CD8 T cells in mice with different genetic susceptibility to anti-tuberculous immune response

Full Text

Введение

Т-лимфоциты CD8⁺ играют важнейшую роль в клеточном иммунитете при защите от внутриклеточных патогенов. Общепринято, что эти защитные свойства T-клеток CD8 реализуются за счет двух основных механизмов — продукции ими IFNγ и уничтожения зараженных клеток организма-хозяина и самих патогенов за счет цитотоксической активности [1]. Тем не менее роль Т-лимфоцитов CD8⁺ в иммунном ответе на туберкулезную инфекцию (ТБ) остается не до конца расшифрованной, несмотря на десятки лет работы над этой проблемой.

Первые аналитические работы в этом направлении, появившиеся в 1990-е годы, были проведены на мышах, несущих нокаут-мутации либо в гене, кодирующем β₂-микроглобулин, то есть легкую цепь молекул MHC I, на которых проходит селекция самих Т-клеток CD8, либо в генах, кодирующих главные эффекторные молекулы этих клеток. Эти исследования ясно показали, во-первых, что Т-клетки CD8 безусловно участвуют в защитном ответе на инфекцию [2], и во-вторых, что иммунная защита больше зависит не от продукции ими цитотоксических факторов, таких как перфорин и гранзим [3, 4], а от выработки IFNγ [5]. Тогда же было показано, что клетки CD8 человека обладают способностью напрямую убивать микобактерии за счет еще одного антимикробного фактора — пептида гранулизина [6], но ген, кодирующий этот фактор, отсутствует у мышей, поэтому детали данного биохимического механизма остаются до сих пор не изученными до конца. Попытка провести подобный анализ путем введения в геном мыши кодирующий гранулизин ген человека оказалась не вполне удачной, поскольку экспрессия искусственно введенного в геном трансгена обнаруживалась преимущественно не в Т-клетках CD8, а в NK-клетках [7].

Еще одна объективная трудность в исследовании роли Т-клеток CD8⁺ в моделях на мышах состоит в значительной гетерогенности популяций этих клеток и далеко неполной аналогии между мышью и человеком в данном аспекте. Классические Т-клетки CD8, распознающие антигенные пептиды микобактерий в контексте молекул МНС Iа, сходны по принципам распознавания у мыши (в контексте молекул H2-K, -D, -L) и человека (в контексте молекул HLA-A, -B, -C), так что моделирование иммунного ответа на мышах в этой части представляется адекватным [8]. Однако имеются убедительные данные о преимущественном участии в иммунном ответе на инфекции неклассических клеток CD8⁺ [9, 10], в том числе клеток распознающих липидные антигены в контексте молекулы CD1 [11]. Учитывая, что в отличие от человека, имеющего пять генов, кодирующих разные молекулы CD1, у мыши имеется только один такой ген [11], а также чрезвычайно широкий спектр липидных антигенов микобактерий, распознаваемых в контексте CD1 (см. ссылки 45–53 в недавнем обзоре Jaisewal и соавт. [12]), исследование на мышах иммунного ответа Т-лимфоцитов CD8 на липидные антигены микобактерий следует признать не вполне соответствующим картине ответа у человека.

Практически ничего не известно и о распознавании в организме мыши пептидных антигенов микобактерий в контексте мономорфной молекулы MHC I, аналогичной молекуле HLA-E человека, хотя этот каскад иммунного ответа представляет значительный интерес [13]. Следует отметить также, что аналитической избирательности не обеспечивает и наиболее распространенный исследовательский подход — генетическое «выключение» изучаемой популяции клеток. Введение в геном подопытных животных нокаут-мутаций либо в ген, кодирующий β₂-микроглобулин [2], либо в ген для самой молекулы CD8 (как, например, у коммерчески доступных мышей линии B6.129S2-cd8a^tm1Mak), приводит к элиминации всех популяций клеток CD8⁺, что не позволяет добиться удовлетворительной точности при анализе механизмов. По-видимому, наиболее детальные знания о роли Т-клеток CD8 при ТБ принесли работы лаборатории С. Бехара, в которых с помощью комбинации методов, включившей использование трансгенных животных, создание радиационных химер и адоптивные переносы Т-клеток, была охарактеризована способность Т-клеток CD8 распознавать инфицированные микобактериями макрофаги, а также исследовано их взаимодействие с клетками CD4 и изучена сравнительная защитная эффективность двух этих популяций Т-клеток [14, 15, 16, 17].

