Quantitative and qualitative composition of lymphocyte populations and subpopulations in patients with varying severity of a new coronavirus infection

Inna A. Ivanova; Иванова Инна Александровна; A. A. Trufanova; Труфанова А. А.; A. V. Filippenko; Филиппенко А. В.; N. D. Omelchenko; Омельченко Н. Д.; A. K. Noskov; Носков А. К.; O. S. Chemisova; Чемисова О. С.

doi:10.15789/2220-7619-QAQ-1818

Quantitative and qualitative composition of lymphocyte populations and subpopulations in patients with varying severity of a new coronavirus infection

Authors: Ivanova I.A.¹, Trufanova A.A.¹, Filippenko A.V.¹, Omelchenko N.D.¹, Noskov A.K.¹, Chemisova O.S.¹
Affiliations:
1. Rostov-on-Don Anti-Plague Institute of Rospotrebnadzor
Issue: Vol 12, No 3 (2022)
Pages: 505-510
Section: ORIGINAL ARTICLES
Submitted: 09.11.2021
Accepted: 13.02.2022
Published: 04.07.2022
URL: https://iimmun.ru/iimm/article/view/1818
DOI: https://doi.org/10.15789/2220-7619-QAQ-1818
ID: 1818

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

SARS-CoV-2 can cause a decrease in the number of lymphocytes and their functional activity. In patients with COVID-19, especially with a severe course of the disease, a decrease in the quantitative composition of the main populations of lymphocytes is recorded. These indicators do not recover for a long time after recovery. However, it is still not known how long the quantitative and qualitative changes in the composition of lymphocytes will last and whether the severity of the infection affects this process. The aim of our study was to assess the quantitative and qualitative composition of the main populations and subpopulations of lymphocytes in patients with a new coronavirus infection of varying severity. 65 patients with a new coronavirus infection were examined. The average age of the subjects was 47.3±14.5 years. The volunteers were divided into three groups according to the severity of the infection: asymptomatic (n = 21); moderate (n = 32); severe (n = 12). The relative and absolute number of T-lymphocytes (CD3⁺), T-helper cells (CD3⁺CD4⁺), cytotoxic lymphocytes (CD3⁺CD8⁺), natural killers (CD3^–CD16⁺CD56⁺), TNK-lymphocytes (CD3⁺CD16^–CD56⁺) and B-lymphocytes (CD45⁺CD19⁺) were determined. To calculate the percentage of lymphocytes, whole blood was lysed with OPTILYSE C solution (Beckman Coulter, USA) and stained with monoclonal antibodies CD3⁺-FITC/CD8⁺-ECD/CD4⁺-PC5/CD16⁺CD56⁺PE and CD45⁺-Pacific Blue/CD19⁺-PC5 (Beckman Coulter, USA). Cytofluorometry was performed on a flow cytofluorometer “Navios™” (Beckman Coulter, USA). The results of our studies showed that there were no statistically significant changes in the relative and absolute number of immunocompetent cells in asymptomatic patients with a new coronavirus infection, compared with the control group. With an average severity of the disease, a decrease in the relative and absolute content of CD3⁺ and CD8⁺ lymphocytes was revealed, these indicators were restored to control values six months after recovery. In patients with severe infection, there was a decrease in the relative and absolute number of T cells and cytotoxic lymphocytes. These values remained significantly below normal for six months and returned to normal only seven to eight months after recovery. Also, the volunteers of this group were found to have a decrease in the number of natural killers and TNK cells. Thus, the data obtained by us indicate that pathological changes concerning the relative and absolute number of the main populations and subpopulations of lymphocytes in patients with COVID-19 depend on the severity of the disease. The number of T-lymphocytes, cytotoxic lymphocytes, natural killer cells, that is, populations of cells that play a crucial role in effective antiviral protection, has been reduced in those who have undergone a new coronavirus infection in moderate and severe form. This information can be useful for expanding methodological approaches to the diagnosis, treatment of a new coronavirus infection, as well as measures for the rehabilitation of those who have suffered it.

Keywords

COVID-19, populations and subpopulations of lymphocytes, T-lymphocytes, cytotoxic lymphocytes, natural killers

Full Text

Введение

Лимфоцитопения является типичным клиническим симптомом COVID-19 [11], причем снижение числа лимфоцитов предшествует развитию пневмонии с характерными изменениями в виде матового стекла в легких [7]. Данные клинического анализа крови более тысячи пациентов за первые два месяца эпидемии в Китае свидетельствуют о том, что при поступлении у 83,2% заболевших наблюдалась лимфоцитопения, у 36,2% обнаружена тромбоцитопения, а у 33,7% — лейкопения. Эти нарушения были более выраженными в случае тяжелого течения болезни по сравнению с инфекцией средней степени тяжести (96,1 и 80,4% — лимфоцитопения, 57,7 и 31,6% — тромбоцитопения, 61,1 и 8,1% — лейкопения соответственно) [5]. По другим источникам, лимфопения была выявлена у 63% [6] и 70,3% [16] пациентов, инфицированных новым коронавирусом в Ухане. Причем, наиболее выраженное снижение числа лимфоцитов наблюдалось у пациентов отделения интенсивной терапии [12].

Показано, что возбудитель COVID-19 действует главным образом на лимфоциты, и, в частности, на Т-клетки [14]. У многих пациентов, особенно с тяжелым течением заболевания, описано снижение количества Т-лимфоцитов [1], а также нарушение функции CD4⁺, CD8⁺Т-клеток и натуральных киллеров (NK-клеток) [9]. SARS-CoV-2 может нарушать функцию Т-хелперов и регуляторных Т-лимфоцитов, вызывая раннюю гиперактивацию, за которой следует быстрое истощение цитотоксических T-клеток [12, 18].

Перенесенная инфекция патологически влияет на лимфоциты и после клинического выздоровления и приводит к длительным дисфункциям, длящимся от 4 до 11 недель [17]. Число этих клеток после выздоровления постепенно повышается до нормального диапазона. Однако до сих пор неизвестно, как долго сохраняются количественные и качественные изменения в составе лимфоцитов и влияет ли на этот процесс тяжесть перенесенной инфекции.

Целью нашего исследования являлась оценка количественного и качественного состава основных популяций и субпопуляций лимфоцитов у перенесших новую коронавирусную инфекцию разной степени тяжести.

Материалы и методы

Было обследовано 65 переболевших новой коронавирусной инфекцией. Средний возраст обследуемых составил 47,3±14,5 года. Волонтеров распределили на три группы по степени тяжести перенесенной инфекции: бессимптомно — 21 человек (7 мужчин, 14 женщин); средней степени тяжести — 32 человека (9 мужчин, 23 женщины); в тяжелой форме — 12 человек (3 мужчины, 9 женщин). Бессимптомное течение заболевания подтверждалось положительным тестом ПЦР/наличием специфических антител при отсутствии клинических симптомов. У волонтеров со средней степенью тяжести инфекции при положительном тесте ПЦР присутствовали симптомы ОРВИ без поражения легких. В группу с тяжелым течением заболевания были включены пациенты с положительным тестом ПЦР и поражением 30 и более процентов легких. Группу контроля составили 8 здоровых человек (женщин) в возрасте 35,5±3,46 лет (ПЦР-тест отрицательный, специфические антитела отсутствуют, признаков ОРВИ не отмечено).

От всех пациентов было получено добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

Взятие крови осуществляли в утренние часы натощак путем пункции локтевой вены. Для иммунофенотипирования кровь забирали в пробирку VACUTAINER (BD), содержащую динатриевую соль ЭДТА.

Определяли относительное и абсолютное количество T-лимфоцитов (CD3⁺), T-хелперов (CD3⁺CD4⁺), цитотоксических лимфоцитов (CD3⁺CD8⁺), натуральных киллеров (NK) (CD3^–CD16⁺CD56⁺), TNK-лимфоцитов (CD3⁺CD16^–CD56⁺) и В-лимфоцитов (CD45⁺CD19⁺) Для подсчета процентного содержания клеток цельную кровь лизировали раствором OPTILYSE С (Beckman Coulter, США) и окрашивали моноклональными антителами CD3⁺-FITC/CD8⁺-ECD/ CD4⁺-PC5/CD16⁺CD56⁺PЕ и CD45⁺-Pacific Blue/ CD19⁺-PC5 (Beckman Coulter, США). Цитофлюорометрию осуществляли на проточном цитофлюориметре «Naviоs™» (Beckman Coulter, США), оценивали не менее 10 тыс. событий.

Определяли общее число лейкоцитов (WBC) по формуле:

$WBC = а \times 50 \times 106 / л$ ,

где а — число подсчитанных в камере Горяева лейкоцитов.

Расчет абсолютного количества лимфоцитов производили по формуле: WBC × (%)/100.

Статистическая обработка полученных результатов осуществлялась с использованием пакета прикладных программ Statistica 8.0 (StatSoft Inc., 2007). Определяли среднее арифметическое значение ± стандартное квадратичное отклонение. Достоверность различий между показателями независимых выборок оценивали по непараметрическому критерию Манна–Уитни.

Результаты

Анализ результатов исследования относительного содержания основных популяций и субпопуляций лимфоцитов у бессимптомно переболевших новой коронавирусной инфекцией свидетельствует об отсутствии статистически значимых изменений количества иммунокомпетентных клеток по сравнению с контрольной группой (табл. 1).

Таблица 1. Относительное содержание (%) основных популяций и субпопуляций лимфоцитов в крови волонтеров, перенесших COVID-19

Table 1. Relative content (%) of the main populations and subpopulations of lymphocytes in the blood of volunteers who have recovered from COVID-19

Популяции Populations	Контрольная группа Control group	Течение заболевания/Course of the disease
		бессимптомное/asymptomatic (n = 21)			средней степени/moderate (n = 32)			тяжелое/severe (n = 12)
		через 3–4 месяца after 3–4 months	через 5–6 месяцев after 5–6 months	через 7–8 месяцев after 7–8 months	через 3–4 месяца after 3–4 months	через 5–6 месяцев after 5–6 months	через 7–8 месяцев after 7–8 months	через 3–4 месяца after 3–4 months	через 5–6 месяцев after 5–6 months	через 7–8 месяцев after 7–8 months
Т-лимфоциты (CD3⁺) Т-lymphocytes (CD3⁺)	63,7±2,3	59,7±4,7	59,1±3,1	59,1±3,8	56,1±3,1*	58,8±4,2	58,9±3,8	50,3±3,4*	53,1±3,3*	57,8±3,1
Т-хелперы (CD3⁺CD4⁺) Т-helphers (CD3⁺CD4⁺)	42,6±2,2	41,7±2,2	42±2,1	40,9±2,0	36,4±2,0	37,1±3,7	38,5±3,7	35,2±3,1	36,1±3,3	41,8±2,3
Т-цитотоксические (CD3⁺CD8⁺) Cytotoxic Т cells (CD3⁺CD8⁺)	22,3±2,2	20,3±1,8	19,1±2,5	21,0±1,9	17,3±1,0*	20,7±2,8	21,4±2,0	15,4±2,0*	16,3±1,8*	18,9±2,5
Натуральные киллеры (CD3^–CD16⁺CD56⁺) Natural killers (CD3^–CD16⁺CD56⁺)	8,5±2,14	9,6±2,14	10,4±2,0	11,1±2,1	7,9±2,4	9,3±2,1	10,3±2,1	3,4±1,14^, *	4,6±1,4**	7,2±2,1
Т-Натуральные киллеры (CD3⁺CD16^–CD56⁺) Т-Natural killers (CD3⁺CD16^–CD56⁺)	5,7±1,5	4,9±1,58	5,2±1,3	4,7±1,8	5,0±1,8	5,5±1,58	5,2±1,8	2,5±1,58^, *	4,5±1,58	5,5±1,2
В-лимфоциты (CD19⁺) В-lymphocytes (CD19⁺)	9,0±1,5	8,5±2,5	7,5±1,5	8,0±2,1	7,8±2,0	7,7±1,2	7,1±1,5	6,9±3,5	8,0±1,5	7,5±1,9

Примечание. * — достоверное отличие от нормы (p < 0,05); ** — достоверное отличие от показателя в эти сроки при заболевании средней тяжести (p < 0,05).

Note. * — significant difference from the norm (p < 0,05); ** — significant difference compared to that of at any timepoints in moderate disease (p < 0,05).

У пациентов, перенесших инфекцию средней степени тяжести, через 3–4 месяца после заболевания выявлено снижение относительного количества CD3⁺- и CD8⁺-лимфоцитов, остальные популяции находились в пределах нормы. Через полгода после выздоровления число Т-клеток и цитотоксических лимфоцитов у волонтеров этой группы восстановилось до контрольных показателей.

Достоверные отличия от контрольных значений были выявлены при обследовании людей, перенесших COVID-19 в тяжелой форме. Эти изменения, по сравнению с контролем, характеризовались снижением относительного количества Т-лимфоцитов, особенно через 3–4 месяца после заболевания. Одновременно у волонтеров регистрировалось уменьшение числа CD8⁺-лимфоцитов, NK-клеток, а также Т-натуральных киллеров (ТNK) по сравнению с нормальными значениями. Следует отметить, что через полгода после перенесенного заболевания у обследуемых этой группы сохранялось низкое, относительно контроля, количество Т-клеток и цитотоксических лимфоцитов. Только через 7–8 месяцев эти нарушенные показатели нормализовались, относительное количество иммунокомпетентных клеток соответствовало возрастным критериям обследуемых.

Результаты оценки показателей у перенесших инфекцию в средней и тяжелой форме не выявили достоверных отличий по относительному содержанию CD3⁺-, CD4⁺-, CD8⁺-, CD19⁺-лимфоцитов. Достоверное, по сравнению с аналогичными показателями у волонтеров, перенесших заболевание в средней форме, уменьшение числа NK и TNK-клеток было зарегистрировано нами у тяжелопереболевших, особенно через 3–4 месяца после выздоровления.

Анализ абсолютного количества лимфоцитов продемонстрировал снижение, по сравнению с контрольной группой, CD3⁺- и CD8⁺-клеток у переболевших COVID-19 в средней форме (табл. 2). Эти показатели нормализовались только через полгода после выздоровления.

Таблица 2. Абсолютное содержание (× 10⁹/л) основных популяций и субпопуляций лимфоцитов в крови пациентов, перенесших COVID-19

Table 2. The absolute content (× 10⁹/l) of the main populations and subpopulations of lymphocytes in the blood of patients who have recovered from COVID-19

Популяции Populations	Контрольная группа Control group	Течение заболевания/Course of the disease
		бессимптомное/asymptomatic (n = 21)			средней степени/moderate (n = 32)			тяжелое/severe (n = 12)
		через 3–4 месяца after 3–4 months	через 5–6 месяцев after 5–6 months	через 7–8 месяцев after 7–8 months	через 3–4 месяца after 3–4 months	через 5–6 месяцев after 5–6 months	через 7–8 месяцев after 7–8 months	через 3–4 месяца after 3–4 months	через 5–6 месяцев after 5–6 months	через 7–8 месяцев after 7–8 months
Т-лимфоциты (CD3⁺) Т-lymphocytes (CD3⁺)	1,21±0,03	1,05±0,1	1,14±0,06	1,13±0,08	0,97±0,07*	1,1±0,05	1,12±0,08	0,77±0,04^, *	0,81±0,1^, *	1,14±0,06
Т-хелперы (CD3⁺CD4⁺) Т-helphers (CD3⁺CD4⁺)	1,0±0,04	0,91±0,06	1,0±0,06	1,1±0,03	0,92±0,08	1,02±0,06	1,0±0,06	0,89±0,05	0,86±0,07	1,0±0,08
Т-цитотоксические (CD3⁺CD8⁺) Cytotoxic Т cells (CD3⁺CD8⁺)	0,45±0,02	0,46±0,02	0,45±0,03	0,45±0,06	0,31±0,04*	0,39±0,03	0,40±0,06	0,30±0,04*	0,32±0,03*	0,41±0,06
Натуральные киллеры (CD3^–CD16⁺CD56⁺) Natural killers (CD3^–CD16⁺CD56⁺)	0,21±0,04	0,22±0,04	0,19±0,06	0,2±0,04	0,19±0,02	0,2±0,03	0,19±0,04	0,1±0,02^, *	0,2±0,07	0,19±0,08
Т-Натуральные киллеры (CD3⁺CD16^–CD56⁺) Т-Natural killers (CD3⁺CD16^–CD56⁺)	0,09±0,03	0,08±0,03	0,09±0,02	0,09±0,03	0,07±0,02	0,08±0,02	0,09±0,04	0,06±0,02	0,07±0,02	0,09±0,02
В-лимфоциты (CD19⁺) В-lymphocytes (CD19⁺)	0,21±0,03	0,19±0,02	0,21±0,05	0,20±0,02	0,18±0,06	0,19±0,05	0,19±0,03	0,2±0,06	0,18±0,07	0,18±0,03

Note. * — reliable difference from the norm (p < 0,05); ** — significant difference compared to that of at any timepoints in moderate disease (p < 0,05).

