Description of environmental stress mediators in Candida species

Full Text

Введение

В литературе приведена колоссальная информация о различных факторах активации транскрипции у грибов рода Candida [16, 26]. Но для более подробного раскрытия сути понятия медиаторы экологического стресса (МЭС), остановимся на изучении цинк-кластерных факторов транскрипции ТAC1 (Transcriptional activator of CDR) и МRR1 (Multidrug resistance regulator), одной из функций которых является регуляция оттока из клетки флуконазола — широко используемого триазольного антифунгального препарата в терапевтической практике при лечении кандидозов. В статье будут систематизированы полученные сведения по работе этих регуляторов транскрипционной активности генов-мишеней CDR1, CDR2 (Сandida drug resistance) и МDR1 (Мultidrug resistance) и описано их участие в регуляции метаболизма, претерпевающего изменения под воздействием на клетку одного экологического фактора. В результате трансформации процессов жизнедеятельности повышается резистентность к лекарственному препарату у изучаемых микромицетов за счет работы эффлюксных белков двух суперсемейств: АТФ-связывающих кассет (ATP-binding cassette (ABC) и основных фасилитаторов (Major-Facilitator superfamily (MFS).

Цель исследования — описать роль цинк-кластерных факторов транскрипции Тac1 и Мrr1 в процессе приобретения резистентных свойств грибами рода Candida по отношению к флуконазолу и определить их функциональное значение в качестве медиаторов экологического стресса.

Роль цинк-кластерных факторов транскрипции ТAC1 и МRR1 в формировании резистентных свойств у грибов рода Candida

Адаптация к широкому диапазону экологических ниш в организме хозяина, способность переходить от комменсального к паразитическому образу существования, приобретение резистентных свойств к антифугальным препаратам и другие стойкие фенотипические изменения объясняются наличием у видов рода Candida сложных программ регуляции транскрипции генов. Благодаря РНК-секвенированию генома Candida glabrata было установлено, что в состоянии стресса, вызванного флуконазолом, Mar1 контролирует работу 337 генов-мишеней [23].

Факторы транскрипции позволяют патогенным грибам должным образом реагировать на изменения окружающей среды и перестраивать свои физиологические процессы под новые условия. У вида Candida albicans описано более 80 факторов транскрипции цинкового кластера — это цинксодержащие белковые молекулы, характеризующиеся наличием консервативных ДНК-связывающих мотивов — цинковых пальцев, которые при воздействии с наследственным аппаратом клетки изменяют уровень экспрессии генов-мишеней. Примером продуктов экспрессии таких генов являются хорошо изученные эффлюксные белки двух суперсемейств — ABC и MFS, участвующие в транспорте веществ [2, 17].

Интегральные мембранные белки, ABC-транспортеры, локализованные во внешней плазматической мембране или в мембранах внутриклеточных органелл, способны транспортировать широкий спектр агентов, включая ионы, стероиды, сахара, аминокислоты, витамины и пептиды, используя в качестве энергии для транспорта веществ молекулы аденозинтрифосфата (АТФ).

Среди 28 предполагаемых ABC-транспортеров, описаных у C. albicans, белок лекарственной устойчивости Candida (Сandida drug resistance (Cdr1p) является основным переносчиком лекарств. Установлено, что 28 ABC-транспортеров у вида Candida auris участвуют в формировании клинически значимых фенотипов благодаря возникновению резистентности к многочисленным антифугальным препаратам. Следует отметить, что мембранные транспортеры семейства ABC широко распространены в природе и встречаются как в организме бактерий, так и человека.

Фасилитаторы MFS являются консервативными белками только бактерий и грибов. Данный факт позволяет рассматривать эти мембранные транспортеры в качестве мишени для разработки новых антифугальных препаратов. Эффлюксные белки MFS для выполнения своих функций используют протонный градиент плазматической мембраны [1, 6, 10, 24, 29].

