии предполагает проведение всесторонних исследований, включающих изучение механизмов взаимодействия бактериофагов с бактериальной клеткой в условиях in vitro и in vivo. Это в первую очередь касается идентификации структур на поверхности бактериальной клетки и фаговой частицы, ответственных за их взаимодействие, выявления условий, способствующих такому взаимодействию, количественной оценки силы формируемой связи. Последнее необходимо при обосновании качественного и количественного состава средств фаготерапии, которые, как считается, следует создавать в виде «коктейлей», состоящих из нескольких типов фагов, что должно обеспечивать антибактериальную активность препарата в отношении широкого спектра вирулентных штаммов возбудителя.

В настоящее время известен ряд специфичных в отношении Y. pestis литических бактериофагов, которые потенциально могут быть использованы для лечения чумы [7]. Один из них, бактериофаг д’Эрреля, в 20-х гг. прошлого века был успешно применен для лечения бубонной чумы — после введения препарата фага непосредственно в бубоны все четверо больных выздоровели [16]. В связи с разработкой промышленной технологии эффективных антибиотиков отпала необходимость применения фаготерапии инфекционных заболеваний. Однако появление и распространение в последние десятилетия антибиотикоустойчивости многих бактериальных патогенов, в том числе и Y. pestis, вновь возродило интерес к использованию фаготерапии. Появляются работы, свидетельствующие об эффективности применения чумных фагов в отношении бубонной (фаг фA1122) [9] и первично-легочной (фаги фA1122 и PST) [16] форм чумы.

В России в диагностических целях применяются три вида литических иерсиниозных бактериофагов — Покровской, L-413C и псевдотуберкулезный диагностический, различающихся по специфичности, вирулентности, морфологическим свойствам. Эти фаги мы и использовали в настоящей работе для оценки их адгезивности к клеткам Y. pestis и Y. pseudotuberculosis.

Бактериофаг Покровской (семейство Podoviridae) считается высоковирулентным в отношении Y. pestis [17]. Он также способен лизировать от 6,1 до 19% штаммов псевдотуберкулезного микроба [2]. Рецептор адгезии этого фага расположен на участке HepIII/HepII–HepI/Glc кора ЛПС клеток Y. pestis [2].

Бактериофаг L-413C (семейство Myoviridae) генетически близок энтеробактериофагу Р2 [13]. Из числа чумных фагов считается наиболее специфичным, лизируя подавляющее большинство штаммов Y. pestis и не взаимодействуя с клетками Y. pseudotuberculosis [2]. Имеет сократимый хвост и изометрическую головку. Рецептор связывания расположен на участке кора ЛПС HepIII/HepII(GlcNAc)–HepI/Glc [7].

Бактериофаг псевдотуберкулезный диагностический (или d’Herelle-m по Filippov и соавт. [8]) относится к семейству Podoviridae. Способен лизировать штаммы Y. pseudotuberculosis и Y. pestis. Рецептор связывания на поверхности клеток не установлен [10].

Цель работы заключалась в исследовании силы связи между бактериями рода Yersinia и специфическими фагами с использованием лазерной ловушки.

Материалы и методы

Штаммы. В работе использовали клетки Y. pseudotuberculosis (серотип O1b из коллекции ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» (кат. № 474)) и вакцинный штамм EV Y. pestis из коллекции ООО «Агровет», а также бактериофаги диагностический чумной Покровской, диагностический чумной L-413С и диагностический псевдотуберкулезный производства ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб».

Культивирование бактерий. Для оценки силовых характеристик взаимодействия в системе «бактериофаг–бактериальная клетка» методом лазерной ловушки культуры Y. pseudotuberculosis и Y. pestis выращивали на чашках Петри с БТН-агаром («Биотехновация») в течение ночи при температуре 37°С либо в течение двух суток при температуре 27°С соответственно.

Определение титра бактериофага проводили методом агаровых слоев Грациа [1] с незначительными модификациями. Готовили серию десятикратных разведений бактериофага в буфере SM (0,58% NaCl,0,2% MgSO₄ × 7H₂O,0,05 M Tris-HCl, pH 7,5). В стеклянных пробирках смешивали 1 мл соответствующего разведения бактериофага и 100 мкл суспензии бактерий тест-штамма в концентрации (2–3) × 10⁸ м.к./мл. Для адсорбции фаговых частиц на бактериальные клетки пробирки термостатировали на водяной бане при температуре 37°С в течение 20 мин для псевдотуберкулезного диагностического бактериофага, либо в течение 10 мин — для бактериофага Покровской. Затем в пробирки наливали по 3 мл 1,5% БТН-агара (Биотехновация), предварительно нагретого до температуры 47°С. Содержимое пробирки перемешивали интенсивным вращением в ладонях и выливали на чашки Петри с предварительно подсушенным нижним 3% БТН-агаром. Подсчет бляшек проводили для Y. pseudotuberculosis через 17–20 ч культивирования при температуре 37°С, для Y. pestis штамма EV — через 40–48 ч при температуре 27°С.