Наиболее выраженная Т-лимфоцитопения, сохраняющаяся до шести месяцев, наблюдалась у пациентов с тяжелым течением коронавирусной инфекции. Также в этой группе было снижено абсолютное число CD8⁺-лимфоцитов. Эти показатели достигли контрольных значений только через 7–8 месяцев после перенесенного заболевания. Также у волонтеров, перенесших COVID-19 в тяжелой форме, регистрировалось уменьшение натуральных киллеров, нормальное количество которых восстанавливалось через 5–6 месяцев после выздоровления.

Таким образом, при оценке количественного и качественного состава основных популяций и субпопуляций лимфоцитов у перенесших новую коронавирусную инфекцию разной степени тяжести выявлено, что SARS-CoV-2 снижает относительное и абсолютное количество Т-клеток, цитотоксических лимфоцитов, натуральных киллеров, то есть популяций клеток, играющих решающую роль в эффективной противовирусной защите.

Обсуждение

Накопленные в настоящее время данные свидетельствуют о том, что у пациентов с COVID-19 нарушены многие лабораторные показатели, и некоторые из них могут являться значимыми предикторами неблагоприятных клинических исходов. Таким фактором, наряду с увеличением количества лейкоцитов и нейтрофилов, является снижение числа лимфоцитов [8]. Лимфоцитопения описана как типичный клинический симптом у пациентов с COVID-19 многими исследователями, однако механизмы и причины ее возникновения еще остаются не до конца раскрытыми. Доказано, что подобно другим вирусам, SARS-CoV-2 может вызывать снижение количества лимфоцитов и их функциональной активности несколькими способами: первый — нарушение лимфопоэза, второй — апоптоз и разрушение этих клеток, третий — снижение числа циркулирующих лимфоцитов за счет прикрепления их к сосудистому эндотелию [13]. У пациентов с COVID-19, особенно в тяжелых случаях, регистрируется снижение количества и нарушение функции Т-хелперов, а также цитотоксических лимфоцитов и натуральных киллеров [4, 10], то есть популяций, имеющих решающее значение для контроля внутриклеточных инфекций. Эти показатели не восстанавливаются в течение нескольких месяцев, что свидетельствует о том, что SARS-CoV-2 достаточно сильно поражает лимфоциты, вызывая дисфункции даже после клинического выздоровления [17], а степень этих изменений коррелирует с тяжестью инфекционного процесса [9, 15].

Результаты наших исследований показали, что у бессимптомно переболевших новой коронавирусной инфекцией статистически значимых изменений относительного и абсолютного количества иммунокомпетентных клеток, по сравнению с контрольной группой, зарегистрировано не было. При средней степени тяжести заболевания выявлено снижение относительного и абсолютного содержания CD3⁺- и CD8⁺-лимфоцитов. Эти показатели восстанавливались до контрольных значений через полгода после выздоровления. У пациентов с тяжелой формой перенесенной инфекции наблюдалось уменьшение относительного и абсолютного количества Т-клеток и цитотоксических лимфоцитов. Эти значения оставались значительно ниже нормы в течение полугода и нормализовались только через 7–8 месяцев после выздоровления. Также у волонтеров этой группы было обнаружено уменьшение числа натуральных киллеров и ТNK-клеток. Полученные нами данные согласуются с результатами других исследователей, свидетельствующих о том, что количество лимфоцитов, особенно Т-клеток, у перенесших COVID-19 значительно снижено [2, 11, 14]. У пациентов, особенно в тяжелых случаях, регистрировалось также уменьшение CD4⁺-, CD8⁺-лимфоцитов, NK-клеток, сопровождающееся функциональным нарушением [4, 9, 10, 17]. Полученные в ходе проведенных нами исследований сведения могут быть полезны для расширения методических подходов к диагностике, лечению новой коронавирусной инфекции, а также мер по реабилитации перенесших ее лиц.