Несмотря на большой объем полученных данных, один из аспектов проблемы — а именно, роль генетической восприимчивости организма-хозяина к инфекции и степень тяжести ее течения — остается малоисследованным. Практически все процитированные выше работы были выполнены либо только на мышах линии В6 (одной из самых резистентных к туберкулезу, см. ссылку [25]), либо на ее мутантных дериватах, имеющих серьезные системные нарушения в иммунной системе, например, экспрессию только трансгенных Т-рецепторов со специфичностью к одному единственному антигену микобактерий. Имея возможность использовать линии мышей с разным уровнем генетической чувствительности к ТБ, обусловленным исключительно количественными и качественными отличиями в составе популяции Т-клеток CD4 и не несущих грубых дефектов в иммунной системе [18, 19, 25], мы сочли интересным исследовать, насколько повлияет избирательное отсутствие клеток CD8⁺ на уровень протекции у таких животных. Изначально мы предполагали, что у лишенных Т-клеток CD8⁺ мышей со сниженным защитным потенциалом клеток CD4 (конгенная линия В6.I-9.3-β2M–/–, Н2-А ^j H2-E ⁰) туберкулезная инфекция будет протекать тяжелее, чем у мышей линии В6-β2M–/– (Н2-А ^b H2-E ⁰), поскольку отсутствие клеток CD8 у последних будет отчасти компенсировано нормально функционирующим пулом Т-клеток CD4. Кроме того, у генетически чувствительного хозяина дополнительные дефекты иммунного ответа, как правило, проявляются сильнее, чем у резистентного, поэтому можно было рассчитывать на более высокую «разрешающую способность» предлагаемой тест-системы. Как будет показано ниже, эти ожидания не оправдались, и результаты оказались во многом неожиданными.

Для выполнения данной работы была получена новая двойная конгенная линия мышей В6.I-9.3-β2M–/–, которая не имеет Т-клеток CD8 из-за нокаут-мутации в гене, кодирующем β₂-микроглобулин, и отличается от родительской линии В6 по аллелю гена Н2-А МНС класса II. Мы провели сравнительный анализ течения ТБ и иммунного ответа на инфекцию, используя четыре линии мышей — исходную пару В6 и B6.I-9.3 и лишенную Т-клеток CD8 пару В6-β2M–/– и В6.I-9.3-β2M–/–.

Материалы и методы

Мыши, генетическое типирование и содержание иммунных клеток в органах. В работе были использованы родительская линия C57BL/6 (B6) и конгенная рекомбинантная линия B6.I-9.3, подробно описанная ранее [18, 25]. Обе линии мышей поддерживаются в виварии ФГБНУ «ЦНИИТ» братско-сестринскими скрещиваниями в обычных, не-SPF, условиях. Скрещивающиеся пары линии мышей B6 c нокаутированным геном, кодирующим β₂-микроглобулин (B6-β2M-KО), были изначально получены из Джексоновской лаборатории (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, США). Для получения линии, несущей нокаут-мутацию в гене β2M, на генетической основе линии B6.I-9.3 были получены гибриды F2 между линиями B6-β2M-KО и B6.I-9.3, среди которых отобраны потомки, несущие одновременно мутацию β2M-KО и область генома мышей B6.I-9.3 на 17-й хромосоме, от которых мы повели гомозиготную линию B6.I-9.3-β2M-KО.

