Экспрессия провоспалительных цитокинов (IL-18, IL-33) на уровне слизистой оболочки входных ворот инфекции у лиц, перенесших заболевание COVID-19

Полный текст

Введение

Заболевание COVID-19, вызываемая вирусом SARS-CoV-2, представляет собой системное полиорганное заболевание, которое характеризуется широким спектром тяжести от бессимптомного течения до летального исхода, особенно в группах риска. Высокое базовое репродуктивное число (Ro) инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2, распространилась повсеместно. За 3 года пандемии были зарегистрированы более чем 5 штаммов вируса SARS-CoV-2, что связано со способностью вирусных частиц быстро эволюционировать. Такой стремительный мутационный процесс вируса SARS-CoV-2 свидетельствует о возможности появления новых штаммов вируса, которые могут нести очередную угрозу общественному здравоохранению. На сегодняшний день известно, что протекание заболевания COVID-19 зависит не только от штамма вируса, но и от других факторов. Вовлеченность иммунной системы в патофизиологический процесс заболевания COVID-19 в значительной степени влияет как на тяжесть течения заболевание, так и на процесс выздоровления. Известно так же о том, что у пациентов, перенесших COVID-19 сохраняется нарушение равновесия между врожденной и адаптивной иммунной системы, что свидетельствует о том, что инфекция, вызванная SARS-CoV-2, является иммуноопосредованным заболеванием. Пациенты, перенесшие COVID-19, сохраняют стойкие симптомы нарушения здоровья в течении длительного времени после перенесенного заболевания.

На сегодняшний день доказана ключевая роль цитокинов в развитии тяжелого течения данного заболевания [1, 2]. Цитокиновые маркеры представляют собой группу полипептидных сигнальных молекул, которые могут индуцировать и регулировать многие клеточные биологические процессы путем стимуляции клеточных рецепторов на поверхности [5]. Исследования показали, что инфекция SARS-CoV-2 способна вызывать специфические воспалительные реакции в организме. Семейство IL-1, которое включает IL-1(α, β) IL-18 и IL-33 и др. цитокины, играет важную и центральную роль в регуляции воспалительных реакций, включая инфекционные воспаления в организме [4]. Интерлейкин-18 обладает важной способностью организма противостоять инфекциям. Помимо мощной индукции IFNγ, IL-18 активирует Т клетки киллеры, которые играют центральную роль в клиренсе вируса, что указывает на протективную роль IL-18 в вирусной инфекции [9, 11]. Другой член семейства интерлейкина 1, IL-33 играет важную роль в гомеостазе легких благодаря своему действию на процессы заживления ран, фиброза и ремоделирования [7]. Однако, заражение вирусом SARS-CoV-2 вызывает мощную гипервос палительную реакцию, которая не только приводит к тяжелому течению самого заболевания, но и способна длительное время после перенесенного заболевания в значительной степени влиять на организм. Такое длительное влияние на организм, способно усугублять хронические патологии, увеличивать период восстановления после тяжелого течения заболевания COVID-19 и снижать качество жизни у лиц, перенесших данное заболевание. Исследования экспрессионного профиля молекул провоспалительных цитокинов на уровне слизистых оболочек входных ворот инфекции позволит лучше понять патогенез самого заболевания COVID-19. Поэтому цель данной работы изучение экспрессии генов IL-18, IL-33 на уровне слизистых оболочек входных ворот инфекции у пациентов, перенесших заболевание COVID-19.

Материалы и методы

В настоящее исследование были включены пациенты (n = 25) перенесшие заболевание COVID-19. Контрольную группу составили (n = 30) условно здоровые пациенты, контактировавших с инфекцией SARS-CoV-2, но без подтвержденного анализа на SARS-CoV-2. В работе использовали биоматериал в виде соскобов слизистых оболочек ротоглотки и носоглотки. Забор материала производился цитощеточкой типа А (Юнона, РФ) и транспортировался в лабораторию в пробирке на 1,5 мл в физиологичес ком растворе (Панеко, РФ) в закрытом пакете. Исследование проводилось при информированном согласии пациентов.

Из полученного биоматериала выделяли РНК методом сорбции на селикагеле с использованием коммерческого набора «РИБО-сорб» (Amplisense, Россия) в соответствии с протоколом проведения для данного набора. Проверка качества выделенной РНК для исследования экспрессии генов осуществлялась с помощью спектрофотометра Nanodrop 2000^® (Thermo Scientific, США). Реакцию обратной транскрипции и последующую ПЦР-РВ анализ проводили с помощью коммерческих наборов «Набор для обратной траскрипции ОТ-1» «Набор реагентов для проведения ПЦР-РВ в присутствии красителя SYBR Green I» (Синтол, РФ). Последовательность праймеров для генов IL-18, IL-33 подбирали с помощью программы Vector NTI, анализируя последовательность интересующих генов, полученную из GenBank.

Стандартизация результатов ПЦР-РВ проводилась по уровню экспрессии гена «домашнего хозяйства» β-актина. Обхват экспрессии гена был посчитан методом относительного анализа экспрессии гена с использованием метода ∆∆Ct.

Результаты и обсуждение

Слизистая оболочка носоглотки и ротоглотки постоянно подвергаются вдыхаемым аллергенам, канцерогенам и патогенам, таким как респираторные вирусы. Полости носоглотки и ротоглотки являются местом как проникновения вируса, так и местом начальной репликации SARS-CoV-2. Иммунный ответ на вирусные инфекции инициируется врожденной иммунной системой, которая распознает патогены и индуцирует выработку провоспалительных цитокинов и хемокинов. Активация распознающих структур врожденного иммунитета и последующая выработка провоспалительных цитокинов способна эффективно элиминировать вирусные частицы, однако при длительном воздействии вируса SARS-CoV-2 может вызывать затяжной воспалительный процесс, который приводит как к тяжелому течению заболевания, так и к летальному исходу COVID-19. Для поддержания респираторной функции, иммунная система слизистой оболочки входных ворот инфекции должна соблюдать тщательный баланс между минимизацией повреждения тканей, вызванного воспалением, и адекватным действием на такие угрозы, как инфекция SARS-CoV-2. Длительная гипервоспалительная реакция с высокой продукцией провоспалительных цитокинов в дальнейшем может приводить к повреждению тканей и к системному воспалению. Хотя было множество работ по профилированию динамики иммунного ответа у пациентов с COVID-19, включая передовые методы анализа отдельных клеток, практически все эти исследования были сосредоточены на системном уровне [4, 10]. Поэтому оценка уровня экспрессии эффекторных молекул врожденного иммунитета, таких как IL-18, IL-33 в период реабилитационного процесса у лиц, перенесших COVID-19, поможет раскрыть молекулярные процессы, происходящие в иммунной системе на уровне слизистых оболочек. В работе получены следующие результаты (рис. 1).

 

Рисунок 1. Экспрессия IL-18 на уровне слизистых оболочек входных ворот инфекции у лиц, перенесших заболевание COVID-19

Figure 1. Expression of IL-18 at the level of mucous membranes at the entrance gates of infection in individuals who have had COVID-19 disease

Примечание. А. Экспрессия IL-18 на уровне слизистой оболочки носоглотки. По оси абсцисс — время и группы, по оси ординат — относительные единицы от числа копий β-актина. Б. Экспрессия IL-18 на уровне слизистой оболочки ротоглотки. По оси абсцисс — время и группы, по оси ординат — относительные единицы отчисла копий β-актина.

Note. A. IL-18 expression at the level of the nasopharyngeal mucosa. The x-axis is time and groups. Y axis Relative units of β-actin copy number. B. Expression of IL-18 at the level oropharyngeal of the mucosa. The x-axis is time and groups, y-axis — relative units of number of β-actin copies.

 

 

Нами была выявлена тенденция к увеличению экспрессии гена IL-18 на уровне слизистых оболочек носоглотки и ротоглотки у лиц, перенесших заболевание COVID-19, в течении всего периода реабилитации (4, 6, 8 месяцы после перенесенного заболевания), однако достоверных отличий не было выявлено. Повышенный уровень экспрессии провоспалительного цитокина IL-18 может объясняться тем, что вирус, действуя на слизистый эпителий входных ворот инфекции, запускает мощный провопалительный процесс на уровне слизистых оболочек и в дальнейшем, как только вирус попадает в нейроны обонятельных рецепторов, инфекция распространяется через синаптические связи. В случае оси «нейроны обонятельных рецепторов–митральные клетки» происходит активация глии, которая, в свою очередь, способствует высвобождению провоспалительных цитокинов, таких как IL-1α, IL-1β, IL-18, и др. [3, 8, 11]. Такая гипервоспалительная реакция может вызвать, как легкие симптомы аноcмии, которые продолжаются после заболевания COVID-19, так серьезные длительные повреждение центральной нервной системы.

 

Рисунок 2. Экспрессия IL-33 на уровне слизистой входных ворот инфекции у лиц, перенесших заболевание COVID-19

Figure 2. Expression of IL-33 at the mucosal level at the entry gates of infection in individuals who have had COVID-19 disease

Примечание. А. Экспрессия IL-33 на уровне слизистой оболочки ротоглотки. По оси абсцисс время и группы, по оси ординат — относительные единицы от числа копий β-актина. * — p ≤ 0,05 по тесту Манна–Уитни. Б. Экспрессия IL-33 на уровне слизистой оболочки носоглотки. По оси абсцисс время и группы, по оси ординат — относительные единицы отчисла копий β-актина. * — p ≤ 0,05 по тесту Манна–Уитни.

Note. A. IL-33 expression at the level of the oropharyngeal mucosa. The x-axis is time and groups. Y axis Relative units of β-actin copy number. * — p ≤ 0.05 by Mann–Whitney test. B. Expression of IL-33 at the level of the nasopharyngeal mucosa. The x-axis is time and groups, y axis — relative units of number of β-actin copies. * — p ≤ 0.05 by Mann–Whitney test.

