The features of developing rat autoimmune pathology with mitochondrial dysfunction

Sergeii V. Skupnevskiy; Скупневский Сергей Валерьевич; Elena G. Pukhaeva; Пухаева Елена Георгиевна; Alibek K. Badtiev; Бадтиев Алибек Кирилович; Fatima K. Rurua; Руруа Фатима Карловна; Fatima E. Batagova; Батагова Фатима Эльбрусовна; Zhanna G. Farnieva; Фарниева Жанна Григорьевна

doi:10.15789/2220-7619-TFO-2038

The features of developing rat autoimmune pathology with mitochondrial dysfunction

Authors: Skupnevskiy S.V.¹, Pukhaeva E.G.¹, Badtiev A.K.¹, Rurua F.K.¹, Batagova F.E.¹, Farnieva Z.G.¹
Affiliations:
1. Institute of Biomedical Investigations — the Affiliate of Vladikavkaz Scientific Centre of RAS
Issue: Vol 13, No 1 (2023)
Pages: 161-166
Section: SHORT COMMUNICATIONS
Submitted: 23.09.2022
Accepted: 21.11.2022
Published: 01.04.2023
URL: https://iimmun.ru/iimm/article/view/2038
DOI: https://doi.org/10.15789/2220-7619-TFO-2038
ID: 2038

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

The central role of the mitochondria in energy supply and cell death determines highlight these organelles as one of the promising objects for investigating pathogenesis of immune-mediated inflammatory disorders. The aim: to study features of pathogenesis in rat adjuvant-induced autoimmune pathology separately and in combination with mitochondrial disorders. Materials and methods. Wistar rats were divided into groups of negative control (solvent), positive control (single subcutaneous injection of complete Freund’s adjuvant (CAF) at dose of 0.1 ml/200 g body weight), experimental (CAF 0.1 ml/200 g body weight and 5 weeks later — with cuprizone 0.2% per feed weight). At the end of experiment (7 weeks), animals were tested in the “open field” model, euthanized, and biomaterial was collected to measure the relative mass coefficients of internal organs, hematological and histological studies. We calculated the mean, standard error of the mean; comparison of hypotheses was carried out by paired Student’s t-test. Results. In case of impaired immunological tolerance there was detected reduced rat body weight gain during the study period (negative control +74.7 g, positive control +10.3 g) along with modelled mitochondrial dysfunction, a general decrease in weight by 6.7 g was noted. The magnitude of mass coefficients indicate a relative reduction in mass of liver, kidneys, spleen and thymus in experimental animals. The leukocyte counts (× 10⁹/L) are as follows: negative control — 8.68±0.37, positive control — 10.98±1.03 (p < 0.05), experimental group — 12.28±0.63 (p < 0.001). No significant changes were found in the leukocyte formula and the red cell lineage. During modelled autoimmune pathology, platelet count increased by 22.5% (p < 0.05), whereas after cuprizone was administered it decreased by 6.3% (relative to the negative control). Mitochondrial dysfunction caused an abrupt decrease in motor activity in rats: the number of crossed sectors in positive control animals was 55.50±6.91, experimental group — 44.50±3.60 (inter-group comparison, p < 0.001). Positive control: enlarged lymphatic nodules were found in the spleen, germinal center clarification, wall thickening of the pulpal and central arteries; single foci of hemorrhages in the red pulp. Experimental group: atrophy of lymphoid follicles of varying severity (relative to the groups of negative and positive controls), numerous foci of hemorrhages with hemosiderosis in the red pulp. Conclusion. Mitochondrial dysfunction is accompanied by augmented pathogenetic signs of autoimmune pathology, which can serve as one of the keys to understanding the mechanisms of human autoimmunity.