Для генетического типирования выделяли ДНК из кончиков хвостов с использованием набора Promega и проводили ПЦР на приборе Applied Biosystems с помощью следующих праймеров: oIMRO160, B₂m-oIMR184 и B₂m-oIMR185 для идентификации нокаут-мутации в гене для β₂-микроглобулина и варианта дикого типа; D17Mit103, D17Mit21 и D17Mit22 для идентификации аллелей Н2 ^j геномной области 17-й хромосомы. Все последовательности праймеров и протоколы для ПЦР находятся в открытом доступе на сайте http://www.jax.org.

Методы приготовления суспензий клеток лимфоидных органов и легких детально описаны в ранней работе нашей лаборатории [20]. Для работы с первичными культурами клеток легкого, лимфоузлов или селезенки выделенные клетки помещали в среду для культивирования (RPMI-1640, содержащая 5% FCS, 1 mM пируват, 4 mM L-глутамат, 50 мкг/мл смеси антибиотиков стрептомицина и пеницилина, 5 × 10^–5 M β-меркаптоэтанола, 10 mM HEPES, все компоненты производства HiClone (Logan, UT, США). Оценку содержания в тимусе, селезенке и легких Т-лимфоцитов CD4⁺, CD8⁺ и В-лимфоцитов CD19⁺ проводили методом проточной цитометрии на приборе «BD Canto II» после окрашивания клеток антителами анти-CD3-APC, анти-CD4-pe-Cy7, анти-CD8-PP, анти-CD19-BV510 (все антитела BD Biosciences, Biolegend).

Заражение и параметры инфекции. Вирулентный штамм M. tuberculosis H37Rv выращивался и готовился для заражения по описанному нами ранее протоколу [21]. Животных заражали в аэрозольной камере (Glas-Col, США) в дозе 50–100 КОЕ на мышь, как подробно описано ранее [22]. Количество КОЕ микобактерий в легких и селезенке оценивали через 4 и 13 недель после заражения. Выделяли легкие и селезенки зараженных животных, гомогенизировали в 2 мл физиологического раствора, а затем готовили серийные десятикратные разведения гомогенатов органов и высевали на чашки Петри с агаром Дюбо (Difco, США) по 50 мкл на чашку. Чашки инкубировали при 37°С, через 21 день подсчитывали количество колоний на чашке и пересчитывали их количество на орган.

Гибель животных фиксировалась ежедневно, начиная с 12-й недели после заражения. Кривые выживания сравнивались статистически с использованием log-rank-теста. Для оценки патологии легких среднюю долю правого легкого замораживали в режиме температурного градиента –60°C … –20°C в течение 10 мин в электронном криотоме (ThermoShandon, Великобритания). Срезы толщиной 8–10 мкм высушивали на воздухе, фиксировали в этаноле и окрашивали гематоксилином и эозином.

Внутриклеточное определение IFNγ и TNF. 1,5 × 10⁶ клеток легкого инкубировали в среде культивирования в присутствии 10 мкг/мл ультразвукового дезинтеграта микобактерий [20] 36 часов, добавляя на последние 12 часов 1 мкг/мл блокатора аппарата Гольджи (GolgiPlug, BD Biosciences). После отмывки окрашивали поверхность клеток антителами анти-CD4-PerCp, а внутриклеточные цитокины — наборами Cytofix/Cytoperm kit (BD Biosciences) анти-IFNγ-APC и анти-TNF-FITC (BD Biosciences) с соблюдением рекомендаций фирмы-производителя.

Статистика. Полученные данные обрабатывали с помощью программы GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, Inc.) методами ANOVA, log-rank и с использованиемкритерия Манна–Уитни. Достоверными считали различия при Р < 0,05.