Из огромного количества описанных механизмов лекарственной устойчивости [3] одним из наиболее известных является нарушение накопления лекарств внутри клетки грибов в результате усиления регуляции мембраносвязанных транспортеров. Например, мутации усиления функции (Gain-of-function mutations (GOF) в генах, кодирующих цинк-кластерные факторы транскрипции ТAC1 и МRR1, приводят к конститутивной сверхэкспрессии соответствующих генов-мишеней (CDR1, CDR2 и МDR1) и повышают устойчивость к флуконазолу у представителей рода Candida за счет усиления работы эффлюксных белков (АВС и MFS). Кроме того, каждый активатор транскрипции способен изменять и свою собственную экспрессию, регулируя количество белка в клетке [10]. Влияние флуконазола на уровень экспрессии эффлюксных белков внутри клеток грибов рода Candida схематически изображен в табл. 1.

Таблица 1. Путь передачи информации от факторов транскрипции к мембранным транспортерам при возникновении резистентности к флуконазолу у грибов рода Candidа

Table 1. A crosstalk between transcription factors and membrane transporters in fluconazole resistance emerging in genus Candida

Примечание. В таблице указано расположение генов на хромосомах в кариотипе C. albicans [20].

Note. Gene location on chromosomes in C. albicans karyotype is shown [20].

Противогрибковая терапия может являться триггером для микроэволюции патогенных штаммов, повышая их адаптационный потенциал к используемым антимикотикам путем возникновения точковых мутаций в генах, ответственных за лекарственную резистентность грибов, вследствие чего происходит накопление этих мутаций в популяции [13, 14].

Анализ фенотипически нейтральных однонуклеотидных полиморфизмов генов TAC1 и MRR1, полученных от популяций клинических изолятов C. albicans, показал наличие большого пула несинонимичных мутаций, которые в дальнейшем будут способствовать формированию резистентных штаммов. При этом нужно понимать, что молекулярную модификацию белка, вызванную заменой только одной аминокислоты, не всегда можно классифицировать как мутацию устойчивости к антимикотикам. Поскольку C. albicans является диплоидным организмом, то гомозиготное состояние генов, ответственных за резистентность к флуконазолу, будет в большей степени снижать эффективность применение данного лекарственного препарата, чем гетерозиготное [6].

Длительное воздействие антимикотиков на клетки грибов так же индуцирует образование изохромосом и анеуплоидий, благодаря чему можно зафиксировать увеличенное или уменьшенное количество копий генов, ответственных за отток лекарств из клетки, что в дальнейшем может давать селективное преимущество при определенных неблагоприятных условиях [17].

Так как филогенетически близкие виды обладают схожей генетической информацией, у них можно обнаружить наличие параллельных векторов развития механизмов резистентности к флуконазолу. Гены-ортологи у таких видов впереди своего обозначения получают две дополнительные буквы от родового и видового названия вида (табл. 2).

Таблица 2. Обозначение гена CDR1 у различных представителей рода Candida

Table 2. CDR1 gene designated in various genus Candida members

Понятие «медиатор экологического стресса»

Будучи пластичными организмами, приспосабливающимися к различным условиям внешней среды, представители рода Candida приобрели множество защитных стратегий, позволяющих им выживать в организме хозяина и демонстрировать высокий уровень устойчивости к многим стрессам. Адаптивный ответ у клеток эукариот формируется за счет передачи сигналов через пути митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK) в ядро, где запускаются такие процессы как активация факторов транскрипции, регуляция клеточного цикла и активация киназы [11, 27].

Каждый регулятор транскрипционной активности гена специфически реагирует на уникальные факторы окружающей среды, такие как доступность питательных веществ и кислорода, температура, рН среды и другие.

Зачастую факторы транскрипции выступают в роли медиаторов экологического стресса. Медиатор экологического стресса — это понятие, характеризующее плейотропный транскрипционный фактор как структуру, способную воспринимать влияние одного экологического фактора и трансформировать его в процесс повышения резистентности к лекарственному препарату у микромицетов за счет стимулирования работы мембраносвязанных транспортеров (рис.).

Рисунок. Схематическое изображение механизма формирования адаптивного ответа грибов рода Candida с помощью МЭС к антимикотику флуконазолу. Примечание. * — Формирование адаптивного ответа на действие экологического фактора с использованием MAPK и дальнейшей активации фактора транскрипции; ** — активация фактора транскрипции, приводящая к нарушению накопления лекарств внутри клетки грибов в результате усиления экспрессии мембраносвязанных транспортеров, действующих как насосы для оттока антимикотика.

