Assessment of the relationship between Epstein–Barr virus major types and genovariants as well as clinical and laboratory parameters in HIV-infected adults

Full Text

Введение

В настоящее время во всем мире инфицированность взрослого населения Human gammaherpesvirus 4, известным как вирус Эпштейна–Барр (ВЭБ), составляет более 90%. Первичное инфицирование ВЭБ происходит в раннем детском или подростковом возрасте. При этом у иммунокомпетентных лиц в 60–80% случаев наблюдается бессимптомная сероконверсия, реже развивается острая форма ВЭБ-инфекции — инфекционный мононуклеоз (ИМ). Впоследствии человек пожизненно остается вирусоносителем ВЭБ [3]. Однако у иммунокомпрометированных лиц ВЭБ-инфекция протекает с более выраженными клиническими проявлениями и осложнениями [1, 2, 9, 23, 35].

Большинство взрослых людей, которые заражаются ВИЧ, уже инфицированы ВЭБ [23, 45, 49]. Клинические наблюдения зарубежных и российских специалистов свидетельствуют о том, что у людей, живущих с ВИЧ (ЛЖВ), учащаются и продлеваются эпизоды реактивации ВЭБ, что может существенно влиять на показатели заболеваемости и смертности [2, 23, 31]. ВЭБ-инфекция, включая ИМ, выявляется у 38% амбулаторных ВИЧ-инфицированных пациентов [1]. Для сравнения: у здоровых доноров крови серологические маркеры реактивации ВЭБ-инфекции обнаруживают с частотой 13% [22]. ВЭБ рассматривается как кофактор прогрессирования ВИЧ-инфекции. В общем, коинфицирование ВЭБ+ВИЧ может приводить к развитию хронической активной ВЭБ-инфекции, волосатой лейкоплакии, лимфоидным интерстициальным пневмонитам, нейроинфекции и широкому спектру злокачественных новообразований [2, 9, 32].

Несмотря на успехи антиретровирусной терапии (АРТ), прогнозы специалистов сводятся к тому, что эпидемический потенциал ВИЧ-инфекции на фоне увеличения продолжительности жизни пациентов будет сопровождаться ростом числа случаев выявления ВЭБ-ассоциированных опухолей, что требует продолжения междисциплинарных исследований в контексте данной проблемы [9, 19, 27, 28, 42, 45]. Среди наиболее значимых онкогенов, участвующих в вирусной кооперации, отмечают связанные с ВИЧ-1 гены Tat и Vpu и гены ВЭБ — LMP-1 и EBNA-2 [19].

Механизмы взаимодействия ВЭБ и ВИЧ при коинфекции остаются мало изученными. Относительно недавно были получены первые данные об иммунологическом профиле ВИЧ-инфицированных в зависимости от инфицирующего типа ВЭБ — ВЭБ-1 и ВЭБ-2, которые различают на основе генов ядерного антигена 2 и 3 (EBNA-2, EBNA-3). У ВИЧ-инфицированных ВЭБ-1 был ассоциирован с меньшим количеством CD4⁺ Т-лимфоцитов и высокой вирусной нагрузкой ВИЧ, в то время как ВЭБ-2 чаще встречался при уровне CD4⁺ Т-лимфоцитов ≥ 500 клеток/мкл и низкой вирусной нагрузке ВИЧ [35, 40]. Имеются сведения, что отсутствие или позднее начало АРТ у ВИЧ-инфицированных пациентов повышает риск коинфекции ВЭБ-1+ВЭБ-2 и развитие симптомов заболевания [34, 36]. Пока единственная работа о распространенности вариантов ВЭБ при ВИЧ-инфекции в контексте наиболее популярной классификации R. Edwards и соавт. [20], основанной на полиморфизме С-концевой области гена латентного мембранного белка 1 (LMP-1), опубликована в мае 2023 г. [43].

В России исследования молекулярно-генетического разнообразия ВЭБ во взаимосвязи с клинико-лабораторными показателями у ЛЖВ до сих пор не проводились. Расширение знаний о патогенезе ВЭБ на молекулярном уровне лежит в основе перспективной разработки методов специфической профилактики, диагностики и терапии ВЭБ-ассоциированных заболеваний у пациентов с ВИЧ/СПИД [27].