 

Заражение вирусом SARS-CoV-2 приводит к высвобождению IL-33, а повышенные уровни IL-33 связывают с тяжестью и неблагоприятными исходами при COVID-19. Роль IL-33 при COVID-19 может быть связана с регуляцией интерферона (IFNs) [6]. Известно, что вирусные инфекции приводят к повышенному высвобождению IFNs, а также уровням IL-33, а IFNγ ингибирует активацию и пролиферацию врожденных лимфоидных клеток типа II через IL-33-зависимый путь и способствует иммунному ответу Th1. IL-33, являясь основным участником цитокинового шторма, играет ключевую роль в патологических изменениях после заболевания COVID-19 [6]. Нами было выявлено (рис. 2) достоверное увеличение в 13,1 раз уровня экспрессии IL-33 на уровне слизистой оболочки ротоглотки на 6 месяц после перенесенного заболевания COVID-19. Так же нами была выявлена тенденция к увеличению (p = 0,068) в 4,6 раз на 8 месяц реабилитации после перенесенного заболевания COVID-19 на уровне слизистой оболочки ротоглотки. На уровне слизистой оболочки носоглотки наблюдалось достоверное увеличение уровня экспрессии IL-33 в 79,8, 1447,3 и 1371 раз на 4-й, 6-й, 8-й месяцы после перенесенного заболевание соответственно относительно контрольной группы. Такая гиперэкспрессия IL-33 у лиц перенесших заболевание COVID-19 может быть связана с тем что на поздних стадиях заболевания COVID-19 IL-33 индуцирует гиперактивацию ILC2, дифференцировку поочередно активированных макрофагов М² и секрецию TGF-β и IL-13 из тучных клеток, что может приводить к трансформации эпителиальных клеток в мезенхимальные клетки и в дальнейшем приводить к легочному фиброзу [12]. Полученные данные позволяют предположить, что IL-33 является ключевым медиатором не только в острой фазе инфекции SARS-CoV-2, но также в процессах заживления ран и восстановления барьерных тканей слизистых оболочек входных ворот инфекции. Несмотря на открытия относительно патофизиологии инфекции, сложность механизмов, участвующих в развитии COVID-19, все еще остается множество вопросов как относительно самого заболевания, так и патологических состояний после перенесенного COVID-19. Более того, участие многих медиаторов, включая воспалительные цитокины, вовлеченность слизис тых оболочек, делает исследования еще более сложными. Таким образом, изучение экспрессии эффекторных молекул врожденного иммунитета, приводящих как к развитию тяжелого течения заболевания COVID-19, так и длительным изменениям в иммунной системе в течение времени после выздоровления, позволяет лучше понять молекулярные механизмы, связанные COVID-19.

Благодарности

Авторы выражают благодарность доктор медицинских наук, профессору, члену-корреспонденту РАН Свитич О.А. а также доктор медицинских наук, профессору, члену-корреспонденту РАН Костинову М.П. за всестороннюю помощь в разработке концепции исследования, а также за предоставление материала исследования.

Авторы благодарят сотрудников кафедры госпитальной терапии ПФ РНИМУ им. Н.И. Пирогова: академика РАН, доктор медицинских наук, профессора, заведующего кафедрой госпитальной терапии ПФ Чучалина А.Г. а также профессора кафедры госпитальной терапии ПФ Барановой И.А.

Об авторах

Надежда Дмитриевна Рассказова

ФГБНУ Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Автор, ответственный за переписку.
Email: neonovita@mail.ru

младший научный сотрудник лаборатории молекулярной иммунологии

Россия, 105064, Москва, Малый Казенный пер., 5а

Н. Д. Абрамова

ФГБНУ Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Email: neonovita@mail.ru

младший научный сотрудник лаборатории молекулярной иммунологии

Россия, 105064, Москва, Малый Казенный пер., 5а

Т. Д. Сощенко

ФГБНУ Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова; ФГАОУ ВО Первый московский медицинский университет им. И.М. Сеченова (Сеченовский Университет)

Email: neonovita@mail.ru

лаборант-исследователь лаборатории молекулярной иммунологии, студентка 6 курса Международной школы «Медицина будущего», кафедра биологической химии

Россия, 105064, Москва, Малый Казенный пер., 5а; Москва

Н. О. Калюжная

ФГБНУ Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

Email: neonovita@mail.ru

младший научный сотрудник лаборатории молекулярной иммунологии

Россия, 105064, Москва, Малый Казенный пер., 5а

Е. А. Меремьянина

ФГБНУ Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова; ФГБОУ ДПО Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования МЗ РФ

Email: neonovita@mail.ru

кандидат медицинских наук, научный сотрудник лаборатории молекулярной иммунологии, старший преподаватель кафедры вирусологии

Россия, 105064, Москва, Малый Казенный пер., 5а; Москва

М. Н. Шатохин

ФГБОУ ДПО Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования МЗ РФ

Email: neonovita@mail.ru
Россия, Москва

Т. А. Зайцева

ФГАОУ ВО Первый московский медицинский университет им. И.М. Сеченова (Сеченовский Университет)

Email: neonovita@mail.ru

кандидат медицинских наук, доцент кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии им. акад. А.А. Воробьева института общественного здоровья им. Ф.Ф. Эрисмана

Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы