Expression of pro-inflammatory cytokines (IL-18, IL-33) at the level of the mucous membrane, the entry point of infection, in persons who have experienced COVID-19 disease

Cover Page


Cite item

Full Text

Abstract

Introduction. The mucous membrane of the upper respiratory tract is the entrance gate for a large number of infections, including the SARS-CoV-2 virus. That is why the main task of the immune system of the mucous membranes of the entrance gate of infection is to maintain respiratory function. High production of proinflammatory cytokines, which play a key role in the development of severe COVID-19 infection, leads to detrimental consequences for all body systems. Their long-term influence can not only aggravate chronic pathologies, but also significantly increase the recovery period, leading to a decrease in the quality of life of patients. Therefore, the purpose of this work is to study the expression of IL-18 and IL-33 genes at the level of the mucous membranes of the upper respiratory tract in patients who have had COVID-19 disease. Materials and methods. The present study involved patients who had moderate or severe COVID-19. The control group consisted of relatively healthy individuals. The expression levels of IL-18 and IL-33 were detected using RT-PCR. Results. During the entire period of rehabilitation after suffering from COVID-19, patients showed a tendency to increase the level of IL-18 expression at the level of the mucous membranes of the nasopharynx and oropharynx. The level of IL-33 production was also increased, but varied depending on the location and period of sample collection. Conclusion. This increase in the level of IL-18 during the rehabilitation period of patients after COVID-19 may be explained by the fact that the virus, by activating glia through olfactory receptor neurons, triggers a powerful immune response and promotes the production of a large number of pro-inflammatory cytokines. On the contrary, overexpression of IL-33 in the late stages of rehabilitation is most likely associated with its ability to restore barrier tissues of the mucous membranes of the upper respiratory tract. Thus, we can conclude that the virus promotes excessive production of pro-inflammatory cytokines, the amount of which increases maximally at the 6th month of rehabilitation after suffering from COVID-19.

Full Text

Введение

Заболевание COVID-19, вызываемая вирусом SARS-CoV-2, представляет собой системное полиорганное заболевание, которое характеризуется широким спектром тяжести от бессимптомного течения до летального исхода, особенно в группах риска. Высокое базовое репродуктивное число (Ro) инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2, распространилась повсеместно. За 3 года пандемии были зарегистрированы более чем 5 штаммов вируса SARS-CoV-2, что связано со способностью вирусных частиц быстро эволюционировать. Такой стремительный мутационный процесс вируса SARS-CoV-2 свидетельствует о возможности появления новых штаммов вируса, которые могут нести очередную угрозу общественному здравоохранению. На сегодняшний день известно, что протекание заболевания COVID-19 зависит не только от штамма вируса, но и от других факторов. Вовлеченность иммунной системы в патофизиологический процесс заболевания COVID-19 в значительной степени влияет как на тяжесть течения заболевание, так и на процесс выздоровления. Известно так же о том, что у пациентов, перенесших COVID-19 сохраняется нарушение равновесия между врожденной и адаптивной иммунной системы, что свидетельствует о том, что инфекция, вызванная SARS-CoV-2, является иммуноопосредованным заболеванием. Пациенты, перенесшие COVID-19, сохраняют стойкие симптомы нарушения здоровья в течении длительного времени после перенесенного заболевания.

На сегодняшний день доказана ключевая роль цитокинов в развитии тяжелого течения данного заболевания [1, 2]. Цитокиновые маркеры представляют собой группу полипептидных сигнальных молекул, которые могут индуцировать и регулировать многие клеточные биологические процессы путем стимуляции клеточных рецепторов на поверхности [5]. Исследования показали, что инфекция SARS-CoV-2 способна вызывать специфические воспалительные реакции в организме. Семейство IL-1, которое включает IL-1(α, β) IL-18 и IL-33 и др. цитокины, играет важную и центральную роль в регуляции воспалительных реакций, включая инфекционные воспаления в организме [4]. Интерлейкин-18 обладает важной способностью организма противостоять инфекциям. Помимо мощной индукции IFNγ, IL-18 активирует Т клетки киллеры, которые играют центральную роль в клиренсе вируса, что указывает на протективную роль IL-18 в вирусной инфекции [9, 11]. Другой член семейства интерлейкина 1, IL-33 играет важную роль в гомеостазе легких благодаря своему действию на процессы заживления ран, фиброза и ремоделирования [7]. Однако, заражение вирусом SARS-CoV-2 вызывает мощную гипервос палительную реакцию, которая не только приводит к тяжелому течению самого заболевания, но и способна длительное время после перенесенного заболевания в значительной степени влиять на организм. Такое длительное влияние на организм, способно усугублять хронические патологии, увеличивать период восстановления после тяжелого течения заболевания COVID-19 и снижать качество жизни у лиц, перенесших данное заболевание. Исследования экспрессионного профиля молекул провоспалительных цитокинов на уровне слизистых оболочек входных ворот инфекции позволит лучше понять патогенез самого заболевания COVID-19. Поэтому цель данной работы изучение экспрессии генов IL-18, IL-33 на уровне слизистых оболочек входных ворот инфекции у пациентов, перенесших заболевание COVID-19.

Материалы и методы

В настоящее исследование были включены пациенты (n = 25) перенесшие заболевание COVID-19. Контрольную группу составили (n = 30) условно здоровые пациенты, контактировавших с инфекцией SARS-CoV-2, но без подтвержденного анализа на SARS-CoV-2. В работе использовали биоматериал в виде соскобов слизистых оболочек ротоглотки и носоглотки. Забор материала производился цитощеточкой типа А (Юнона, РФ) и транспортировался в лабораторию в пробирке на 1,5 мл в физиологичес ком растворе (Панеко, РФ) в закрытом пакете. Исследование проводилось при информированном согласии пациентов.

Из полученного биоматериала выделяли РНК методом сорбции на селикагеле с использованием коммерческого набора «РИБО-сорб» (Amplisense, Россия) в соответствии с протоколом проведения для данного набора. Проверка качества выделенной РНК для исследования экспрессии генов осуществлялась с помощью спектрофотометра Nanodrop 2000® (Thermo Scientific, США). Реакцию обратной транскрипции и последующую ПЦР-РВ анализ проводили с помощью коммерческих наборов «Набор для обратной траскрипции ОТ-1» «Набор реагентов для проведения ПЦР-РВ в присутствии красителя SYBR Green I» (Синтол, РФ). Последовательность праймеров для генов IL-18, IL-33 подбирали с помощью программы Vector NTI, анализируя последовательность интересующих генов, полученную из GenBank.

Стандартизация результатов ПЦР-РВ проводилась по уровню экспрессии гена «домашнего хозяйства» β-актина. Обхват экспрессии гена был посчитан методом относительного анализа экспрессии гена с использованием метода ∆∆Ct.

Результаты и обсуждение

Слизистая оболочка носоглотки и ротоглотки постоянно подвергаются вдыхаемым аллергенам, канцерогенам и патогенам, таким как респираторные вирусы. Полости носоглотки и ротоглотки являются местом как проникновения вируса, так и местом начальной репликации SARS-CoV-2. Иммунный ответ на вирусные инфекции инициируется врожденной иммунной системой, которая распознает патогены и индуцирует выработку провоспалительных цитокинов и хемокинов. Активация распознающих структур врожденного иммунитета и последующая выработка провоспалительных цитокинов способна эффективно элиминировать вирусные частицы, однако при длительном воздействии вируса SARS-CoV-2 может вызывать затяжной воспалительный процесс, который приводит как к тяжелому течению заболевания, так и к летальному исходу COVID-19. Для поддержания респираторной функции, иммунная система слизистой оболочки входных ворот инфекции должна соблюдать тщательный баланс между минимизацией повреждения тканей, вызванного воспалением, и адекватным действием на такие угрозы, как инфекция SARS-CoV-2. Длительная гипервоспалительная реакция с высокой продукцией провоспалительных цитокинов в дальнейшем может приводить к повреждению тканей и к системному воспалению. Хотя было множество работ по профилированию динамики иммунного ответа у пациентов с COVID-19, включая передовые методы анализа отдельных клеток, практически все эти исследования были сосредоточены на системном уровне [4, 10]. Поэтому оценка уровня экспрессии эффекторных молекул врожденного иммунитета, таких как IL-18, IL-33 в период реабилитационного процесса у лиц, перенесших COVID-19, поможет раскрыть молекулярные процессы, происходящие в иммунной системе на уровне слизистых оболочек. В работе получены следующие результаты (рис. 1).

 

Рисунок 1. Экспрессия IL-18 на уровне слизистых оболочек входных ворот инфекции у лиц, перенесших заболевание COVID-19

Figure 1. Expression of IL-18 at the level of mucous membranes at the entrance gates of infection in individuals who have had COVID-19 disease

Примечание. А. Экспрессия IL-18 на уровне слизистой оболочки носоглотки. По оси абсцисс — время и группы, по оси ординат — относительные единицы от числа копий β-актина. Б. Экспрессия IL-18 на уровне слизистой оболочки ротоглотки. По оси абсцисс — время и группы, по оси ординат — относительные единицы отчисла копий β-актина.

Note. A. IL-18 expression at the level of the nasopharyngeal mucosa. The x-axis is time and groups. Y axis Relative units of β-actin copy number. B. Expression of IL-18 at the level oropharyngeal of the mucosa. The x-axis is time and groups, y-axis — relative units of number of β-actin copies.

 

 

Нами была выявлена тенденция к увеличению экспрессии гена IL-18 на уровне слизистых оболочек носоглотки и ротоглотки у лиц, перенесших заболевание COVID-19, в течении всего периода реабилитации (4, 6, 8 месяцы после перенесенного заболевания), однако достоверных отличий не было выявлено. Повышенный уровень экспрессии провоспалительного цитокина IL-18 может объясняться тем, что вирус, действуя на слизистый эпителий входных ворот инфекции, запускает мощный провопалительный процесс на уровне слизистых оболочек и в дальнейшем, как только вирус попадает в нейроны обонятельных рецепторов, инфекция распространяется через синаптические связи. В случае оси «нейроны обонятельных рецепторов–митральные клетки» происходит активация глии, которая, в свою очередь, способствует высвобождению провоспалительных цитокинов, таких как IL-1α, IL-1β, IL-18, и др. [3, 8, 11]. Такая гипервоспалительная реакция может вызвать, как легкие симптомы аноcмии, которые продолжаются после заболевания COVID-19, так серьезные длительные повреждение центральной нервной системы.

 

Рисунок 2. Экспрессия IL-33 на уровне слизистой входных ворот инфекции у лиц, перенесших заболевание COVID-19

Figure 2. Expression of IL-33 at the mucosal level at the entry gates of infection in individuals who have had COVID-19 disease

Примечание. А. Экспрессия IL-33 на уровне слизистой оболочки ротоглотки. По оси абсцисс время и группы, по оси ординат — относительные единицы от числа копий β-актина. * — p ≤ 0,05 по тесту Манна–Уитни. Б. Экспрессия IL-33 на уровне слизистой оболочки носоглотки. По оси абсцисс время и группы, по оси ординат — относительные единицы отчисла копий β-актина. * — p ≤ 0,05 по тесту Манна–Уитни.

Note. A. IL-33 expression at the level of the oropharyngeal mucosa. The x-axis is time and groups. Y axis Relative units of β-actin copy number. * — p ≤ 0.05 by Mann–Whitney test. B. Expression of IL-33 at the level of the nasopharyngeal mucosa. The x-axis is time and groups, y axis — relative units of number of β-actin copies. * — p ≤ 0.05 by Mann–Whitney test.

 