Результаты и обсуждение

Новая конгенная линия мышей

В первой серии экспериментов мы провели проверку того, насколько успешно рекомбинационный перенос нокаут-мутации по гену β2М с генетической основы мышей В6 на основу B6.I-9.3 и последующая селекция гомозиготных мышей воспроизводит дефект Т-клеток CD8⁺ у новой линии мышей. Для этого мы сначала определили количество Т-клеток CD4⁺ и CD8⁺ в лимфоидных органах мышей исходных линий В6 и B6.I-9.3, а также у носителей нокаут-мутации по гену β2М на обеих генетических основах. Как показано на рис. 1А (II обложка), в тимусе мышей двух линий дикого типа обнаруживалось приблизительно одинаковое содержание клеток CD4^–CD8⁺ (около 2,5%). При этом относительное содержание клеток CD4⁺CD8^– было в 2,5 раза выше у мышей линии В6, что совпадает с результатами, полученными ранее [18]. В соответствии с ожидаемым, нокаут-мутация по гену β2М привела к практически полному исчезновению популяции клеток CD4^–CD8⁺. Тотальная элиминация Т-клеток СD8 у мышей обеих мутантных линий подтвердилась и при исследовании селезенки (рис. 1Б), причем в этом вторичном лимфоидном органе у мышей линии B6.I-9.3 дикого типа с их врожденным пониженным содержанием Т-клеток CD4 [18] относительное содержание клеток CD8 было выше, согласно общим правилам иммунного гомеостаза.

Поскольку основные иммунные реакции при ТБ проходят в легочной ткани, далее мы оценили эффективность элиминации Т-клеток CD8 в легких мутантов β2М–/–. Как показано на рис. 2 (II обложка), по сравнению с мышами дикого типа у носителей мутации β2М–/– на обеих генетических основах произошло приблизительное 20-кратное уменьшение легочной популяции Т-клеток CD8, практически до следовых значений. Избирательность генетического дефекта подтверждается не только приведенными на рис. 1 и 2 данными по Т-клеткам CD4, содержание которых не уменьшилось, но и полным отсутствием влияния нокаут-мутации на содержание в селезенке и легких В-лимфоцитов (табл. 1). Таким образом, нами получена новая линия мышей, конгенная по MHC II c классической линией В6 и дефектная по Т-лимфоцитам CD8⁺. Все четыре описанные здесь линии поддерживаются в виварии ФГБНУ «ЦНИИТ» и могут быть предоставлены заинтересованным исследователям.

 

Рисунок 1. Нокаут-мутация по гену для β2-микроглобулина отменяет экспрессию маркера CD8 на поверхности дифференцированных (single positive) Т-лимфоцитов тимуса (А) и всех лимфоцитов селезенки (Б)

Figure 1. Knockout mutation in the gene for ²2-microglobulin eliminates differentiated single-positive CD8 T-lymphocytes from thymus (A) and all CD8 cells from spleen (B)

Примечание. Результаты проточной цитометрии приведены в виде среднего±SEM двух независимых экспериментов, по 3–4 мыши каждой линии в каждом эксперименте (Ntotal = 6–8).

Note. The results of two independent flow cytometry experiments (3–4 mice per mouse strain each, Ntotal = 6–8) are expressed as mean±SEM

 

Рисунок 2. Фенотип СD8– у носителей мутации β2M–/– проявляется и в легких

Figure 2. The CD8– phenotype is expressed in the lungs. See the statistic in the footnote to Fig. 1

Примечание. Результаты проточной цитометрии приведены в виде среднего±SEM двух независимых экспериментов, по 3–4 мыши каждой линии в каждом эксперименте (Ntotal = 6–8).

Note. The results of two independent flow cytometry experiments (3–4 mice per mouse strain each, Ntotal = 6–8) are expressed as mean±SEM.

 

Таблица 1. Относительное содержание В-лимфоцитов* в органах мышей дикого типа и мутантов β2M–/–

Table 1. Relative B-lymphocyte content* in the organs of wild type and β2M–/– mutant mice

Линия мышей Mouse strain	B6	B6.I-9.3	B6-β 2M-KO	B6.I-9.3-β 2M-KO
Селезенка Spleen	51,4±1,6	54,3±0,7	51,1±1,5	56,6±1,2
Легкие Lung	28,7±3,5	34,4±4,6	27,4±4,6	31,3±4,3

Примечание. *Относительное содержание В-лимфоцитов определяли методом проточной цитометрии, для селезенки — от общего количества клеток, для легких — от всех Т- и В-лимфоцитов (CD3⁺ и CD19⁺); межлинейные различия недостоверны для каждого органа; N = 4–5 на группу.