Цель исследования — оценка взаимосвязи основных типов ВЭБ и геновариантов LMP-1 с клинико-лабораторными показателями у ВИЧ-инфицированных взрослых.

Материалы и методы

Характеристика групп исследования. Проведено комплексное клинико-лабораторное обследование 138 ВИЧ-инфицированных пациентов в возрасте 20–69 лет, которые находились на диспансерном наблюдении в ГБУЗНО «НОЦ СПИД» (г. Нижний Новгород) (группа ВИЧ(+)).

Группы сравнения. Сформированы группы сравнения ВИЧ(+) пациентов на основе комбинации данных о степени иммунных нарушений (по классификации ВОЗ [46]) и антиретровирусной терапии (АРТ): «наивные» пациенты (без АРТ), CD4⁺ Т-лимфоциты < 200 клеток/мкл (группа G1, n = 30); «наивные» пациенты (без АРТ), CD4⁺ Т-лимфоциты >500 клеток/мкл (группа G2, n = 20); «опытные» пациенты (получающие АРТ в среднем 36 месяцев), CD4⁺ Т-лимфоциты < 200 клеток/мкл (группа G3, n = 43); «опытные» пациенты (получающие АРТ в среднем 36 месяцев), CD4⁺ Т-лимфоциты > 500 клеток/мкл (группа G4, n = 45).

«Наивные» пациенты были обследованы перед началом АРТ (Z, n = 50).

«Опытных» пациентов (n = 88) различали по степени приверженности АРТ: высокая (Н, n = 55), средняя (M, n = 5), низкая (L, n = 28).

Соблюдение этических требований. Работа проводилась с деперсонализированными данными пациентов. Информированное согласие пациентов на проведение исследовательской работы в соответствии с положениями Хельсинкской декларации (2013) было получено лечащими врачами медицинской организации. Работа получила одобрение на заседании локального этического комитета ФБУН ННИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора (Протокол № 3 от 11.11.2021 г.).

Анализ клинико-лабораторных показателей каждого пациента (пол, возраст, приверженность АРТ, результаты проточной цитофлуориметрии, ИФА, иммуноблоттинга и ПЦР для определения маркеров ВИЧ-инфекции) проведен ретроспективно на основе данных медицинской документации. Для количественной оценки CD4⁺ Т-лимфоцитов использовали проточный цитофлуориметр BD FACSCalibur (Becton Dickinson, США). Вирусную нагрузку ВИЧ определяли методом ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) с помощью тест-системы «РеалБест РНК ВИЧ количественный» (АО «Вектор-Бест», Россия). Рекомендуемый производителем тест-системы порог определяемой вирусной нагрузки ВИЧ в плазме крови составляет 58 копий/мл.

ПЦР-исследования и секвенирование по Сэнгеру ДНК ВЭБ проводились в лаборатории молекулярной биологии и биотехнологии ФБУН ННИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора.

Сбор биологического материала. Материалом для исследования послужила цельная периферическая кровь, стабилизированная К₃ЭДТА. Для получения фракции лейкоцитов крови использовали реагент «Гемолитик» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия) в соответствии с инструкцией производителя.

Определение ДНК ВЭБ. Выделение тотальной нуклеиновой кислоты проводили с помощью комплекта реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия). Выявление и количественное определение ДНК ВЭБ выполняли с помощью ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) с применением коммерческого набора «АмплиСенс^® EBV/CMV/HHV6-cкрин-FL» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия) на амплификаторе «Rotor-Gene Q 5plex HRM» (Qiagen, Германия). Лабораторный протокол на всех этапах ПЦР-РВ соблюдали согласно инструкции производителя.

Дифференциальная детекция ВЭБ-1 и ВЭБ-2 методом ПЦР. Для раздельной детекции основных типов ВЭБ (ВЭБ-1 и ВЭБ-2) применен оптимизированный нами ранее вариант однораундовой ПЦР на основе гена EBNA-2 [5].

ПЦР-анализ и секвенирование по Сэнгеру фрагмента гена LMP-1 ВЭБ. Положительные образцы, содержащие ДНК ВЭБ (по результатам ПЦР-РВ), были использованы для амплификации С-концевого фрагмента гена LMP-1 вируса методом ПЦР в оптимизированном нами однораундовом варианте исполнения [6]. Лабораторный протокол последующего секвенирования по Сэнгеру фрагмента гена LMP-1 ВЭБ описан нами ранее [6].

Биоинформационный анализ. Биоинформационный анализ данных проводился с помощью открытого программного обеспечения MEGA X (Mega Software, США)¹ и языка программирования R, версия 2022.12.0+353 (The R Foundation for Statistical Computing, Inc)². Полученные исходные нуклеотидные последовательности выравнивались по алгоритму ClustalW. В качестве референсных последовательностей служили полученные из базы данных GenBank³ полногеномные последовательности прототипного штамма B95-8 (V01555.1), а также нуклеотидные последовательности гена LMP-1 — штаммы China 1 (AY337723.1), China 2 (AY337724.1), Med– (AY337721.2), Med+ (AY337722.2), NC (AY337726.2), Alaskan (AY337725.1), CAO (X58140.1) и AG876 (DQ279927.1). Нуклеотидные последовательности исследуемых изолятов ВЭБ и референсные последовательности транслировались в аминокислотные по стандартному генетическому коду. Принадлежность исследуемых последовательностей LMP-1 к определенным вариантам в рамках классификации R. Edwards и соавт. устанавливалась по наличию сигнатурных аминокислотных замен (согласно табл. 1 в [20]). Предполагаемые рекомбинантные последовательности (rec) анализировали с помощью программного обеспечения 3SEQ (BoniLab, Вьетнам–США). Использовали длину окна 200 п.н. и шаг 10 п.н. Статистическую значимость вероятных рекомбинационных событий оценивали с применением непараметрического мозаичного теста.

Полученные нуклеотидные последовательности 82 нижегородских изолятов ВЭБ из лейкоцитов крови ВИЧ-инфицированных взрослых депонированы в международную базу данных GenBank: номера доступа OR862230-OR862311 (присвоены 12.12.2023).

Статистическая обработка данных. Статистическая обработка данных проводилась с использованием языка программирования R и среды RStudio, версия 2022.12.0+353 (RStudio, PBC)^2,4. Принадлежность выборок к нормальному распределению определяли с помощью критерия Шапиро–Уилка и графиков квантилей. Для попарного сравнения независимых выборок использован критерий Манна–Уитни. Полученное количество ДНК/РНК и клеток представляли в виде Me [Q1; Q3] (где Ме — медиана, Q1, Q3 — первый и третий квартили). Долю описывали с указанием стандартного отклонения процентной доли (P±σ_p), в %. Оценку различий относительных показателей в анализируемых группах проводили с применением критерия χ² (хи-квадрат) с поправкой Йетса и критерия Фишера. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05.

Оценку возможного влияния ВЭБ-инфекции на клинико-лабораторные показатели у ВИЧ-инфицированных проводили с использованием метода главных компонент (РСА-анализ). Анализировали распределение ВИЧ(+) пациентов в координатах первых двух главных компонент (ГК) в зависимости от вирусной нагрузки ВЭБ, содержания СD4⁺ Т-лимфоцитов и приверженности пациентов АРТ. При этом приверженность терапии выражали в числовых значениях от 0 до 1, где 0 — без АРТ, 1 — высокая приверженность. Вклад переменных в состав компонент оценивали по показателю корреляции вектора переменной и осью компоненты. Возможные факторы группировки пациентов в координатах двух первых измерений выявляли методом визуального наложения. Для количественной оценки строили линейную модель зависимости возможных факторов группировки от переменных со значительным вкладом в состав первых двух главных компонент.

Оценивали вирусную нагрузку ВЭБ и ВИЧ, количество CD4⁺ Т-лимфоцитов у ВИЧ(+) пациентов в зависимости от типа, варианта и субварианта ВЭБ. Для анализа отбирались субварианты, достаточно широко представленные среди обследованных пациентов (n ≥ 3). Использовали U-тест Манна–Уитни. Рассчитанные значения «р» корректировали с применением поправки Холма–Бонферрони для множественных сравнений. Различия описывали с указанием Δ (ДИ: CI.ll — CI.ul) и уровня статистической значимости (р), где Δ — разница положений распределений, CI.ll и CI.ul — нижняя и верхняя границы 95%-ного доверительного интервала (ДИ) разницы. Различия считали статистически значимыми при скорректированном р < 0,05.

Результаты

На первом этапе исследования все полученные образцы лейкоцитов крови тестировались с помощью количественной ПЦР-РВ. ДНК ВЭБ была обнаружена у 70,3±3,9% ВИЧ(+) пациентов, при этом вирусная нагрузка составила 18 [5; 139] копий/10⁵ клеток.

Последующий РСА-анализ позволил охарактеризовать зависимость между вирусной нагрузкой ВЭБ, вирусной нагрузкой ВИЧ, количеством CD4⁺ Т-лимфоцитов и приверженностью АРТ. При анализе всех ВИЧ(+) пациентов удалось установить их распределение в координатах двух первых компонент, суммарно объяснявших 79,5% дисперсии. Анализируемые переменные вносили различный вклад в состав главных компонент (табл. 1).

Выявлено, что в отношении первой компоненты вклад вирусной нагрузки ВЭБ сопоставим, но противопоставлен вкладу содержания CD4⁺ Т-лимфоцитов и приверженности терапии. В состав второй компоненты основной вклад внесли такие переменные как вирусная нагрузка ВЭБ и приверженность терапии, их вклад был сопоставим и однонаправлен.

Для оценки возможного значения главных компонент мы провели визуальное наложение фактора вирусной нагрузки ВИЧ на точки расположения ВИЧ(+) пациентов в координатах двух первых измерений (рис. 1).

 

Рисунок 1. Расположение точек ВИЧ(+) пациентов в координатах двух первых главных компонент с визуальным наложением фактора выявления РНК ВИЧ выше или ниже определяемого уровня

Figure 1. Location of HIV(+) patient points in the coordinates of the first two principal components with a visual overlay of the HIV RNA detection factor above or below the detectable level

Примечание. Эллипс отображает 95%-й доверительный интервал расположения барицентра групп. Стрелками обозначены вектора изученных переменных.

Note. The ellipse displays the 95% confidence interval of the barycenter location of the groups. The arrows indicate the vectors of the studied variables.

 

На графике барицентры двух групп располагались на выраженном удалении друг от друга в первом и третьем квадрантах. Исходя из этого можно предположить, что ось первой компоненты в большей степени отражала вирусную нагрузку ВИЧ у пациентов, в то время как ось второй компоненты — их приверженность терапии. Интересно отметить, что параметр вирусной нагрузки ВЭБ вносил равноценный вклад в формирование как первой, так и второй главных компонент.

Кроме того, все исследованные нами переменные оказывали влияние на риск определяемой вирусной нагрузки ВИЧ. Так у пациентов с низкой приверженностью терапии, низким содержанием CD4⁺ Т-лимфоцитов и высокой вирусной нагрузкой ВЭБ риск выявления РНК ВИЧ выше 58 копий/мл возрастал, и наоборот.

Для количественной оценки зависимости возможных факторов группировки от переменных со значительным вкладом в состав первых двух главных компонент была построена линейная модель:

[HIV] = 516103 + 114 × [EBV] – 339 × [CD4⁺_abs] – – 331575 × ther.code (1/0),

где [HIV] — вирусная нагрузка ВИЧ (копии/мл); [EBV] — вирусная нагрузка ВЭБ (копии/10⁵ клеток); [CD4⁺_abs] — абсолютное количество CD4⁺ Т-лимфоцитов (клеток/мкл); ther.code (1/0) — высокая приверженность АРТ (есть/нет).

Используя данную модель, показано, что вирусная нагрузка ВИЧ увеличивалась на 114±58 копий/мл при повышении количества ДНК ВЭБ на 1 копию/10⁵ клеток (р = 0,049) или на 339±165 копий/мл при снижении CD4⁺ Т-лимфоцитов на одну клетку (р = 0,042). Наоборот, концентрация РНК ВИЧ значительно снижалась (на 331 575±123 452 копий/мл), если у пациентов была высокая приверженность АРТ (р = 0,008). Отметим, что небольшое значение коэффициента R² при высоком уровне значимости (R² = 0,156, р < 0,001) свидетельствует о том, что помимо исследованных нами переменных в показатель вирусной нагрузки ВИЧ вносят вклад и другие факторы.

На следующем этапе работы нами осуществлен анализ взаимосвязи молекулярно-генетических особенностей ВЭБ с уровнем вирусной нагрузки ВИЧ, количеством CD4⁺ Т-лимфоцитов и степенью приверженности АРТ у ВИЧ(+) пациентов. Анализ проводили по трем направлениям: типы ВЭБ, варианты и субварианты LMP-1 ВЭБ.

По результатам дифференциальной детекции ВЭБ-1 и ВЭБ-2 у ВИЧ(+) пациентов была получена следующая типовая структура изолятов: ВЭБ-1 — 88,2±3,4%, ВЭБ-2 — 5,4±2,3%, коинфекция ВЭБ-1+ВЭБ-2 — 6,4±2,6%. Также определена штаммовая принадлежность полученных нижегородских изолятов ВЭБ по классификации R. Edwards и соавт. [20]. Доминирующим вариантом LMP-1 ВЭБ у ВИЧ(+) пациентов являлся В95-8 (62,2±5,4%), реже встречались NC (15,5±4,0%), Med– (11,9±3,6%), China 1 (4,8±2,3%), Alaskan (2,4±1,7%) и рекомбинантные варианты rec (2,4±1,7%).

Для изучения возможного влияния типа ВЭБ и варианта LMP-1 на состояние ВИЧ-инфицированных, повторили процедуру PCA-анализа для пациентов с установленным типом ВЭБ и установленным вариантом LMP-1 (табл. 1 и рис. 2). В связи с выявленной ранее более высокой дивергентностью последовательностей LMP-1 вариантов Med–, NC, Alaskan и China 1, пациенты были сгруппированы по принципу «вариант B95-8 — другие варианты» [6, 10].

 

Рисунок 2. Расположение точек ВИЧ(+) пациентов в координатах двух первых главных компонент с визуальным наложением фактора: А — типа ВЭБ, Б — варианта LMP-1 ВЭБ

Figure 2. Location of HIV(+) patient points in the coordinates of the first two principal components with visual overlay of the factor: A — EBV type, B — EBV LMP-1 variant

Примечание. Эллипс отображает 95%-й доверительный интервал расположения барицентра групп. Стрелками обозначены вектора изученных переменных.

Note. The ellipse displays the 95% confidence interval of the barycenter location of the groups. The arrows indicate the vectors of the studied variables.

 

Из табл. 1 и рис. 2 видно, что распределение пациентов с охарактеризованным ВЭБ в координатах двух главных компонент было сопоставимо таковому для всех ВИЧ(+) пациентов. Анализируемые переменные вносили сопоставимый вклад в состав компонент, а именно: ось первой компоненты в большей степени отражала вирусную нагрузку ВИЧ у пациентов, ось второй компоненты — их приверженность терапии, параметр вирусной нагрузки ВЭБ вносил равноценный вклад в формирование как первой, так и второй главных компонент.

 

Таблица 1. Корреляция анализируемых переменных и осей компонент

Table 1. The correlation between аnalyzed variables and component axes

Характеристика группы ВИЧ(+) HIV(+) group characteristics	n	Анализируемые переменные Analyzed variables	ГК 1 PC 1	ГК 2 PC 2
Всего Total	138	Приверженность к терапии Adherence to ART	0,57	0,62
		CD4+ Т-лимфоциты, клеток/мкл CD4+ Т-lymphocytes, cells/µl	0,64	0,09
		ДНК ВЭБ, × 105 копий/105 клеток EBV DNA, × 105 copies/105 cells	–0,52	0,78
С установленным типом ВЭБ With verified EBV type	97	Приверженность АРТ Adherence to ART	0,53	0,75
		CD4+ Т-лимфоциты, клеток/мкл CD4+ Т-lymphocytes, cells/µl	0,64	–0,05
		ДНК ВЭБ, × 105 копий/105 клеток EBV DNA, × 105 copies/105 cells	–0,56	0,66
С установленным вариантом LMP-1 ВЭБ With verified EBV LMP-1 variant	82	Приверженность АРТ Adherence to ART	0,55	0,74
		CD4+ Т-лимфоциты, клеток/мкл CD4+ Т-lymphocytes, cells/µl	0,62	–0,04
		ДНК ВЭБ, × 105 копий/105 клеток EBV DNA, × 105 copies/105 cells	–0,56	0,67

 

Выявлено расхождение барицентров групп пациентов в зависимости от типа ВЭБ (рис. 2А) и/или варианта LMP-1 ВЭБ (рис. 2Б). При этом в обоих случаях расхождение наблюдали вдоль вектора переменной вирусной нагрузки ВЭБ. Можно предположить, что тип и вариант ВЭБ оказывают влияние на вирусную нагрузку ВЭБ и, косвенно, на вирусную нагрузку ВИЧ у ВИЧ(+) пациентов. Исходя из полученных данных, следует ожидать, что у ВИЧ(+) пациентов с сопоставимым уровнем CD4⁺ Т-лимфоцитов и одинаковой приверженностью АРТ вирусная нагрузка ВЭБ (а, следовательно, и вирусная нагрузка ВИЧ) при коинфицировании обоими типами ВЭБ (ВЭБ-1+ВЭБ-2) будет выше, а у пациентов, инфицированных ВЭБ-2, наоборот, ниже по сравнению с теми, у кого выявлен ВЭБ-1. У пациентов с вариантом LMP-1 B95-8 вирусная нагрузка ВЭБ (и ВИЧ) будет ожидаемо ниже по сравнению с пациентами с иными вариантами вируса.

Последующий анализ с использованием классических методов статистики не позволил получить статистически значимые различия уровня вирусной нагрузки ВЭБ, вирусной нагрузки ВИЧ и количества CD4⁺ Т-лимфоцитов между пациентами, инфицированными разными типами и вариантами ВЭБ, как в группе ВИЧ(+) в целом, так и в разрезе отдельных групп сравнения. Исходя из полученных данных, мы предполагали, что выраженность клинико-лабораторных проявлений ВИЧ-инфекции может быть обусловлена прочими генетическими особенностями ВЭБ, а именно наличием повторов, делеций и аминокислотных замен в LMP-1, обозначенных нами как субварианты.

Для подтверждения данной гипотезы среди всех выявленных в данном исследовании молекулярно-генетических характеристик С-концевой области LMP-1 ВЭБ отобрали те, которые были представлены у пациентов в достаточном количестве (3 и более случаев) (табл. 2). По типовой принадлежности все сгенерированные субварианты LMP-1 были представлены только ВЭБ-1. Анализ выполнен дифференцированно в группах G1, G2, G3 и G4, учитывая иммунный, АРТ-статус пациентов и их влияние на анализируемые показатели (табл. 3).

 

Таблица 2. Проанализированные субварианты LMP-1 ВЭБ

Table 2. Analyzed EBV LMP-1 subvariants

Cубвариант LMP-1 ВЭБ EBV LMP-1 subvariant	Частота среди всех изолятов ВЭБ Frequency among all EBV isolates	Частота среди выявленных вариантов LMP-1 ВЭБ Frequency among identified EBV LMP-1 variants
346_del10_355	4/82	China 1 (4/4)
4*[PQDPDNTDDNG] 2*[PHDPL]	43/82	B95-8 (43/51)
3*[PQDPDNTDDNG] 2*[PQGPDNTDDNG] 1*[PHDPL]	3/82	Med– (3/10)
3*[PQDPDNTDDNG] 1*[PHDPQ]	7/82	NC (7/13)
4*[PQDPDNTDDNG] 1*[PHDPQ]	4/82	NC (3/13), rec (1/2)
G212S	72/82	Alaskan (2/2), B95-8 (47/51), China 1 (3/4), Med– (10/10), NC (9/13), rec (1/2)
D216H	3/82	B95-8 (2/51), China 1 (1/4)
S229T	11/82	B95-8 (1/51), Med– (10/10)
D250N	13/82	NC (13/13)
G252A	5/82	Med– (3/10), rec (2/2)
L306Q	14/82	NC (13/13), rec (1/2)
S309N	31/82	Alaskan (2/2), China 1 (4/4), Med– (10/10), NC (13/13), rec (2/2)
S313P	14/82	B95-8 (1/51), NC (13/13)
Q322E	10/82	Med– (9/10), rec (1/2)
Q322N	4/82	China 1 (4/4)
Q322T	14/82	Alaskan (2/2), NC (12/13)
E328Q	48/82	B95-8 (48/51)
G331Q	11/82	NC (11/11)
Q334R	15/82	China 1 (4/4), Med– (9/10), rec (2/2)
G335D	3/82	NC (3/13)
L338P	14/82	Alaskan (2/2), NC (12/13)
L338S	11/82	China 1 (2/4), Med– (8/10), rec (1/2)
D349A	3/82	Med– (2/10), rec (1/2)
H352N	11/82	NC (11/11)
H352R	12/82	B95-8 (1/51), Med– (9/10), rec (2/2)
G355C	3/82	B95-8 (1/51), China 1 (1/4), rec (1/2)
H358P	13/82	Med– (1/10), NC (12/13)
S366T	73/82	Alaskan (2/2), B95-8 (46/51), China 1 (4/4), Med– (8/10), NC (11/13), rec (2/2)
D372N	4/82	B95-8 (4/51)

 

Таблица 3. Клинико-лабораторные показатели в группах ВИЧ(+) пациентов

Table 3. Clinical and laboratory parameters in HIV(+) patient groups

Показатель Parameter		Группа/Group
		G1 (n = 30)	G2 (n = 20)	G3 (n = 43)	G4 (n = 45)	Всего/Total (n = 138)
Возраст Age	лет years	41 [37; 46]	34 [29; 37]	40 [38; 46]	37 [32; 42]	38 [33; 44]
Пол Sex	женский, n (%) female, n (%)	12 (40,0)	8 (40,0)	19 (44,2)	26 (57,8)	65 (47,1)
	мужской, n (%) male, n (%)	18 (60,0)	12 (60,0)	24 (55,8)	19 (42,2)	73 (52,9)
CD4+ Т-лимфоциты CD4+ Т-lymphocytes	отн., в % rel., in %	4,8 [2, 0; 10, 4]	34,9 [30, 8; 37, 9]	9,1 [6, 0; 13, 2]	33,8 [27, 1; 39, 9]	19,6 [7, 4; 33, 7]
	клеток/мкл cells/µl	52 [16; 142]	628 [525; 787]	127 [89; 159]	658 [558; 910]	260 [100; 605]
РНК ВИЧ HIV RNA	копий/мл copies/ml	270000 [43 250; 660 000]	7300 [2825; 18 250]	1200 [58; 250 000]	58 [58; 83]	1200 [58; 142 500]
ДНК ВЭБ EBV DNA	P±σp, %	86,7±6,2	70,0±10,3	81,4±5,9	48,9±7,4	70,3±3,9
	копий/105 клеток copies/105 cells	121 [34; 252]	6 [1; 9]	54 [8; 212]	9 [2; 14]	18 [5; 139]
Приверженность АРТ Adherence to ART	Z, n (%)	30 (100)	20 (100)	0	0	50 (36,2)
	L, n (%)	0	0	23 (53,5)	5 (11,1)	28 (20,3)
	M, n (%)	0	0	1 (2,3)	4 (8,9)	5 (3,6)
	H, n (%)	0	0	19 (44,2)	36 (80,0)	55 (39,9)

 

В результате установлено, что существуют субварианты LMP-1 ВЭБ-1 с определенными молекулярно-генетическими признаками (на уровне аминокислотных замен), которые ассоциированы с изменением количества РНК ВИЧ и ДНК ВЭБ по сравнению с пациентами, инфицированными другими геновариантами (табл. 4).

 

Таблица 4. Различия показателей количества CD4⁺ Т-лимфоцитов и вирусной нагрузки ВЭБ и ВИЧ при инфицировании ВЭБ с разными молекулярно-генетическими характеристиками LMP-1

Table 4. Differences in CD4⁺ T-lymphocyte counts and EBV and HIV viral load during infection with EBV with different LMP-1 molecular genetic characteristics

Субвариант LMP-1 ВЭБ EBV LMP-1 subvariant	Группа Group	Показатель Indicator	Ед. измерения Units	Δ (95% ДИ), (нет–есть) Δ (95% CI), (absent–present)	скорр. р adj. p
S309N	G1	РНК ВИЧ HIV RNA	копии/мл copies/ml	–443 278 (–135 000 — –50 000)	0,049
E328Q	G1	РНК ВИЧ HIV RNA	копии/мл copies/ml	441 777 (50 000–1 350 000)	0,049
Q334R	G1	ДНК ВЭБ EBV DNA	копии/105 клеток copies/105 cells	–460 (–11 089 — –15)	0,049
E328Q	G3	ДНК ВЭБ EBV DNA	копии/105 клеток copies/105 cells	107 (1–875)	0,049
H358P	G3	ДНК ВЭБ EBV DNA	копии/105 клеток copies/105 cells	–872 (–1031 — –16)	0,049

Примечание. В таблице приведены только выявленные статистически значимые различия (скорректированный р < 0,05).