Заражение вирусом SARS-CoV-2 приводит к высвобождению IL-33, а повышенные уровни IL-33 связывают с тяжестью и неблагоприятными исходами при COVID-19. Роль IL-33 при COVID-19 может быть связана с регуляцией интерферона (IFNs) [6]. Известно, что вирусные инфекции приводят к повышенному высвобождению IFNs, а также уровням IL-33, а IFNγ ингибирует активацию и пролиферацию врожденных лимфоидных клеток типа II через IL-33-зависимый путь и способствует иммунному ответу Th1. IL-33, являясь основным участником цитокинового шторма, играет ключевую роль в патологических изменениях после заболевания COVID-19 [6]. Нами было выявлено (рис. 2) достоверное увеличение в 13,1 раз уровня экспрессии IL-33 на уровне слизистой оболочки ротоглотки на 6 месяц после перенесенного заболевания COVID-19. Так же нами была выявлена тенденция к увеличению (p = 0,068) в 4,6 раз на 8 месяц реабилитации после перенесенного заболевания COVID-19 на уровне слизистой оболочки ротоглотки. На уровне слизистой оболочки носоглотки наблюдалось достоверное увеличение уровня экспрессии IL-33 в 79,8, 1447,3 и 1371 раз на 4-й, 6-й, 8-й месяцы после перенесенного заболевание соответственно относительно контрольной группы. Такая гиперэкспрессия IL-33 у лиц перенесших заболевание COVID-19 может быть связана с тем что на поздних стадиях заболевания COVID-19 IL-33 индуцирует гиперактивацию ILC2, дифференцировку поочередно активированных макрофагов М² и секрецию TGF-β и IL-13 из тучных клеток, что может приводить к трансформации эпителиальных клеток в мезенхимальные клетки и в дальнейшем приводить к легочному фиброзу [12]. Полученные данные позволяют предположить, что IL-33 является ключевым медиатором не только в острой фазе инфекции SARS-CoV-2, но также в процессах заживления ран и восстановления барьерных тканей слизистых оболочек входных ворот инфекции. Несмотря на открытия относительно патофизиологии инфекции, сложность механизмов, участвующих в развитии COVID-19, все еще остается множество вопросов как относительно самого заболевания, так и патологических состояний после перенесенного COVID-19. Более того, участие многих медиаторов, включая воспалительные цитокины, вовлеченность слизис тых оболочек, делает исследования еще более сложными. Таким образом, изучение экспрессии эффекторных молекул врожденного иммунитета, приводящих как к развитию тяжелого течения заболевания COVID-19, так и длительным изменениям в иммунной системе в течение времени после выздоровления, позволяет лучше понять молекулярные механизмы, связанные COVID-19.

Благодарности

Авторы выражают благодарность доктор медицинских наук, профессору, члену-корреспонденту РАН Свитич О.А. а также доктор медицинских наук, профессору, члену-корреспонденту РАН Костинову М.П. за всестороннюю помощь в разработке концепции исследования, а также за предоставление материала исследования.

Авторы благодарят сотрудников кафедры госпитальной терапии ПФ РНИМУ им. Н.И. Пирогова: академика РАН, доктор медицинских наук, профессора, заведующего кафедрой госпитальной терапии ПФ Чучалина А.Г. а также профессора кафедры госпитальной терапии ПФ Барановой И.А.

×

About the authors

Nadezhda D. Rasskazova

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Author for correspondence.
Email: neonovita@mail.ru

Junior Researcher, Laboratory of Molecular Immunology

Russian Federation, 105064, Moscow, Maly Kazenny lane, 5a

N. D. Abramova

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: neonovita@mail.ru

Junior Research Associate, Laboratory of Molecular Immunology

Russian Federation, 105064, Moscow, Maly Kazenny lane, 5a

T. D. Soshchenko

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera; I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: neonovita@mail.ru

Research Laboratory Assistant, Laboratory of Molecular Immunology, 6th year Student at the International School “Medicine of the Future”, Department of Biological Chemistry

Russian Federation, 105064, Moscow, Maly Kazenny lane, 5a; Moscow

N. O. Kalyuzhnaya

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: neonovita@mail.ru

Junior Research Associate, Laboratory of Molecular Immunology

Russian Federation, 105064, Moscow, Maly Kazenny lane, 5a

E. A. Meremianina

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera; Russian Medical Academy of Continuous Professional Education

Email: neonovita@mail.ru

PhD (Medicine), Researcher, Laboratory of Molecular Immunology, Senior Lecturer, Department of Virology

Russian Federation, 105064, Moscow, Maly Kazenny lane, 5a; Moscow

M. N. Shatokhin

Russian Medical Academy of Continuous Professional Education

Email: neonovita@mail.ru
Russian Federation, Moscow

T. A. Zaitseva

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: neonovita@mail.ru

PhD (Medicine), Associate Professor, Vorobiev Department of Microbiology, Virology and Immunology, Erisman Institute of Public Health