Note. *The percentile of CD19⁺ B-cells was assessed by flow cytometry, for spleen cells — among all splenocytes; for lung cells — among T-plus B-lymphocytes (СD4⁺ and CD19⁺); inter-strain differences were non-significant for both organs; N = 4–5 for each group.

 

Влияние дефицита Т-клеток CD8 на фенотипы инфекционного процесса

Чаще всего особенности течения ТБ в эксперименте характеризуют по трем основным показателям: динамике размножения микобактерий в легких, патологическим изменениям в легочной ткани и продолжительности жизни зараженных животных. Мы выбрали для оценки две временные точки туберкулезного процесса — 4 недели после заражения, когда начинают стабильно проявляться все количественные отличия параметров адаптивного иммунного ответа на инфекцию между мышами В6 и В6.I-9.3, связанные с различиями функционирования Т-клеток CD4⁺ [23], и 12–13 неделю инфекции, когда поражение легочной ткани уже сильно выражено, но животные остаются физиологически активными и внешне здоровыми, причем количество микобактерий в легких остается все еще стабильным и у мышей В6, и у мышей B6.I-9.3, хотя и на разных уровнях [19].

Как показано на рис. 3А, дефицит Т-клеток CD8 не сказывается на размножении микобактерий в легких в течение первых четырех недель после заражения: достоверные отличия в размере популяций возбудителя обнаруживаются между мышами, несущими разные аллели MHC II (как и было обнаружено ранее [25], мыши с генотипом H2-A^b лучше контролируют размножение микобактерий), но не между мышами β2M–/– и β2M+/+. Через 90 дней после заражения картина изменялась: в легких мышей В6-β2M–/– популяция микобактерий выросла и стала достоверно больше, чем у мышей В6 (рис. 3Б). В паре линий β2M–/– и β2M+/+ на генетической основе В6.I-9.3 такого различия не наблюдалось, и количество микобактерий в легких осталось одинаковым у мутантов и мышей дикого типа. Этот результат стал первым косвенным указанием на возможный вклад Т-клеток CD8 в защиту хозяина на поздней стадии инфекции, а также на возможные количественные различия этого вклада, зависящие от аллелей MHC II, то есть от ответа Т-клеток CD4⁺.

 

Рисунок 3. Различия в тяжести течения туберкулезной инфекции у мышей исследуемых линий

Figure 3. Differences in TB infection severity between mice of the strains under study

Примечание. (А) На ранней стадии инфекции на размножение микобактерий влияет различие по аллелям MHC II, но не отсутствие клеток CD8⁺. (Б) На поздней стадии инфекции дефицит клеток CD8 приводит к снижению способности тормозить рост микобактерий в легких мышей B6-β 2M-KO, но не B6.I-9.3-β 2M-KO. (В) Выживаемость после заражения мышей В6 дикого типа значительно (P < 0.001, log rank test) продолжительнее, чем мышей B6.I-9.3, но элиминация Т-клеток CD8 полностью нивелирует это различие. А, Б — по оси Х указана средняя бактериальная нагрузка (млн КОЕ на легкое)±SEM, определенная в двух независимых экспериментах (N_total = 7 в каждой группе, *^, ** = P < 0,05 и < 0,01 соответственно, критерий Манна–Уитни). В — каждый символ изображает индивидуальное животное, суммированы результаты двух независимых экспериментов.

Note. (A) At the early infection phase, mycobacterial multiplication in lungs depends upon the MHC II allele but not on the presence of CD8 cells. (B) At the late infection phase, CD8 deficiency diminishes lung capacity to control mycobacterial growth in B6-β 2M-KO, but not B6.I-9.3-β 2M-KO, mice. (C) The life span of the wild type B6 mice is considerably (P < 0.001, log rank test) longer than that of B6.I-9.3 mice, but CD8 cell elimination abrogates this difference totally. A, B — X-axis displays bacterial load per lung (mean × 10⁶±SEM for two summarized independent experiments, N_total = 7 for each group, *^, ** = P < 0.05 и < 0.01, respectively, Mann–Whitney test). Each symbol represents an individual mouse, the results of two independent experiments were summarized.

 

Оценка продолжительности жизни мышей после заражения показала, что на самом деле роль клеток CD8 в защите от ТБ совсем не второстепенна. Как показано на рис. 3В, срок выживания мышей обеих линий с дефицитом клеток CD8 оказался гораздо короче, чем линий дикого типа (P < 0,001 для пары В6.I-9.3–B6.I-9.3-β2M–/– и P < 0,0001 для пары В6–В6-β2M–/–). Таким образом, при использовании для оценки тяжести течения заболевания такого интегрального позднего фенотипа, как кривая выживания, участие в иммунной защите клеток CD8 становится весьма заметным. Интересно отметить одну отличительную особенность пары линий В6–В6β2M–/– от второй пары. Мыши линии В6 дикого типа достоверно (P < 0,001) более резистентны к инфекции, чем мыши линии B6.I-9.3, но генетическая элиминация клеток CD8 полностью нивелирует это различие: обе линии, несущие нокаут-мутацию β2M–/–, имеют одинаковое время выживания после заражения (рис. 3В). Это означает, что негативное влияние отсутствия клеток CD8 сильнее проявляется на фоне, в принципе, более эффективно организованного защитного ответа; положение, которое количественно проиллюстрировано в табл. 2. Сам этот результат вполне соответствует более резкому снижению способности контролировать размножение микобактерий на поздней фазе инфекции у мышей В6-β2M–/– (рис. 3Б).

 

Таблица 2. Генетическая элиминация T-клеток CD8⁺ сильнее нарушает противотуберкулезную защиту мышей более резистентной к инфекции линии

Table 2. Genetic depletion of CD8⁺ T-cells impairs TB defense more severely in the more resistant mouse strain

Линия мышей (N) Mouse strain (N)	Срок выживания ±SEM (дни) Survival time ±SEM (days)	Относительное сокращение срока выживания (%) Relative decrease in the life span (%)
B6 (11)	311,5±9,7	39,9
B6-β 2M-KO (23)	184,3±6,7
B6.I-9.3 (18)	242,7±6,7	25,8
B6.I-9.3-β 2M-KO (21)	180,6±6,0

Примечание. *Приведены суммарные результаты двух независимых экспериментов.

Note. *The results of two independent experiments were summarized.

 

Динамика взаимодействий между Т-клетками CD4⁺ и CD8⁺ при туберкулезе in vivo исследована недостаточно подробно, но в некоторых моделях инфекций, особенно вирусных, получены убедительные данные о преимущественном участии Т-клеток CD4 в раннем, а клеток CD8 — в позднем защитном иммунном ответе. Например, сравнительно недавно была разработана модель гепатита С на мышах [24], которая воспроизводит как раннюю острую, так и хроническую, фазы инфекции. В этой модели было показано, что клетки CD4 выступают в роли незаменимых Т-хелперов для клеток CD8 в острой фазе инфекции, но затем нарастающая противовирусная активность последних уже не нуждается в помощи [26]. С этими данными перекликаются и результаты, полученные при исследовании активности клеток памяти CD8⁺, персистирующих в легких после ответа на вирус гриппа [27]. Безусловно, проводить совсем близкие аналогии здесь не вполне уместно хотя бы потому, что течение туберкулезной инфекции, невозможно четко разделить на острую и хроническую фазы, но общая идея о нарастающей роли Т-клеток CD8⁺ по мере развития инфекционного процесса представляется заслуживающей внимания.