Примеры функционирования МЭС внутри клеток грибов рода Candida

У здоровых хозяев первой линией защиты от C. albicans является фагоцитоз. Набор антифугальных механизмов фагоцитарных иммунных клеток включает в себя образование токсичных активных форм кислорода (синтез супероксида (О₂^–•) и перекиси водорода), работу катионных потоков, пищевую депривацию, поддержание экстремальных значений рН и высвобождение антимикробных пептидов. Следовательно, существует большой интерес к стратегиям, используемым C. albicans для уклонения от уничтожения макрофагами и нейтрофилами.

Следует отметить, что комбинированное воздействие катионного и окислительного стрессов снижает степень адаптивных возможностей вида C. albicans к условиям внешней среды и повышает его чувствительность к лекарственным препаратам в результате уменьшения биосинтеза каталазы, что приводит к гипераккумуляции внутриклеточных активных форм кислорода и разрушению клеток патогена. Эффективность уничтожения C. albicans нейтрофилами в результате фагоцитоза обусловлена главным образом синергическим эффектом окислительного взрыва и катионного потока, а не воздействием каждого стресса по отдельности [12, 19].

Повышенную резистентность к флуконазолу можно наблюдать у Candida lusitaniae при наличии в окружающей среде метилглиоксаля, вызывающего окислительный стресс. Данное вещество запускает MRR1-зависимую экспрессию не только MDR1, но и MGD1, MGD2, в которых зашифрована информация о метилглиоксальредуктазах (Мgd1 и Мgd2). В качестве медиаторов экологического стресса в этом случае выступают гены MRR1 и САР1 (Сyclase-Аssociated Рrotein 1). Было задокументировано, что метилглиоксаль вызывает окислительный стресс, как и другие известные индукторы транскрипционной активности MRR1, а именно: беномил, метотрексат, 4-нитрохинолин-N-оксид, о-фенантролин, диэтилмалеат, диамид и комплекс ремоделирования хроматина Swi/Snf. Паралогичные MG-редуктазы стимулируют транскрипционный ответ у видов C. albicans, C. auris, Candida parapsilosis, Candida tropicalis и C. glabrata.

Можно смело утверждать, что диабет, уремия и сепсис являются факторами риска развития кандидоза, вызванного C. lusitaniae, так как при таких состояниях в организме хозяина наблюдается низкое содержание углерода и/или фосфатов. Благодаря данному факту токсичный метаболит метилглиоксаль способен необратимо модифицировать белки, липиды и нуклеиновые кислоты в клетках хозяина. Одним из способов повышения эффективности лечения кандидозной инфекции у пациентов, предрасположеных к повышению уровня метилглиоксаля в сыворотке крови, является модулирование процессов жизнедеятельности микромицетов за счет потребления пищевой добавки карнозина, известного поглотителя метилглиоксаля [7, 8].

Несмотря на то что транскрипционный фактор MRR1 является центральным регулятором экспрессии MDR1, мутации усиления функции в факторе транскрипции Cap1 могут также опосредовать сверхэкспрессию эффлюксной помпы и лекарственную резистентность к флуконазолу. Стоит отметить, что одна из основных ролей Cap1 — это регуляция устойчивости к окислительному стрессу у C. albicans. Cap1, активируя биосинтез каталазы, ингибирует негативное воздействие перекиси водорода на клетку. От наличия данного фермента в клетке зависит скорость детоксикации данной молекулы. Поэтому именно Cap1 является медиатором экологического стресса, так как запускает экспрессиюю MDR1 в ответ на окислительный стресс, вызванный перекисью водорода [19].

