Assessment of the ability of SARS-CoV-2 strains of genetic variants B.1.1 and JN.1 to evade neutralizing antibodies from 2020 and 2023 convalescent patients

Full Text

Введение

Вирус SARS-CoV-2 вызывает тяжелый острый респираторный синдром. Пандемия COVID-19 началась в 2019 г. За 5 лет от начала пандемии были разработаны и применены вакцинные и лечебные препараты для лечения и профилактики этой болезни. Несмотря на это, COVID-19 остается причиной смертельных исходов в случае тяжелого течения заболевания. Последний отчет ВОЗ показывает, что по состоянию на середину февраля 2025 г. более 770 млн человек были инфицированы, повысилось количество сердечно-сосудистых заболеваний как последствие заболевания и более 7 млн человек умерли во всем мире [16]. Хотя динамика COVID-19 носит затухающий характер, подъемы заболеваемости периодически возникают. Поэтому остается острым вопрос о вероятности внезапного возврата ныне не актуальных, но ранее вызвавших озабоченность вариантов SARS-CoV-2, и необходимости выработки на перспективу мер специфической профилактики заболевания.

SARS-CoV-2 — одноцепочечный РНК-бетакоронавирус с положительной полярностью, молекулярной массой 30 кб и размером генома 29 903 п.н., содержащий 14 открытых рамок считывания. Геном SARS-CoV-2 кодирует структурный гликопротеин шипа (S), малый гликопротеин оболочки (E), мембранный гликопротеин (M) и нуклеокапсидный (N) белок, а также вспомогательные белки (ORF 3a, 3b, 6, 7a, 7b, 8, 9b, 10) [13]. Гликопротеин S отвечает за проникновение вируса в клетки хозяина через рецепторы ангиотензинпревращающего фермента 2 (ACE2) [12]. Именно спонтанные изменения в S предоставляют в ходе отбора большинство генетических вариантов для процесса адаптации вируса к сформированному ранее иммунитету инфицированных.

С момента появления генетического варианта Омикрон показано, что его штаммы менее патогенны по сравнению с предыдущими вызывающими беспокойство вариантами (VOC). Одновременно у относящихся к Омикрону штаммов наблюдается повышенная инфекционность, ведущая к снижению иммунной защиты [5, 11]. При этом репертуар всех специфических антител изменен незначительно. Для перестройки иммунитета к защите от новых вариантов требуется время, за которое успевают накопиться новые спонтанные генетические мутации. В результате наблюдается периодический процесс роста случаев заболевания COVID-19.

В начале 2023 г. варианты SARS-CoV-2 были представлены часто встречающимся рекомбинантом Омикрон XBB и его субвариантом EG.5. Новый субвариант BA.2.86 был обнаружен позже. Он имел более 30 мутаций в S относительно BA.2 и был классифицирован как вариант, вызывающий интерес (VOI). Генетическая диверсификация BA.2.86 привела к появлению линейки субвариантов, включая JN.1. Согласно данным GISAID, JN.1 уже более года является самым встречаемым VOI, составляя 15% последовательностей на 1-й неделе 2025 г. [16]. В аминокислотной последовательности белка Spike JN.1 выявлено 58 замен относительно исходного дикого типа. Общее количество мутаций в кодирующем S гене за все время наблюдения — более 100 тысяч, приведших к 500 уникальным аминокислотным заменам для всех генетических вариантов SARS-CoV-2. Таким образом, только малая доля спонтанных мутаций в S-последовательности SARS-CoV-2 явилась причиной новых волн распространения COVID-19 [17].

Иммунитет к SARS-CoV-2 после инфекции или вакцинации обеспечивает определенную степень защиты от повторного заражения и снижает риск неблагоприятного исхода. Наличие нейтрализующих антител у реконвалесцента предполагает более 89% защиты от повторного заражения вирусом из той же группы VOC [6], после вакцинации от 50 до 95% [15]. Однако наличие иммунитета к конкретному генетическому варианту вируса не обеспечивает защиту от всех. Некоторые варианты избегают нейтрализации из-за отсутствия имевшихся ранее антигенных детерминант и появления новых в результате спонтанных мутаций [7]. Естественно, специфический иммунитет не ограничивается наличием нейтрализующих антител. Описаны факты наличия защиты от SARS-CoV-2 только Т-клеточным звеном у пациентов с иммунодефицитами по различным причинам и даже у здоровых людей. Но отсутствие гуморального иммунитета при наличии клеточного это редкое исключение [4]. Следовательно, данные о величине титров нейтрализующих SARS-CoV-2 антител являются источником достоверной информации о напряженности специфического иммунитета.

Исследование гуморального иммунитета к различным генетическим вариантам вируса необходимо при разработке эффективных мер противодействия распространению COVID-19. На данный момент основными факторами распространения вируса SARS-CoV-2 считаются высокая скорость спонтанного мутагенеза, а также увеличение трансмиссивности при снижении тяжести вызываемого заболевания [18, 19]. С другой стороны, фактором сдерживания для распространения волн COVID-19 является давление популяционного иммунитета [8]. Чем шире будет спектр нейтрализующих антител к различным генетическим вариантам вируса, тем меньше возможности для мутантных вариантов избежать нейтрализации.

На основании результатов работ по оценке напряженности иммунитета возможно установить степень влияния указанных факторов на эпидемический процесс. Необходимы экспериментальные данные о напряженности иммунитета групп населения в разное время к старым и измененным генетическим вариантам SARS-CoV-2. Широко используется такой показатель напряженности иммунитета как среднегеометрический титр нейтрализующих антител в выборках образцов сыворотки крови. [3].

Цель исследования — сравнить титры нейтрализующих антител в двух группах образцов сыворотки крови реконвалесцентов, перенесших COVID-19 в 2020 и 2023 гг. к штамму, гомологичному первоначальному дикому типу Ухань (субвариант В.1.1) и появившемуся уже после формирования выборок образцов крови штамму субварианта JN.1 линии Омикрон.

Материалы и методы

Исследуемые образцы были получены в ходе отбора кандидатов в добровольцы на клинические испытания вакцинных препаратов против SARS-CoV-2. Кандидаты давали информированное согласие на участие и исследование на маркеры нового коронавируса. В 2020 г. у них осуществляли отбор образцов крови для анализа на наличие антител классов A, M и G к SARS-CoV-2, определяли отсутствие РНК патогена в носоглоточных смывах. При выявлении специфических антител или наличии РНК коронавируса они не допускались к участию в испытаниях вакцин. Содержащие специфические антитела образцы из этой группы были депонированы для текущего исследования. В 2023 г. выборка была составлена из образцов сыворотки крови, полученных у не допущенных к участию в испытаниях кандидатов на основании высоких более 1:400 титров специфических IgM и IgA при специфических IgG в крови более 200 BAU/ml. Для выявления антител применяли зарегистрированные медицинские изделия, наборы реагентов для иммуноферментной диагностики COVID-19 производства ОАО «Вектор-Бест» (Россия).

На стадии отбора у всех кандидатов в добровольцы в вакуумные пробирки с активатором свертывания была собрана кровь объемом 5–8 мл. Сыворотка крови была отделена от сгустка методом центрифугирования и заморожена аликвотами по 0,5 мл при температуре от –70 до –73°C до размораживания с целью исследования. Сбор материала, его упаковка, транспортировка и анализ проведены в соответствии с требованиями и правилами биологической безопасности к материалу, подозрительному на зараженность ПБА II группы патогенности. По результатам предварительного обследования на наличие специфических антител сформированы выборки образцов от кандидатов в добровольцы, не соответствующих критериям отбора. Было установлено, что после их заболевания COVID-19 до забора крови прошло от 21 до 69 суток. В 2020 г. было собрано 76 образцов от реконвалесцентов после COVID-19, в 2023 г. собрано 68 образцов. Половозрастная структура групп доноров исследуемых образцов сыворотки крови приведена на рис. 1.

 

Рисунок 1. Половозрастная структура групп доноров исследуемых образцов сыворотки крови, количество человек

Figure 1. Sex and age structure of donor groups of the studied blood serum samples, number of people

 

Исследование образцов одобрено Этическим советом Минздрава России (выписка из протокола Этического совета № 376 от 24 июля 2020 г.). Исследование проведено в соответствии с этическими принципами Хельсинкской декларации, принятой 18-й сессией Всемирной медицинской ассоциации (1964 г.), пересмотренной в 2013 г. Все процедуры проводились в соответствии с Протоколом № COV/pept-01/20 (Версия 2 от 22.07.2020 г.). Исследование начато в 2020 г. и завершено в 2024 г.

Клеточная культура. Клетки эпителия почки африканской зеленой мартышки Vero E6 (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора) образовывали монослой в лунках 96-луночного планшета («Gibco», Thermo Fisher Scientific, США). Их культивировали в среде DМЕМ с L-глутамином («Gibco», Thermo Fisher Scientific, США) с добавлением эмбриональной сыворотки коров до 10% («Gibco», Thermo Fisher Scientific, США) и препарата Antibiotic-Antimycotic («Gibco», Thermo Fisher Scientific, США), при 37°С в инкубаторе с 5% СО₂ в атмосфере.

Вирусы. Для исследования вируснейтрализующих свойств сывороток крови использовали штамм hCoV-19/Russia/Omsk202118_1707/2020 (GISAID ID: EPI_ISL_1242008, генетическая линия В.1.1) высоко гомологичный (уровень гомологии не менее 98%) штамму Ухань, вызывавшему вспышку в 2019 г. в КНР; и штамм hCoV-19/Russia/NVS-SRC-4559/2024 (GISAID ID: EPI_ISL_19035845) генетической линии Омикрон JN.1.

Определение нейтрализующих титров проведено методом микронейтрализации с использованием монослоя клеточной культуры Vero E6 [1]. Начальное разведение исследуемых образцов сывороток крови человека в 10 раз. Значения ниже 10 приняты за 5 по причине соответствия кратности разведения 5, предыдущего первому использованному в исследовании. Рабочая концентрация вирусов была 100 ТЦД₅₀/0,1 мл. Наличие ЦПД в лунках планшета определяли после окрашивания генцианвиолетом. Величина титра нейтрализующих антител в исследуемом образце принималась равной значению максимального разведения сыворотки без признаков ЦПД.

Анализ данных. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы STATISTICA V.13.3 (Серийный номер SN: JPZ009K288811CNETACD-V). Сгруппированные по четырем категориям выборки величин логарифмов обратных титру нейтрализующих антител (Log₁₀ ОТ), сыворотки 2020 г. к JN.1, сыворотки 2023 г. к JN.1, сыворотки 2020 г. к В.1.1, сыворотки 2023 г. к В.1.1, анализировали на принадлежность к генеральной совокупности с нормальным распределением по критерию Колмогорова–Смирнова с поправкой Лиллиефорса. Определяли их среднее геометрическое и величину погрешности для 95% доверительного интервала. Статистическую значимость отличий групповых величин выборок оценивали с помощью F-критерия, достоверной считали разницу при p < 0,01.

Результаты

Была исследована нейтрализующая активность антител в образцах сыворотки крови реконвалесцентов, собранных в два временных периода.

Получено четыре группы значений ОТ, нейтрализующих вирусные частицы SARS-CoV-2 (табл.).

 

Таблица. Средние геометрические значения обратных титров нейтрализующих антител (ОТ) к SARS-CoV-2 в образцах сыворотки крови реконвалесцентов (наименьшее значение–наибольшее значение)

Table. Geometric mean values of neutralizing antibodies reverse titers (RT) to SARS-CoV-2 in blood serum samples of convalescents (lowest value–highest value)

АГ* AG*	Год сбора образцов/Year of samples collection
	2020		2023
	ОТ RT	% позитивных % of positive	ОТ RT	% позитивных % of positive
В.1.1	34 (22–52)	79,9	329 (258–420)	98,5
JN.1	6 (5–7)	18,4	11 (8–16)	57,1

Примечание. * — Субвариант штамма вируса, использованного в реакции нейтрализации.

Note. * — Subvariant of the virus strain used in neutralization test.

 

Все четыре выборки полученных значений не относятся к генеральной совокупности с нормальным распределением, поскольку по критерию Колмогорова–Смирнова с поправкой Лиллиефорса для каждой вероятность «нулевой гипотезы» нормальности р < 0,01. Поэтому для выявления статистически достоверных отличий между четырьмя группами как независимых, так и связанных данных был выбран тест, который способен работать с несколькими выборками объемом более 50 числовых элементов, не имеющими нормального распределения. Данному условию удовлетворяет критерий Фишера (F-тест).

На рис. 2 представлены среднегеометрические значения логарифмов ОТ с величинами погрешностей для 95% доверительного интервала и величины статистической значимости различий по F-тесту.

 

Рисунок 2. Способность образцов сывороток крови реконвалесцентов 2020 и 2023 гг. нейтрализовать штаммы SARS-CoV-2 субвариантов В.1.1 и JN.1 в порядке регрессии Примечание. * — Статистически значимые различия между группами по F-критерию при p < 0,01.

Figure 2. The ability of 2020 and 2023 years convalescent serum samples to neutralize old and new SARS-CoV-2 subvariants B.1.1 and JN.1 as a regression
Примечание. * — Статистически значимые различия между группами по F‑критерию при p < 0,01.
Note. * — Statistically significant differences between groups according to the F-test, p < 0.01.

 

По результатам F-теста наблюдается статистически достоверное отличие между значениями титров нейтрализующих антител для всех четырех выборок.

Обсуждение

Ранее было отмечено, что интерпретировать результаты исследования специфического иммунитета людей сложно в силу индивидуальных особенностей организма, которые оказывают влияние на формирование иммунного ответа, в то время как при исследовании титров антител у иммунизированных линейных лабораторных животных выборка является однородной [1]. Но когда речь идет о сравнении титров нейтрализующих антител у групп людей, достоверный результат достигается превосходящим эксперименты с животными объемом выборки и реальным формированием иммунитета в процессе контакта с живым патогеном [9].

Методом исследования нейтрализующих титров антител нами оценена способность иммунитета групп реконвалесцентов 2020 и 2023 гг. противостоять штаммам первоначального и актуального для 2025 г. генетических вариантов SARS-CoV-2.

В табл. показано, что к В.1.1 есть большая доля образцов с ОТ не менее 10, но к JN.1 заметно их значительное уменьшение. Особенно это касается выборки 2020 г. Следовательно, к актуальному в 2025 г. JN.1 в обоих группах образцов заметно ослабление протективности. Очевидно антигенные изменения белка S в результате спонтанных мутаций позволяют актуальному варианту JN.1 в ряде случаев ускользать от воздействия нейтрализующих антител против предыдущих субвариантов Омикрона.

Сравнение среднегеометрических статистик также указывает на способность одних и тех же исследуемых образцов нейтрализовать вирусные частицы SARS-CoV-2 варианта В.1.1 активно, а JN.1 лишь незначительно. Хотя различия титров выборок 2020 г. и 2023 г. к обеим штаммам статистически достоверны. В порядке уменьшения нейтрализующей активности четыре выборки представляют последовательность: 2023 г. — к В.1.1, 2020 г. — к В.1.1, с большим отличием 2023 г. — к JN.1, 2020 г. — к JN.1.

Известно, что иммунитет без повторной стимуляции со временем слабеет [14], поэтому ожидалось что величина титров к близкому исходному дикому типу варианту В.1.1 будет выше в группе собранных в 2020 г. образцов. Поскольку это не так, к 2023 г. иммунитет к В.1.1 не ослабел. Вероятно, за время с первого контакта происходила повторная стимуляция при вакцинациях и инфицировании. Причем изменения в антигенах стимулировавших иммунитет последовательностей были не принципиальные и повторные контакты с измененными в результате спонтанных мутаций генетическими вариантами SARS-CoV-2 повысили исходную протективность.

Наши данные, полученные на образцах от людей, дополнили ранее полученные о кросс-реактивности гипериммунных сывороток мышей к различным вариантам коронавируса, когда наибольшая величина титров антител от иммунизированных разными штаммами приходится на более ранние, предшествовавшие остальным [1, 2].

Заключение

Сформированный гуморальный иммунитет к коронавирусу в группах доноров образцов 2020 и 2023 гг. показал относительное снижение титров нейтрализующих антител к VOI JN.1, актуальному генетическому варианту SARS-CoV-2.

Новые генетические варианты как последствие спонтанных мутаций необходимо тщательно отслеживать, ведь часть из них не будет подвержена влиянию иммунной защиты.

Таким образом, изложенные в работе результаты дополнили объем информации, позволяющий сформировать меры противодействия распространению SARS-CoV-2.

About the authors

Stepan A. Pyankov

State Research Centre of Virology and Biotechnology “Vector” of Rospotrebnadzor

Author for correspondence.
Email: pyankov_sa@vector.nsc.ru

Leading Researcher, Microorganisms Collection Department

Россия, Novosibirsk region, Koltsovo

A. V. Zaykovskaya

State Research Centre of Virology and Biotechnology “Vector” of Rospotrebnadzor

Email: pyankov_sa@vector.nsc.ru

PhD (Biology), Senior Researcher, Microorganisms Collection Department

Россия, Novosibirsk region, Koltsovo

A. V. Rybel

State Research Centre of Virology and Biotechnology “Vector” of Rospotrebnadzor

Email: pyankov_sa@vector.nsc.ru

Junior Researcher, Microorganisms Collection Department

Россия, Novosibirsk region, Koltsovo

S. A. Bodnev

State Research Centre of Virology and Biotechnology “Vector” of Rospotrebnadzor

Email: pyankov_sa@vector.nsc.ru

PhD (Medicine), Leading Researcher, Microorganisms Collection Department

Россия, Novosibirsk region, Koltsovo

O. V. Pyankov

State Research Centre of Virology and Biotechnology “Vector” of Rospotrebnadzor

Email: pyankov@vector.nsc.ru

PhD (Biology), Leading Researcher, Microorganisms Collection Department

Россия, Novosibirsk region, Koltsovo

References

Supplementary files