Keywords

autoimmune rheumatoid arthritis, cuprizone, Freund’s adjuvant, immunopathological process, mechanism of autoimmune pathology, mitochondrial dysfunction

Full Text

Введение

Интерес к изучению митохондрий в патогенезе аутоиммунных заболеваний обусловлен их центральной ролью в реализации механизмов клеточной смерти и в поддержании энергетического баланса, который резко изменяется после активации клеток иммунной системы. В работе [4] отмечается, что иммунная стимуляция приводит к высоким энергетическим затратам, в лимфоцитах кардинальным образом перестраивается метаболическая программа и происходит переход от окислительного фосфорилирования к аэробному гликолизу. Результатом перепрограммирования является 10–100-кратный выигрыш в скорости наработки АТФ [1], что позволяет осуществлять эффективную пролиферацию, дифференцировку и клональную экспансию клеток.

Митохондрии могут выступать триггерами в реакциях иммунного ответа, поскольку содержащиеся в них N-формильные пептиды и неметилированные CpG-сайты митохондриальной ДНК воспринимаются как чужеродные паттерн-распознающими рецепторами системы врожденного иммунитета, играя роль аларминов или DAMP (damage-associated molecular pattern) [2]. В этой связи в основе одного из механизмов формирования порочных кругов в патогенезе аутоиммунных заболеваний может лежать выход в кровь компонентов митохондриального матрикса вследствие иммуновоспалительных процессов, обусловливающих нарушение целостности клеточных мембран.

В работе [3] авторы отмечают, что немаловажную роль в функционировании иммунной системы играют активные формы кислорода (АФК). В частности, вырабатываемые в митохондриях АФК выступают в качестве мессенджеров, обеспечивают активацию основных иммунокомпетентных клеток, продукцию провоспалительных цитокинов и влияют на течение воспалительной реакции [3, 7]. Реакции адаптивного иммунитета, включая регуляцию функций Т-лимфоцитов, также протекают при участии АФК, вырабатываемых в митохондриях [6]. Нарушение окислительно-восстановительного баланса и избыточное производство АФК может выступать в качестве одной из ведущих причин возникновения аутоиммунных заболеваний [8]. Углубление знаний о роли митохондрий в этиопатогенезе иммунной системы может помочь раскрыть причинно-следственные связи в механизме заболеваний, объединяемых в иммуновоспалительный континуум, и открыть новые перспективы для таргетной терапии.

Цель — изучить особенности патогенеза в условиях адъювант-индуцированной аутоиммунной патологии на фоне митохондриальных нарушений.

Материалы и методы

Исследования проведены на самцах крыс линии Wistar с исходной массой тела 242±8 г. Животных приобретали в ФГУП «Питомник лабораторных животных «Рапполово». Доступ к воде и пище ad libitum. Все животные были рандомизировано разделены на 3 группы по 6 особей в каждой. Первая: негативный контроль — введение растворителей; вторая: позитивный контроль — однократное подкожное введение полного адъюванта Фрейнда (Difco Laboratories) из расчета 0,1 мл на 200 г массы тела; третья: опыт — введение ПАФ по схеме, аналогичной для группы № 2, а с пятой недели кормление предварительно измельченными гранулами экструдированного корма, содержащего 0,2% по массе купризона. По окончании эксперимента (7 недель) животных усыпляли в СО₂-боксе и из сердца отбирали кровь для гематологического анализа (Abacus Vet 5, Diatron, Венгрия).

В течение всего эксперимента еженедельно велся мониторинг массы тела животных, а перед его завершением крыс тестировали в модели «открытое поле» (ООО «НПК Открытая наука», Россия) в течение 3 мин. Регистрировали общую двигательную активность (пересечение секторов всеми лапами), общую вертикальную двигательную активность (стойки с опорой и без нее), количество обнюхиваний/заглядываний в норку.

После эвтаназии животных вскрывали и определяли массу органов: печени, почек, селезенки и тимуса. Массовые коэффициенты рассчитывали исходя из веса животных. Селезенку помещали в 10% нейтральный раствор формалина и подвергали гистологической проводке после предварительной фиксации в течение 72 ч. Срезы окрашивали гематоксилин-эозином и анализировали при увеличении 10×20 с помощью системы визуализации Evos 7000 (Thermo Fisher Scientific).

При работе с грызунами придерживались правил и этических норм, описанных в «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» (Страсбург, 18 марта 1986 г.) и с разрешения этического комитета при Институте биомедицинских исследований РАН.

Статистическую обработку проводили в программе Excel, рассчитывая среднее значение и стандартную ошибку среднего (M±m). Сравнение гипотез осуществляли по парному критерию Стьюдента. Значимыми считали различия при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

Введение животным ПАФ, представляющего собой водно-масляную эмульсию, содержащую в своем составе термически инактивированные бактерии M. tuberculosis, сопровождалось нарушением иммунной толерантности и развитием аутоиммунной патологии. Ее следствием явилось снижение массы тела экспериментальных животных, которое более ярко проявилось у крыс, получавших митохондриальный токсикант — купризон [9] (табл.).

Таблица. Результаты клинико-лабораторных исследований и поведенческих реакций животных

Table. Results of laboratory studies and behavioral reactions of animals

Анализируемый параметр Analyzed parameter	Стат. показатели Stat. indicators	Негативный контроль Negative control	Позитивный контроль Positive control	Опыт Experiment
Масса тела, г/Body weight, g
Изменение (7 нед.) Change (7 weeks)		+74,70	+10,30	–6,70
Массовые коэффициенты/Mass coefficients
Печень Liver	M±m	38,70±2,31	32,50±0,37	31,80±0,85
Печень Liver	р		< 0,05^#	< 0,05^## > 0,05^###
Почки Kidneys	M±m	6,78±0,30	6,13±0,07	6,41±0,19
Почки Kidneys	р		> 0,05^#	> 0,05^## > 0,05^###
Селезенка Spleen	M±m	2,73±0,51	2,55±0,18	2,55±0,15
Селезенка Spleen	р		> 0,05^#	> 0,05^## > 0,05^###
Тимус Thymus	M±m	1,05±0,07	1,10±0,19	1,01±0,12
Тимус Thymus	р		> 0,05^#	> 0,05^## > 0,05^###
Гематологические показатели/Hematological parameters
Лейкоциты, × 10⁹/л Leukocytes, × 10⁹/L	M±m	8,68±0,37	10,98±1,03	12,28±0,63
Лейкоциты, × 10⁹/л Leukocytes, × 10⁹/L	р		< 0,05^#	< 0,001^## > 0,05^###
Эритроциты, × 10¹²/л Erythrocytes, × 10¹²/L	M±m	8,60±0,17	8,93±0,19	9,12±0,20
Эритроциты, × 10¹²/л Erythrocytes, × 10¹²/L	р		> 0,05^#	> 0,05^## > 0,05^###
Гемоглобин, г/л Hemoglobin, g/L	M±m	14,54±0,14	15,28±0,30	14,88±0,32
Гемоглобин, г/л Hemoglobin, g/L	р		< 0,001^#	> 0,05^## > 0,05^###
Тромбоциты, × 10⁹/л Platelets, × 10⁹/L		511,33±52,99	626,50±33,19	479,00±29,49
Тромбоциты, × 10⁹/л Platelets, × 10⁹/L			< 0,05^#	> 0,05^## > 0,05^###
Поведенческие параметры/Behavioral parameters
Горизонтальная двигательная активность Horizontal movement	M±m	104±9,00	55,50±6,91	44,50±3,60
Горизонтальная двигательная активность Horizontal movement	р		< 0,001^#	< 0,001^## < 0,001^###
Вертикальная двигательная активность Vertical motor activity	M±m	37,33±8,03	15,50±0,96	15,83±2,29
	р		< 0,01^#	< 0,01^## > 0,05^###
Обнюхивание отверстий Hole sniffing	M±m	17,50 ±0,74	12,00±1,32	5,00±0,97
Обнюхивание отверстий Hole sniffing			< 0,01^#	< 0,001^## < 0,001^###

Примечание. Сравнение между: ^# — негативным и позитивным контролями; ^## — негативным контролем и опытом; ^### — позитивным контролем и опытом.

Note. Comparison between: ^# — negative and positive controls; ^## — negative control and experiment; ^### — positive control and experiment.

Прирост массы за экспериментальный период у интактных животных происходил равномерно, в среднем +12,6 г за неделю. Введение ПАФ привело к резкому сокращению набора массы — в первые пять недель до +2,8 г, а затем выявилась отрицательная динамика –1,0 г в группе позитивного контроля и –6,3 г в опытной группе, которая начала получать с кормом хелатор ионов меди, служащей кофактором цитохром-с-оксидазы [10]. Конечным следствием нарушения энергопродукции в митохондриях явилась более резкая потеря массы у крыс опытной группы по сравнению с животными позитивного контроля. Анализ значений массовых коэффициентов показал, что на фоне формируемой патологии произошло относительное уменьшение массы жизненно важных органов, выполняющих метаболическую, выделительную и иммунную функцию.

Адъювант-индуцированный аутоиммунный воспалительный процесс сопровождался достоверным повышением уровня лейкоцитов в крови. При этом важно подчеркнуть, что на фоне купризона выраженность реакций со стороны клеточного звена иммунной системы оказалась выше. Значительных различий в лейкоцитарной формуле контрольных и экспериментальных групп не выявлено: лимфоциты определялись в диапазоне 63–65%, моноциты — 3–4%, нейтрофилы — 31–34%. Различия между крайними значениями для эритроцитов не превысили 6%, а статистическая проверка гипотезы показала, что все средние значения принадлежат к одной совокупности. При этом качественный состав эритроцитов изменялся незначительно: пределами цветового показателя служили значения 0,49–0,51. Наиболее выраженные сдвиги затронули мегакариоцитарный росток: количество кровяных пластинок у животных позитивного контроля увеличилось на 22,5% относительно негативного контроля, а в опытной — наоборот, уменьшилось на 6,3%. Последнее обстоятельство может объясняться дефектами в работе тромбоцитарных митохондрий и сокращением времени их жизни и циркуляции в кровяном русле.

Значительным изменениям подверглись характер и структура поведения экспериментальных животных. Снижение общей локомоторной активности может быть объяснено одним из проявлений ПАФ — индукцией и последующим развитием аутоиммунного ревматоидного артрита [5]. В этом аспекте двигательные паттерны могут быть использованы в качестве чувствительного индикатора, отражающего течение и глубину системного воспалительного процесса. Здесь также проявилась общая закономерность: объем двигательной активности и выраженность исследовательского рефлекса у животных с митохондриальной патологией снизился, а различия между опытной группой и позитивным контролем оказались статистически значимыми.

Изменения, затронувшие один из органов иммунной системы, — селезенку, отражены на рисунке (вклейка, с. I).

Рисунок. Микрофотографии селезенки крыс: лимфоидные узелки и участки красной пульпы (увеличение 10×20): А) негативный контроль; Б) позитивный контроль; В) опыт

Во всех случаях гистоархитектоника селезенки не нарушена. Ткани животных из группы негативного контроля характеризовались нормальным строением всех структурно-функциональных зон; в отдельных случаях выявлялся венозный застой. Для животных позитивного контроля характерным оказалось разрастание лимфатических узелков, просветление герминативных центров, уплотнение стенок пульпарных и центральных артерий; в красной пульпе обнаруживались единичные очаги кровоизлияний. Степень дистрофических изменений от умеренной до выраженной. На гистологических препаратах у крыс опытной группы в качестве характерных признаков можно отметить различную по выраженности атрофию лимфоидных фолликулов (относительно группы негативного и позитивного контролей), в красной пульпе многочисленные очаги кровоизлияний с гемосидерозом; синусы расширены. Спектр дистрофических изменений — от выраженной до тяжелой степени.

Таким образом, усугубление течения аутоиммунной патологии на фоне дисфункции митохондрий позволяет выделить их в качестве одного из ключевых звеньев в механизме иммунно-воспалительных заболеваний, а разработка высокоэффективной терапии должна включать восстановление и поддержание энергетического баланса организма.