Для предотвращения развития кандидоза в ротовой полости организм хозяина вместе со слюной выделяет антимикробный пептид гистатин 5 (Hst 5). Данное белковое соединение обладает фунгицидным действием, так как может влиять на функции митохондрий и вызывать окислительный стресс у микромицетов, а также ингибировать рост клеток C. albicans и защищать эпителий полости рта от инвазии; однако конечной причиной гибели клеток грибов является нарушение ионного баланса и осмотический стресс. Выведение данного пептида из цитоплазмы клеток C. albicans происходит благодаря работе мембранного транспортера Flu1 (Fluconazole resistance). Гиперактивный цинк-кластерный фактор транскрипции МRR1 приводит к конститутивной активации гены FLU1 и MDR1. Поэтому патогенные штаммы C. albicans могут одновременно демонстрировать невосприимчивость к антимикробному пептиду и обладать повышенной устойчивостью к флуконазолу. Изучение МRR1 в качестве медиатора экологического стресса в данном случае осложняется тем, что гистатин 5 вырабатывается только у приматов. Описанный пример подтверждает то, что работу факторов транскрипции могут индуцировать окислительный и осмотический стресс [17, 25, 31].

Анализ литературных данных показал, что у представителей рода Candida отсутствуют медиаторы экологического стресса, трансформирующие пищевую депривацию в резистентность к лекарственным препаратам. Поэтому при недостатке железа и/или кальция флуконазол оказывает фунгицидное, а не фунгистатическое действие [18].

Но при этом следует учитывать, что эффективность медикаментозного лечения флуконазолом зависит и от степени поражения организма хозяина возбудителями кандидоза. Это объясняется тем, что потребность в железе у патогенных микромицетов обычно наблюдается на начальной стадии развития инфекции, поэтому экспрессия генов повышена из-за ограниченной доступности данного микроэлемента. Но при обширном повреждении тканей хозяина происходит ингибирование транскрипции из-за легкой усвояемости металла [15].

Остановимся более подробно на роли комбинаторного стресса в регулировании резистентных свойств у представителей рода Candida.

Если изолировано оценивать влияние внешних факторов на процессы жизнедеятельности изучаемых микроорганизмов, то их можно классифицировать как позитивные, нейтральные или негативные. Но, как и все живые организмы, микромицеты в своей естественной среде обитания одновременно испытывают на себе различные воздействия, по отношению к которым в ходе эволюции у них могут формироваться адаптивные реакции. Применяя термин «комбинаторный стресс», нужно понимать, что вероятны перекрестные помехи между сигнальными стрессовыми путями, в результате которых одни факторы могут усиливать или ослаблять действие на клетку других факторов. Поэтому одной из долгосрочных целей в терапевтической практике является определение и прогнозирование потенциальных адаптивных реакций, демонстрируемых представителями рода Candida при клинически значимом комбинаторном стрессе, вызванном динамическими колебаниями факторов окружающей среды.

Перспективным направлением в борьбе с возбудителями микозов во врачебной практике является применение химиосенсибилизирующих агентов, которые участвуют в формировании комбинированного стресса, оказываемого на представителей рода Candida. При этом подавляется функциональная значимость МЭС и повышается химическая чувствительность к азолам у грибов. Применение питавастатина, способного вступать с флуконазолом и вориконазолом в синергические взаимодействия, приводит не только к повышению чувствительности к лекарственным препаратам у C. albicans, но и препятствует образованию биопленок у этого вида.

Применение азолов вместе с цис-2-додеценовой кислотой также снижает адаптивные возможности грибов и позволяет преодолеть устойчивость к противогрибковым препаратам за счет подавления экспрессии генов МRR1 и ТАС1 [14, 30].

Учитывая клиническую важность азолов при борьбе с кандидозными инфекциями, поиск и внедрение во врачебную практику химиосенсибилизирующих агентов является одним из перспективных напрвлений в современной медицине.

Положения, характеризующие работу МЭС

Анализ литературных данных позволил сформулировать следующие положения, характеризующие работу транскрипционных факторов в качестве МЭС:

1. Один транскрипционный фактор может повышать экспрессию нескольких генов.
2. Один ген может активироваться несколькими факторами транскрипции.
3. Доказано, что активацию факторов транскрипции запускают следующие экологические факторы: окислительный и осмотический стресс. Другие экологические факторы или не запускают МЭС или их функциональное значение еще предстоит уточнить.
4. Комбинаторный стресс может блокировать работу МЭС.