Russian Federation, Moscow

References

  1. Свитич О.А., Филина А.Б., Давыдова Н.В., Ганковская Л.В, Зверев В.В. Роль факторов врожденного иммунитета в процессе опухолеобразования // Медицинская иммунология. 2018. Т. 20, № 2. С. 151–162. [Svitich O.A., Filina A.B., Davydova N.V., Gankovskaya L.V., Zverev V.V. The role of innate immune factors in the process of tumor formation. Meditsinskaya immunologiya = Medical Immunology (Russia), 2018, vol. 20, no. 2, pp. 151–162. (In Russ.)] doi: 10.15789/1563-0625-2018-2-151-162
  2. Хашукоева А.З., Свитич О.А., Маркова Э.А., Отдельнова О.Б., Хлынова С.А., Фотодинамическая терапия — противовирусная терапия? История вопроса. Перспективы применения // Лазерная медицина. 2012. Т. 16, № 2. C. 63–67. [Hashukoeva A.Z., Svitich O.A., Markova E.A., Otdel’nova O.B., Hlynova S.A. Photodynamic therapy — antiviral therapy? History of the issue. Prospects for use. Lazernaya meditsina = Laser Medicine, 2012, vol. 16, no. 2, pp. 63–67. (In Russ.)]
  3. Alboni S., Cervia D., Sugama S., Conti B. Interleukin 18 in the CNS. J. Neuroinflammation, 2010, vol. 7: 9.
  4. Bartee E., McFadden G. Cytokine synergy: an underappreciated contributor to innate anti-viral immunity. Cytokine, 2013, vol. 63, no. 3, pp. 237–240.
  5. Fathi F., Sami R., Mozafarpoor S., Hafezi H., Motedayyen H., Arefnezhad R., Eskandari N. Immune system changes during COVID-19 recovery play key role in determining disease severity. Int. J. Immunopathol. Pharmacol., 2020, vol. 34: 2058738420966497.
  6. Gao Y., Cai L., Li L., Zhang Y., Li J., Luo C., Wang Y., Tao L. Emerging Effects of IL-33 on COVID-19. Int. J. Mol. Sci., 2022, vol. 23, no 21: 13656.
  7. Gaurav R., Poole J.A. Interleukin (IL)-33 Immunobiology in Asthma and Airway Inflammatory Diseases. J. Asthma, 2022, vol. 59, no 12, pp. 2530–2538.
  8. Gea-Mallorquí E. IL-18-dependent MAIT cell activation in COVID-19. Nat. Rev. Immunol., 2020, vol. 20, no 12: 719.
  9. Schooling C.M., Li M., Au Yeung S.L. Interleukin-18 and COVID-19. Epidemiol. Infect., 2021, vol. 150: e14.
  10. Schultheiß C., Willscher E., Paschold L., Gottschick C., Klee B., Bosurgi L., Dutzmann J., Sedding D., Frese T., Girndt M., Höll J.I., Gekle M., Mikolajczyk R., Binder M. Liquid biomarkers of macrophage dysregulation and circulating spike protein illustrate the biological heterogeneity in patients with post-acute sequelae of COVID-19. J. Med. Virol., 2023, vol. 95, no 1: e28364.
  11. Yasuda K., Nakanishi K., Tsutsui H. Interleukin-18 in Health and Disease. Int. J. Mol. Sci., 2019, vol. 20, no. 3: 649.
  12. Zizzo G., Cohen P.L. Imperfect storm: is interleukin-33 the Achilles heel of COVID-19? Lancet Rheumatol., 2020, vol. 2, no. 12, pp. e779–e790. doi: 10.1016/S2665-9913(20)30340-4

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Figure 1. Expression of IL-18 at the level of mucous membranes at the entrance gates of infection in individuals who have had COVID-19 disease

Download (664KB)
Indexing metadata
3. Figure 2. Expression of IL-33 at the mucosal level at the entry gates of infection in individuals who have had COVID-19 disease

Download (700KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2024 Rasskazova N.D., Abramova N.D., Soshchenko T.D., Kalyuzhnaya N.O., Meremianina E.A., Shatokhin M.N., Zaitseva T.A.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 64788 от 02.02.2016.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies