Quantitative and qualitative composition of lymphocyte populations and subpopulations in patients with varying severity of a new coronavirus infection

Inna A. Ivanova; Иванова Инна Александровна; A. A. Trufanova; Труфанова А. А.; A. V. Filippenko; Филиппенко А. В.; N. D. Omelchenko; Омельченко Н. Д.; A. K. Noskov; Носков А. К.; O. S. Chemisova; Чемисова О. С.

doi:10.15789/2220-7619-QAQ-1818

Количественный и качественный состав популяций и субпопуляций лимфоцитов у перенесших новую коронавирусную инфекцию разной степени тяжести

Авторы: Иванова И.А.¹, Труфанова А.А.¹, Филиппенко А.В.¹, Омельченко Н.Д.¹, Носков А.К.¹, Чемисова О.С.¹
Учреждения:
1. ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора
Выпуск: Том 12, № 3 (2022)
Страницы: 505-510
Раздел: ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Дата подачи: 09.11.2021
Дата принятия к публикации: 13.02.2022
Дата публикации: 04.07.2022
URL: https://iimmun.ru/iimm/article/view/1818
DOI: https://doi.org/10.15789/2220-7619-QAQ-1818
ID: 1818

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

SARS-CoV-2 может вызывать снижение количества лимфоцитов и их функциональной активности. У пациентов с COVID-19, особенно с тяжелым течением заболевания, регистрируют уменьшение количественного состава основных популяций лимфоцитов. Эти показатели не восстанавливаются длительное время после выздоровления. Однако до сих пор неизвестно, как долго продлятся количественные и качественные изменения в составе лимфоцитов, и влияет ли на этот процесс тяжесть перенесенной инфекции. Целью нашего исследования являлась оценка количественного и качественного состава основных популяций и субпопуляций лимфоцитов у перенесших новую коронавирусную инфекцию разной степени тяжести. Было обследовано 65 переболевших новой коронавирусной инфекцией. Средний возраст обследуемых составил 47,3±14,5 года. Волонтеров распределили на три группы по степени тяжести перенесенной инфекции: бессимптомно (n = 21); средней степени тяжести (n = 32); в тяжелой форме (n = 12). Определяли относительное и абсолютное число T-лимфоцитов (CD3⁺), T-хелперов (CD3⁺CD4⁺), цитотоксических лимфоцитов (CD3⁺CD8⁺), натуральных киллеров (CD3^–CD16⁺CD56⁺), TNK-лимфоцитов (CD3⁺CD16^–CD56⁺) и В-лимфоцитов (CD45⁺CD19⁺). Для подсчета процентного содержания лимфоцитов цельную кровь лизировали раствором OPTILYSE С (Beckman Coulter, США) и окрашивали моноклональными антителами CD3⁺-FITC/CD8⁺-ECD/CD4⁺-PC5/CD16⁺CD56⁺PЕ и CD45⁺-Pacific Blue/CD19⁺-PC5 (Beckman Coulter, США). Цитофлюорометрию осуществляли на проточном цитофлюориметре «Naviоs™» (Beckman Coulter, США). Результаты наших исследований показали, что у бессимптомно переболевших новой коронавирусной инфекцией статистически значимых изменений относительного и абсолютного количества иммунокомпетентных клеток, по сравнению с контрольной группой, зарегистрировано не было. При средней степени тяжести заболевания выявлено снижение относительного и абсолютного содержания CD3⁺- и CD8⁺-лимфоцитов, эти показатели восстанавливались до контрольных значений через полгода после выздоровления. У пациентов с тяжелой формой перенесенной инфекции наблюдалось уменьшение относительного и абсолютного количества Т-клеток и цитотоксических лимфоцитов. Эти значения оставались значительно ниже нормы в течение полугода и нормализовались только через 7–8 месяцев после выздоровления. Также у волонтеров этой группы было обнаружено уменьшение числа натуральных киллеров и ТNK-клеток. Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что патологические изменения, касающиеся относительного и абсолютного количества основных популяций и субпопуляций лимфоцитов у переболевших COVID-19, зависят от тяжести перенесенного заболевания. У перенесших новую коронавирусную инфекцию в средней и тяжелой форме снижено число Т-лимфоцитов, цитотоксических лимфоцитов, натуральных киллеров, то есть популяций клеток, играющих решающую роль в эффективной противовирусной защите. Эти сведения могут быть полезны для расширения методических подходов к диагностике, лечению новой коронавирусной инфекции, а также мер по реабилитации перенесших ее лиц.

Ключевые слова

COVID-19, популяции и субпопуляции лимфоцитов, Т-лимфоциты, цитотоксические лимфоциты, натуральные киллеры

Полный текст

Введение

Лимфоцитопения является типичным клиническим симптомом COVID-19 [11], причем снижение числа лимфоцитов предшествует развитию пневмонии с характерными изменениями в виде матового стекла в легких [7]. Данные клинического анализа крови более тысячи пациентов за первые два месяца эпидемии в Китае свидетельствуют о том, что при поступлении у 83,2% заболевших наблюдалась лимфоцитопения, у 36,2% обнаружена тромбоцитопения, а у 33,7% — лейкопения. Эти нарушения были более выраженными в случае тяжелого течения болезни по сравнению с инфекцией средней степени тяжести (96,1 и 80,4% — лимфоцитопения, 57,7 и 31,6% — тромбоцитопения, 61,1 и 8,1% — лейкопения соответственно) [5]. По другим источникам, лимфопения была выявлена у 63% [6] и 70,3% [16] пациентов, инфицированных новым коронавирусом в Ухане. Причем, наиболее выраженное снижение числа лимфоцитов наблюдалось у пациентов отделения интенсивной терапии [12].

Показано, что возбудитель COVID-19 действует главным образом на лимфоциты, и, в частности, на Т-клетки [14]. У многих пациентов, особенно с тяжелым течением заболевания, описано снижение количества Т-лимфоцитов [1], а также нарушение функции CD4⁺, CD8⁺Т-клеток и натуральных киллеров (NK-клеток) [9]. SARS-CoV-2 может нарушать функцию Т-хелперов и регуляторных Т-лимфоцитов, вызывая раннюю гиперактивацию, за которой следует быстрое истощение цитотоксических T-клеток [12, 18].

Перенесенная инфекция патологически влияет на лимфоциты и после клинического выздоровления и приводит к длительным дисфункциям, длящимся от 4 до 11 недель [17]. Число этих клеток после выздоровления постепенно повышается до нормального диапазона. Однако до сих пор неизвестно, как долго сохраняются количественные и качественные изменения в составе лимфоцитов и влияет ли на этот процесс тяжесть перенесенной инфекции.

Целью нашего исследования являлась оценка количественного и качественного состава основных популяций и субпопуляций лимфоцитов у перенесших новую коронавирусную инфекцию разной степени тяжести.

Материалы и методы

Было обследовано 65 переболевших новой коронавирусной инфекцией. Средний возраст обследуемых составил 47,3±14,5 года. Волонтеров распределили на три группы по степени тяжести перенесенной инфекции: бессимптомно — 21 человек (7 мужчин, 14 женщин); средней степени тяжести — 32 человека (9 мужчин, 23 женщины); в тяжелой форме — 12 человек (3 мужчины, 9 женщин). Бессимптомное течение заболевания подтверждалось положительным тестом ПЦР/наличием специфических антител при отсутствии клинических симптомов. У волонтеров со средней степенью тяжести инфекции при положительном тесте ПЦР присутствовали симптомы ОРВИ без поражения легких. В группу с тяжелым течением заболевания были включены пациенты с положительным тестом ПЦР и поражением 30 и более процентов легких. Группу контроля составили 8 здоровых человек (женщин) в возрасте 35,5±3,46 лет (ПЦР-тест отрицательный, специфические антитела отсутствуют, признаков ОРВИ не отмечено).

От всех пациентов было получено добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

Взятие крови осуществляли в утренние часы натощак путем пункции локтевой вены. Для иммунофенотипирования кровь забирали в пробирку VACUTAINER (BD), содержащую динатриевую соль ЭДТА.

Определяли относительное и абсолютное количество T-лимфоцитов (CD3⁺), T-хелперов (CD3⁺CD4⁺), цитотоксических лимфоцитов (CD3⁺CD8⁺), натуральных киллеров (NK) (CD3^–CD16⁺CD56⁺), TNK-лимфоцитов (CD3⁺CD16^–CD56⁺) и В-лимфоцитов (CD45⁺CD19⁺) Для подсчета процентного содержания клеток цельную кровь лизировали раствором OPTILYSE С (Beckman Coulter, США) и окрашивали моноклональными антителами CD3⁺-FITC/CD8⁺-ECD/ CD4⁺-PC5/CD16⁺CD56⁺PЕ и CD45⁺-Pacific Blue/ CD19⁺-PC5 (Beckman Coulter, США). Цитофлюорометрию осуществляли на проточном цитофлюориметре «Naviоs™» (Beckman Coulter, США), оценивали не менее 10 тыс. событий.

Определяли общее число лейкоцитов (WBC) по формуле:

$WBC = а \times 50 \times 106 / л$ ,

где а — число подсчитанных в камере Горяева лейкоцитов.

Расчет абсолютного количества лимфоцитов производили по формуле: WBC × (%)/100.

Статистическая обработка полученных результатов осуществлялась с использованием пакета прикладных программ Statistica 8.0 (StatSoft Inc., 2007). Определяли среднее арифметическое значение ± стандартное квадратичное отклонение. Достоверность различий между показателями независимых выборок оценивали по непараметрическому критерию Манна–Уитни.

Результаты

Анализ результатов исследования относительного содержания основных популяций и субпопуляций лимфоцитов у бессимптомно переболевших новой коронавирусной инфекцией свидетельствует об отсутствии статистически значимых изменений количества иммунокомпетентных клеток по сравнению с контрольной группой (табл. 1).

Таблица 1. Относительное содержание (%) основных популяций и субпопуляций лимфоцитов в крови волонтеров, перенесших COVID-19

Table 1. Relative content (%) of the main populations and subpopulations of lymphocytes in the blood of volunteers who have recovered from COVID-19

Популяции Populations	Контрольная группа Control group	Течение заболевания/Course of the disease
		бессимптомное/asymptomatic (n = 21)			средней степени/moderate (n = 32)			тяжелое/severe (n = 12)
		через 3–4 месяца after 3–4 months	через 5–6 месяцев after 5–6 months	через 7–8 месяцев after 7–8 months	через 3–4 месяца after 3–4 months	через 5–6 месяцев after 5–6 months	через 7–8 месяцев after 7–8 months	через 3–4 месяца after 3–4 months	через 5–6 месяцев after 5–6 months	через 7–8 месяцев after 7–8 months
Т-лимфоциты (CD3⁺) Т-lymphocytes (CD3⁺)	63,7±2,3	59,7±4,7	59,1±3,1	59,1±3,8	56,1±3,1*	58,8±4,2	58,9±3,8	50,3±3,4*	53,1±3,3*	57,8±3,1
Т-хелперы (CD3⁺CD4⁺) Т-helphers (CD3⁺CD4⁺)	42,6±2,2	41,7±2,2	42±2,1	40,9±2,0	36,4±2,0	37,1±3,7	38,5±3,7	35,2±3,1	36,1±3,3	41,8±2,3
Т-цитотоксические (CD3⁺CD8⁺) Cytotoxic Т cells (CD3⁺CD8⁺)	22,3±2,2	20,3±1,8	19,1±2,5	21,0±1,9	17,3±1,0*	20,7±2,8	21,4±2,0	15,4±2,0*	16,3±1,8*	18,9±2,5
Натуральные киллеры (CD3^–CD16⁺CD56⁺) Natural killers (CD3^–CD16⁺CD56⁺)	8,5±2,14	9,6±2,14	10,4±2,0	11,1±2,1	7,9±2,4	9,3±2,1	10,3±2,1	3,4±1,14^, *	4,6±1,4**	7,2±2,1
Т-Натуральные киллеры (CD3⁺CD16^–CD56⁺) Т-Natural killers (CD3⁺CD16^–CD56⁺)	5,7±1,5	4,9±1,58	5,2±1,3	4,7±1,8	5,0±1,8	5,5±1,58	5,2±1,8	2,5±1,58^, *	4,5±1,58	5,5±1,2
В-лимфоциты (CD19⁺) В-lymphocytes (CD19⁺)	9,0±1,5	8,5±2,5	7,5±1,5	8,0±2,1	7,8±2,0	7,7±1,2	7,1±1,5	6,9±3,5	8,0±1,5	7,5±1,9

Примечание. * — достоверное отличие от нормы (p < 0,05); ** — достоверное отличие от показателя в эти сроки при заболевании средней тяжести (p < 0,05).

Note. * — significant difference from the norm (p < 0,05); ** — significant difference compared to that of at any timepoints in moderate disease (p < 0,05).

У пациентов, перенесших инфекцию средней степени тяжести, через 3–4 месяца после заболевания выявлено снижение относительного количества CD3⁺- и CD8⁺-лимфоцитов, остальные популяции находились в пределах нормы. Через полгода после выздоровления число Т-клеток и цитотоксических лимфоцитов у волонтеров этой группы восстановилось до контрольных показателей.

Достоверные отличия от контрольных значений были выявлены при обследовании людей, перенесших COVID-19 в тяжелой форме. Эти изменения, по сравнению с контролем, характеризовались снижением относительного количества Т-лимфоцитов, особенно через 3–4 месяца после заболевания. Одновременно у волонтеров регистрировалось уменьшение числа CD8⁺-лимфоцитов, NK-клеток, а также Т-натуральных киллеров (ТNK) по сравнению с нормальными значениями. Следует отметить, что через полгода после перенесенного заболевания у обследуемых этой группы сохранялось низкое, относительно контроля, количество Т-клеток и цитотоксических лимфоцитов. Только через 7–8 месяцев эти нарушенные показатели нормализовались, относительное количество иммунокомпетентных клеток соответствовало возрастным критериям обследуемых.

Результаты оценки показателей у перенесших инфекцию в средней и тяжелой форме не выявили достоверных отличий по относительному содержанию CD3⁺-, CD4⁺-, CD8⁺-, CD19⁺-лимфоцитов. Достоверное, по сравнению с аналогичными показателями у волонтеров, перенесших заболевание в средней форме, уменьшение числа NK и TNK-клеток было зарегистрировано нами у тяжелопереболевших, особенно через 3–4 месяца после выздоровления.

Анализ абсолютного количества лимфоцитов продемонстрировал снижение, по сравнению с контрольной группой, CD3⁺- и CD8⁺-клеток у переболевших COVID-19 в средней форме (табл. 2). Эти показатели нормализовались только через полгода после выздоровления.

Таблица 2. Абсолютное содержание (× 10⁹/л) основных популяций и субпопуляций лимфоцитов в крови пациентов, перенесших COVID-19

Table 2. The absolute content (× 10⁹/l) of the main populations and subpopulations of lymphocytes in the blood of patients who have recovered from COVID-19

Популяции Populations	Контрольная группа Control group	Течение заболевания/Course of the disease
		бессимптомное/asymptomatic (n = 21)			средней степени/moderate (n = 32)			тяжелое/severe (n = 12)
		через 3–4 месяца after 3–4 months	через 5–6 месяцев after 5–6 months	через 7–8 месяцев after 7–8 months	через 3–4 месяца after 3–4 months	через 5–6 месяцев after 5–6 months	через 7–8 месяцев after 7–8 months	через 3–4 месяца after 3–4 months	через 5–6 месяцев after 5–6 months	через 7–8 месяцев after 7–8 months
Т-лимфоциты (CD3⁺) Т-lymphocytes (CD3⁺)	1,21±0,03	1,05±0,1	1,14±0,06	1,13±0,08	0,97±0,07*	1,1±0,05	1,12±0,08	0,77±0,04^, *	0,81±0,1^, *	1,14±0,06
Т-хелперы (CD3⁺CD4⁺) Т-helphers (CD3⁺CD4⁺)	1,0±0,04	0,91±0,06	1,0±0,06	1,1±0,03	0,92±0,08	1,02±0,06	1,0±0,06	0,89±0,05	0,86±0,07	1,0±0,08
Т-цитотоксические (CD3⁺CD8⁺) Cytotoxic Т cells (CD3⁺CD8⁺)	0,45±0,02	0,46±0,02	0,45±0,03	0,45±0,06	0,31±0,04*	0,39±0,03	0,40±0,06	0,30±0,04*	0,32±0,03*	0,41±0,06
Натуральные киллеры (CD3^–CD16⁺CD56⁺) Natural killers (CD3^–CD16⁺CD56⁺)	0,21±0,04	0,22±0,04	0,19±0,06	0,2±0,04	0,19±0,02	0,2±0,03	0,19±0,04	0,1±0,02^, *	0,2±0,07	0,19±0,08
Т-Натуральные киллеры (CD3⁺CD16^–CD56⁺) Т-Natural killers (CD3⁺CD16^–CD56⁺)	0,09±0,03	0,08±0,03	0,09±0,02	0,09±0,03	0,07±0,02	0,08±0,02	0,09±0,04	0,06±0,02	0,07±0,02	0,09±0,02
В-лимфоциты (CD19⁺) В-lymphocytes (CD19⁺)	0,21±0,03	0,19±0,02	0,21±0,05	0,20±0,02	0,18±0,06	0,19±0,05	0,19±0,03	0,2±0,06	0,18±0,07	0,18±0,03

Note. * — reliable difference from the norm (p < 0,05); ** — significant difference compared to that of at any timepoints in moderate disease (p < 0,05).

Наиболее выраженная Т-лимфоцитопения, сохраняющаяся до шести месяцев, наблюдалась у пациентов с тяжелым течением коронавирусной инфекции. Также в этой группе было снижено абсолютное число CD8⁺-лимфоцитов. Эти показатели достигли контрольных значений только через 7–8 месяцев после перенесенного заболевания. Также у волонтеров, перенесших COVID-19 в тяжелой форме, регистрировалось уменьшение натуральных киллеров, нормальное количество которых восстанавливалось через 5–6 месяцев после выздоровления.

Таким образом, при оценке количественного и качественного состава основных популяций и субпопуляций лимфоцитов у перенесших новую коронавирусную инфекцию разной степени тяжести выявлено, что SARS-CoV-2 снижает относительное и абсолютное количество Т-клеток, цитотоксических лимфоцитов, натуральных киллеров, то есть популяций клеток, играющих решающую роль в эффективной противовирусной защите.

Обсуждение

Накопленные в настоящее время данные свидетельствуют о том, что у пациентов с COVID-19 нарушены многие лабораторные показатели, и некоторые из них могут являться значимыми предикторами неблагоприятных клинических исходов. Таким фактором, наряду с увеличением количества лейкоцитов и нейтрофилов, является снижение числа лимфоцитов [8]. Лимфоцитопения описана как типичный клинический симптом у пациентов с COVID-19 многими исследователями, однако механизмы и причины ее возникновения еще остаются не до конца раскрытыми. Доказано, что подобно другим вирусам, SARS-CoV-2 может вызывать снижение количества лимфоцитов и их функциональной активности несколькими способами: первый — нарушение лимфопоэза, второй — апоптоз и разрушение этих клеток, третий — снижение числа циркулирующих лимфоцитов за счет прикрепления их к сосудистому эндотелию [13]. У пациентов с COVID-19, особенно в тяжелых случаях, регистрируется снижение количества и нарушение функции Т-хелперов, а также цитотоксических лимфоцитов и натуральных киллеров [4, 10], то есть популяций, имеющих решающее значение для контроля внутриклеточных инфекций. Эти показатели не восстанавливаются в течение нескольких месяцев, что свидетельствует о том, что SARS-CoV-2 достаточно сильно поражает лимфоциты, вызывая дисфункции даже после клинического выздоровления [17], а степень этих изменений коррелирует с тяжестью инфекционного процесса [9, 15].

Результаты наших исследований показали, что у бессимптомно переболевших новой коронавирусной инфекцией статистически значимых изменений относительного и абсолютного количества иммунокомпетентных клеток, по сравнению с контрольной группой, зарегистрировано не было. При средней степени тяжести заболевания выявлено снижение относительного и абсолютного содержания CD3⁺- и CD8⁺-лимфоцитов. Эти показатели восстанавливались до контрольных значений через полгода после выздоровления. У пациентов с тяжелой формой перенесенной инфекции наблюдалось уменьшение относительного и абсолютного количества Т-клеток и цитотоксических лимфоцитов. Эти значения оставались значительно ниже нормы в течение полугода и нормализовались только через 7–8 месяцев после выздоровления. Также у волонтеров этой группы было обнаружено уменьшение числа натуральных киллеров и ТNK-клеток. Полученные нами данные согласуются с результатами других исследователей, свидетельствующих о том, что количество лимфоцитов, особенно Т-клеток, у перенесших COVID-19 значительно снижено [2, 11, 14]. У пациентов, особенно в тяжелых случаях, регистрировалось также уменьшение CD4⁺-, CD8⁺-лимфоцитов, NK-клеток, сопровождающееся функциональным нарушением [4, 9, 10, 17]. Полученные в ходе проведенных нами исследований сведения могут быть полезны для расширения методических подходов к диагностике, лечению новой коронавирусной инфекции, а также мер по реабилитации перенесших ее лиц.