Заключение

В настоящее время во многих источниках литературы в качестве одной из основных причин повышения устойчивости к азолам у грибов рода Candida рассматривается высокая предрасположенность к мутациям у рассматриваемых в этой работе цинк-кластерных факторов транскрипции. Например, в 2020 г. изучали генотипическое разнообразия TAC1, МRR1 и белков эффлюксной помпы у штаммов C. tropicalis. У изолятов C. auris клады IV были зарегистрированы две ранее неизвестные мутации в гене TAC1 [5, 21].

Такой «поверхностный» подход не позволяет взглянуть на проблему устойчивости микроорганизмов к лекарственным препаратам со всех ракурсов и представить активаторы транскрипции в роли посредников (медиаторов экологического стресса) между двумя и более экологическими факторами, оказывающих влияние на патогенный организм. При назначении антифугальной терапии, учитывающей только генетическую информацию, хранящуюся в микромицетах, не формируется полная картина о последствиях лечения человека, пораженного кандидозной инфекцией. В результате эффективность применения зарекомендовавших себя антимикотиков снижается.

Для полного осмысления понятия «медиаторы экологического стресса» нужно понимать, что любая клетка представляет собой открытую систему, в которой происходят различные химические и физические процессы, переплетающиеся между собой. Поэтому когда у определенного штамма формируется резистентность к конкретному медикаментозному препарату нужно учитывать не только его генетически обусловленные антифугальные свойства, но и различные экологические факторы, оказывающие влияние на его жизнедеятельность. Именно эти факторы могут изменять работу генов, контролирующих биосинтез белковых молекул, ответственных за резистентные свойства и развитие кандидозной инфекции внутри организма хозяина.

Было экспериментально доказано, что негативное влияние на рост клеток штаммов C. albicans в ротовой полости оказывает синтезированный пептид 0WHistatin 5 (аналог Hst 5), который содержит в своей последовательности аминокислоту триптофан. Применение данного липосомального препарата в терапевтической практике демонстрирует, как изменение экологического фактора сдерживает развитие кандидозной инфекции [31].

У вида C. albicans и некоторых штаммов Candida dubliniensis, работу Tас1 также активирует фарнезол — молекула-автоиндуктор, эндогенное накопление которой в матриксе клеточного конгломерата инициирует запуск фазы дисперсии [22]. Поэтому можно предположить, что собственные метаболиты грибов или метаболиты микроорганизмов, с которыми они образуют гетеротипические ассоциации, микробиом и состояние здоровья хозяина будут выступать в качестве триггеров МЭС или, наоборот, угнетать их работу. Следует так же учитывать морфологические особенности клеток грибов, стадии жизненного цикла и/или стадии формирования биопленки, влияющие на процессы жизнедеятельности у представителей рода Candida и синтезируемые ими вещества в результате многообразных химических реакций [2, 4].

Дальнейшее изучение молекулярных механизмов повышения лекарственной устойчивости у патогенных микроорганизмов с упором на генетический и экологический аспекты позволит осознать эволюционное предназначение МЭС в процессе жизнедеятельности грибов Candida species и выявить видоспецифические адаптивные реакции, характерные для представителей этого рода. Можно предположить, что МЭС будут описаны и у других патогенных микроорганизмов, что даст возможность обнаружить параллельные векторы развития инфекционного процесса. Благодаря этим знаниям возникнут предпосылки для модифицирования современных терапевтических схем борьбы с кандидозом, основанные на модуляции метаболических путей в патогенном микроорганизме при введении антимикотиков.

About the authors

Olga V. Enoktaeva

Author for correspondence.
Email: pechkanova@mail.ru

Senior Lecturer, Department of Biology, Assistant Professor, Department of Microbiology

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Figure. A schematic mechanism for developing adaptive anti-Candida response genus involving environmental stress mediator against antimycotic fluconazole. Note. * — Developing adaptive response against environmental factor involves MAPK pathway followed by transcription factor activation; ** — transcription factor activation affecting subsequent drug accumulation inside fungal cell due to higher expression of membrane-bound transporters acting as pumps for antimycotic efflux.

Download (218KB)

Indexing metadata