Сенсибилизация подложек вирионами фагов. Использовали пластиковые чашки «Fluorodish» (WPI, Германия) со стеклянным дном, которые предварительно подвергали процедуре аминирования. Для этого в отдельной емкости смешивали 10 мкл триэтиламина (Реахим) и 30 мкл 3-аминопропил-триэтоксисилана (APTES) (Sigma Aldrich, США), после чего помещали ее вместе с чашками в эксикатор и выдерживали в атмосфере аргона в течение 1,5 ч. Далее на поверхность чашек наносили последовательно 0,6 мкл EDC (Sigma Aldrich, США),900 мкл фосфатного буферного раствора (ФБР),30 мкл 0,46%-ного раствора N-гидроксисукцинимида (Sigma Aldrich, США) и 100 мкл суспензии того или иного фага в концентрации 1 × 10¹¹ БОЕ/мл. Инкубировали чашки 2 ч при комнатной температуре, пятикратно промывали деионизованной водой и блокировали 1%-ным раствором БСА на ФБР 1 ч. Повторяли промывку, осушали и хранили чашки в закрытом эксикаторе при температуре 4–6°С. Чашку «БСА» готовили так же, добавляя вместо фаговых препаратов равный объем 1%-ного БСА в ФБР.

Лазерный пинцет. Для оценки сил взаимодействия в модельной системе «микросфера — подложка» использовали лазерный пинцет JPK Nanotracker™ (JPK, Германия) на основе иттрий-гранатового источника инфракрасного излучения (ë = 1064 нм). Непосредственно перед проведением эксперимента в чашку «Flurodish», сенсибилизированную одним из трех бактериофагов, приливали 2,5 мл ФБР и 2–4 мкл микробной суспензии в концентрации 6 × 10⁹ м.к./мл. Тщательно перемешивали содержимое чашки и устанавливали ее на термостатируемую платформу с температурой +37°С.

Методика оценки сил межмолекулярного взаимодействия включала захват бактерий лазерной ловушкой при мощности лазера 1,2 Вт. Бактериальную клетку подводили ко дну чашки таким образом, чтобы расстояние между ними составляло около 1 мкм. С помощью пьезостолика прецизионно перемещали чашку в направлении неподвижной клетки с шагом 20 нм до момента их соприкосновения, который определяли по трем последовательным скачкам на хронограмме сигнала. Спустя 1 с после остановки запускали процесс отведения пьезостолика в обратном направлении в полуавтоматическом режиме со скоростью около 150 нм/с. Момент разрыва связи детектировали по скачкообразному изменению сигнала на хронограмме. Для пересчета первичного сигнала детектора в единицы силы применяли полученные ранее для полистирольных микросфер d = 1 мкм калибровочные коэффициенты чувствительности детектора (6,4 мВ/нм) и жесткости ловушки (0,26 пН/нм).

Первичные данные сохраняли в виде текстовых файлов, которые затем обрабатывали с использованием специализированного программного обеспечения JPK Processing. Статистический анализ проводили с использованием пакетов программ R, MatLab 7.0 и Statistica 12.

Результаты и обсуждение

Гистограммы распределения сил разрыва связи между фагами трех штаммов и клетками двух видов иерсиний приведены на рис. 1 и 2. При использованных условиях эксперимента возможны три варианта исхода измеряемого взаимодействия: 1 — разрыв формируемой связи,2 — «залипание» микробной клетки на поверхности покрытого бактериофагом дна чашки, когда мощности ловушки недостаточно для разрыва связи,3 — чрезвычайно слабое связывание, когда скачок сигнала отсутствует или не превосходит уровень «шума». На рис. 1 и 2 эти исходы обозначены как «отрывы», «нет отрыва» и «нулевые» соответственно.

 

Рисунок 1. Гистограммы распределения сил отрыва в системе «бактериофаг–бактериальная клетка» с указанием их средних значений и соотношения исходов взаимодействия для клеток Y. pseudotuberculosis

Figure 1. Histograms of rupture forces distribution in the «phage–bacterium» system with average values and outcomes ratio for Y. pseudotuberculosis cells

Примечание. А — фаг д‘Эрреля, Б — фаг Покровской, В — фаг L-413С, Г — БСА.

Note. A — d’Errel’s phage, B — Pokrovskaya’s phage, C — phage L-413C, D — BSA.

 

Существенные отличия в средней силе отрыва от стекла, покрытого разными фагами, отмечены для клеток Y. pseudotuberculosis, которые, как видно из рис. 1, специфически связывались только с фагом д’Эрреля (Fср. = 7,46±3,52 пН). В остальных группах значение показателя составило 4,51±2,23 пН (в группе «БСА»), а для двух других фагов было даже меньше — 3,05±1,09 пН для фага L-413С и 3,47±1,66 пН для фага Покровской. Средняя сила связи для чашки, обработанной фагом д’Эрреля, оказалась достоверно (р < 0,01) выше по сравнению с чашками, покрытыми двумя другими фагами и БСА. Доля «нулевых» исходов оказалась заметно выше для фагов L-413С (67%) и Покровской (55%), чем для фага д’Эрреля (34%). Доля зафиксированных отрывов в указанных группах менялась слабо и составила 16–22%. В контрольных группах («фаг Покровской», «L-413C», «БСА») более 80% отрывов лежали в диапазоне от 2 до 8 пН, в то время как в группе «фаг д’Эрреля» гистограмма смещалась вправо, достигая диапазона 16–18 пН.

Иная картина наблюдалась при работе с клетками Y. pestis. Средняя сила отрыва для чашек, обработанных тремя фагами, была выше сил, отмеченных для клеток Y. pseudotuberculosis (рис. 1,2). Ожидаемо высокой была доля необратимых связываний для «фаговых» подложек (46–60%) против 32% для «БСА». «Нулевые» опыты преобладали только в группе «БСА» (57%), в остальных случаях доля таких событий не превышала 25% («фаг Покровской») или была заметно ниже («фаг д’Эрреля). Гистограммы при использовании трех фагов отличались незначительно (рис. 2).

 

Рисунок 2. Гистограммы распределения сил отрыва с указанием их средних значений и соотношения исходов взаимодействия для клеток Y. pestis EV

Figure 2. Histograms of rupture forces distribution in the «phage–bacterium» system with average values and outcomes ratio for Y. pestis

Примечание. А — фаг д’Эрреля, Б — фаг Покровской, В — фаг L-413С, Г — БСА.

Note. A — d’Errel’s phage, B — Pokrovskaya’s phage, C — phage L-413C, D — BSA.

 

Таким образом, нами дана количественная оценка силы взаимодействия клеток двух видов иерсиний со специфическими бактериофагами методом оптической ловушки. Представленные результаты подтверждают данные литературы о высокой специфичности фагов Покровской и L-413C и неспособности фага д’Эрреля дифференцировать два близкородственных вида иерсиний — Y. pestis и Y. pseudotuberculosis, полученные с помощью микробиологических методов [8].

В настоящее время механизмы полного цикла взаимодействия микробной клетки иерсиний и специфических бактериофагов изучены недостаточно. В доступной литературе нет сведений об оценке адгезии фагов к поверхности иерсиний методом оптической ловушки. Ранее лазерный пинцет применялся лишь для изучения молекулярных взаимодействий между отдельными вирионами и минеральными подложками либо клетками эукариот. Предстоят дальнейшие исследования и начальных стадий такого взаимодействия, в том числе первичного контакта фага с рецепторным аппаратом бактерии с использованием молекулярно-генетических, иммунохимических, микробиологических, биофизических методов с целью разработки новых средств фаготерапии.

About the authors

Ilya V. Konyshev

Institute of Physiology of the Komi Scientific Center of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences; Vyatka State University

Email: konyshevil@yandex.ru

PhD (Biology), Senior Researcher, Laboratory of Microbial Physiology, Associate Professor, Department of Biotechnology, Institute of Biology and Biotechnology

Russian Federation, 167982, Syktyvkar, 50, Pervomayskaya street; 610000, Kirov, 36, Moskovskaya street, VyatSU, Biotechnology Department, 513a

Lyubov G. Dudina

Institute of Physiology of the Komi Scientific Center of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences; Vyatka State University

Email: necdew@mail.ru

PhD (Biology), Junior Researcher, Laboratory of Physiology of Microorganisms, Associate Professor, Department of Biotechnology

Russian Federation, 167982, Syktyvkar, 50, Pervomayskaya street; 610000, Kirov, 36, Moskovskaya street, VyatSU, Biotechnology Department, 513a

Nadezhda A. Morozova

Vyatka State University

Email: nadymor2000@gmail.com

MD Student, Department of Biotechnology 

Russian Federation, 610000, Kirov, 36, Moskovskaya street, VyatSU, Biotechnology Department, 513a

Andrey A. Byvalov

Institute of Physiology of the Komi Scientific Center of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences; Vyatka State University

Author for correspondence.
Email: byvalov@nextmail.ru

MD, PhD, Professor, Senior Researcher of the Center of Excellence, head of the Laboratory of Microbial Physiology

Russian Federation, 167982, Syktyvkar, 50, Pervomayskaya street; 610000, Kirov, 36, Moskovskaya street, VyatSU, Biotechnology Department, 513a

References

Supplementary files