Патология легких и ключевые цитокины воспаления

На рис. 4 (III обложка) представлены обзорные гистологические срезы ткани легких мышей всех четырех исследуемых линий, полученные через 4 и 13 недель после заражения. На позднем сроке существенных различий между животными обнаружено не было: у мышей всех четырех линий легочная патология была представлена сильно выраженными, диффузными инфильтратами ткани миелоидными и лимфоидными клетками, занимающими большую площадь, то есть слабо структурированной пневмонией, значительно снижающей дыхательную функцию. На ранней фазе инфекции обнаружилась одно явное отличие между животными двух линий с дефицитом Т-клеток CD8. Ранние типичные признаки туберкулезного воспаления, представленные кольцевыми инфильтратами иммунных клеток вокруг мелких бронхов [28, 29], не обнаруживались у мышей В6-β2M–/– (рис. 4). Очевидно, именно мышам более резистентной к ТБ линии для ранней компактной инфильтрации перибронхиального пространства (реакцию, обычно считающуюся началом защитного ответа, связанным с ограничением диссеминации возбудителя [28]) необходимо наличие в циркуляции клеток CD8⁺. Выяснение причин отсутствия подобного фенотипа у мышей B6.I-9.3-β2M–/– потребует дополнительных экспериментов, скорее всего связанных с переносами иммунных клеток, но на наш взгляд данное наблюдение перекликается с описанным выше более сильным влиянием дефицита клеток CD8 на продолжительность выживания после заражения именно мышей В6-β2M–/–.

 

Рисунок 4. Обзорные микрофотографии (×37, масштаб приведен на правом верхнем снимке) срезов правого легкого мышей исследуемых линий

Figure 4. Synopsys photos (×37, the scale bar is displayed on right upper panel) of right mouse lungs slides

Примечание. Желтые стрелки указывают на кольцевидные инфильтраты клеток иммунной системы вокруг просветов малых бронхов. См. пояснения в тексте.
Note. Yellow arrows indicate immune cell cuffs around small bronchi. See text for details.

 

Мы считаем, что высокая резистентность к ТБ мышей В6 обеспечивается, в частности, оптимальным соотношением между популяциями Т-клеток CD4 и CD8, близким к 1:1 в селезенке и 1,5:1 в лимфатических узлах [18]. При таком соотношении в полной мере реализуется и роль клеток CD4 в качестве клеток-хелперов для функционирования клеток CD8, поэтому их генетическое удаление сильно сказывается на тяжести течения инфекции. Значительный дефицит Т-клеток CD4 у мышей B6.I-9.3, обусловленный носительством аллеля j их единственного гена класса II Н2-А [18, 19, 25], приводит к инверсии соотношения CD4:CD8 (~1:2 и в селезенке, и в лимфоузлах [18]) и, вероятно, неоптимальному функционированию клеток CD4 в качестве хелперов. У таких мышей нокаут-мутация β2M–/– удаляет из организма клетки CD8, которые все равно функционируют не совсем эффективно, по крайней мере на фазе раннего ответа на инфекцию.

Регуляция воспаления и межклеточные взаимодействия в иммунной системе зависят, прежде всего, от множества эффекторных и регуляторных цитокинов, среди которых при ТБ наиболее заметную роль играют IFNγ и TNF. Первый выступает в качестве основного активатора зараженных микобактериями макрофагов, индуцируя работу фермента iNOS и выработку активных азотистых радикалов — главных факторов элиминации микобактерий у мыши [30]. Второй, помимо множества других функций, необходим для образования и поддержания структуры туберкулезных гранулем, что критически важно для предотвращения диссеминации инфекции [31]. Кроме того, оба этих медиатора продуцируются разными типами клеток иммунной системы, и физиологический эффект весьма сильно зависит от конкретного источника цитокина при разных обстоятельствах. В частности, при туберкулезе защитный эффект TNF, продуцируемого миелоидными клетками, проявляется преимущественно на ранних фазах инфекции, а TNF из Т-лимфоцитов действует в течение длительного времени [32]. Исходя из этих соображений, мы сравнили не тотальную продукцию этих факторов всеми легочными клетками, а количество клеток CD4⁺, синтезирующих IFNγ и TNF, в легких мышей исследуемых линий через 4 и 13 недель после заражения.

Как показано на рис. 5, на ранней фазе инфекции ни различие по аллелям MHC II, ни нокаут-мутация, элиминирующая клетки CD8⁺, никак не повлияли на долю IFNγ-положительных клеток среди всех легочных клеток CD4⁺, которая оказалась одинаковой у всех животных (рис. 5А). Напротив, при отсутствии клеток CD8⁺ на той же четвертой неделе после заражения достоверно снизилась доля TNF-положительных клеток CD4 у мышей обеих линий, несущих мутацию β2M–/–. Этот — вполне неожиданный — результат косвенно указывает на необходимость клеток CD8 для быстрой дифференцировки/активации/миграции в легкое TNF-положительных клеток CD4, то есть на вероятность существования некоей реверсной хелперной функции. Он вполне может оказаться связан с феноменом развития полифункциональных Т-клеток CD4⁺, продуцирующих одновременно IFNγ, TNF и IL-2, которым в последнее время, особенно разработчиками вакцин, уделяется большое внимание как чуть ли не главным факторам защитного противотуберкулезного ответа [33, 34]. Так или иначе, вопрос, несомненно, заслуживает детального изучения.

Рисунок 5. Отсутствие Т-клеток CD8 не влияет на содержание в легких клеток CD4, продуцирующих IFNγ, но приводит к достоверному снижению содержания TNF-положительных клеток

Figure 5. The lack of CD8 T-cells does not alter the content of lung CD4⁺ INFγ-producing, but leads to a significant decrease in CD4⁺ TNF-producing, T-cells

Примечание. Приведены суммы результатов двух независимых экспериментов (N_total = 6), полученных методом внутриклеточного окрашивания с последующей цитометрией через 4 недели после заражения. *** = P < 0,001, тест Манн–Уитни.

Note. The results of two independent experiments are summarized (N_total = 6). Intracellular staining with subsequent flow cytometry at week 4 of infection. *** = P < 0.001, Mann–Whitney test.

 

В заключение хотелось бы отметить, что наши знания о динамике иммунного ответа и взаимодействии между разными типами лимфоцитов при ТБ остаются далеко неполными. Особенно много пробелов в понимании клеточных и молекулярных механизмов взаимодействия «микобактерия–хозяин» на ранних стадиях инфекции, хотя их важность не вызывает сомнений [35], и природы достаточно резкого падения эффективности ответа на поздних стадиях инфекции. Феномен иммунного истощения довольно хорошо исследован в отношении Т-клеток CD8 при онкологических заболеваниях и хронических вирусных инфекциях (см. обзор [36]), но лишь недавно стал изучаться в отношении Т-клеток CD4 при туберкулезе [23, 37]. Взаимодействие же CD4–CD8 в этом аспекте вообще практически не исследовано и заслуживает пристального внимания.

About the authors

N. N. Logunova

Central Tuberculosis Research Institute

Email: nadezda2004@yahoo.com

PhD (Medicine), Senior Researcher, Laboratory of Immunogenetics

Russian Federation, Moscow

M. A. Kapina

Central Tuberculosis Research Institute

Email: makapina@mail.ru

PhD (Biology), Senior Researcher, Laboratory of Immunogenetics

Russian Federation, Moscow

I. A. Linge

Central Tuberculosis Research Institute

Email: iralinge@gmail.com

PhD (Biology), Leading Researcher, Laboratory of Immunogenetics, Immunology Department

Russian Federation, Moscow

E. V. Kondratieva

Central Tuberculosis Research Institute

Email: alyonakondratyeva74@gmail.com

PhD (Biology), Senior Researcher, Laboratory of Immunogenetics, Immunology Department

Russian Federation, Moscow

Alexander S. Apt

Central Tuberculosis Research Institute

Author for correspondence.
Email: alexapt0151@gmail.com

DSc (Biology), Professor, Head of the Laboratory of Immunogenetics, Immunology Department

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files