Note. Significant differences are presented (adjusted p < 0.05).

 

Полученные данные свидетельствуют о том, что клинико-лабораторные особенности ВЭБ+ ВИЧ-коинфекции при инфицировании разными субвариантами LMP-1 ВЭБ проявляются только у пациентов с выраженным иммунодефицитом при количестве CD4⁺ Т-лимфоцитов < 200 клеток/мкл (группы G1 и G3). В группах ВИЧ(+) пациентов, у которых CD4⁺ Т-лимфоциты были > 500 клеток/мкл (G2 и G4) взаимосвязь анализируемых клинико-лабораторных показателей с инфицирующим субвариантом LMP-1 ВЭБ не выявлена.

Установлено, что у «наивных» пациентов в группе G1 субвариант S309N (был представлен в 100% последовательностей LMP-1 China 1, Med–, NC, Alaskan и rec) был ассоциирован с более высокими значениями концентрации РНК ВИЧ в плазме крови. Напротив, при инфицировании субвариантом E328Q (установлен исключительно в изолятах В95-8) в этой же группе ВИЧ-инфицированных были понижены уровни вирусной нагрузки ВИЧ по сравнению с теми, у кого в последовательностях LMP-1 данная мутация отсутствовала. Обнаружение субварианта Q334R (специфическая мутация для вариантов LMP-1 China 1 и Med–) характеризовалось значительно более высокими уровнями вирусной нагрузки ВЭБ.

У «опытных» пациентов в группе G3 была выявлена связь отдельных субваринтов только с вирусной нагрузкой ВЭБ. При этом уровни вирусной нагрузки ВЭБ были ниже при инфицировании субвариантом E328Q и, наоборот, выше, если выявлялся субвариант H358P (типичная аминокислотная замена в штаммах NC). Дополнительно отметим, что именно изоляты NC ВЭБ-1 из лейкоцитов крови ВИЧ(+) лиц продемонстрировали наибольшую дивергентность С-концевой области LMP-1 по сравнению со всеми другими вариантами. В последовательностях NC присутствовало в среднем на 2, 5 и 9 мутаций больше, чем в вариантах Med–, China 1 и B95-8 соответственно (p < 0,01 для каждого варианта сравнения).

Обсуждение

В России исследования молекулярно-генетического разнообразия ВЭБ и оценка его взаимосвязи с выраженностью клинико-лабораторных показателей у ЛЖВ не проводились. За рубежом при изучении данного вопроса анализировались только однородные группы пациентов, сформированные на основе одного признака (количество CD4⁺ Т-лимфоцитов либо АРТ) [34, 35, 36, 40]. При этом основная часть исследований была посвящена оценке типов вируса — ВЭБ-1 и ВЭБ-2. В нашей работе анализ данных выполнен комплексно с учетом количества CD4⁺ Т-лимфоцитов, вирусной нагрузки ВИЧ, применения и приверженности АРТ у пациентов, с одной стороны, и молекулярно-генетических особенностей ВЭБ (типа ВЭБ, варианта и субварианта LMP-1 данного вируса), с другой стороны.

Нами показано, что определяемый уровень вирусной нагрузки ВИЧ возрастает у пациентов с низким содержанием CD4⁺ Т-лимфоцитов, высокой вирусной нагрузкой ВЭБ, низкой приверженностью АРТ или в ее отсутствие. Анализ коэффициентов линейной модели показал, что вирусная нагрузка ВЭБ вносит хоть и меньший по отношению к содержанию CD4⁺ Т-лимфоцитов и приверженности АРТ, но статистически значимый вклад в изменение вирусной нагрузки ВИЧ. Положительная корреляция между вирусной нагрузкой ВЭБ и ВИЧ и обратная корреляция их уровней с количеством CD4⁺ Т-лимфоцитов ранее была установлена в ряде зарубежных исследований [24, 28, 37]. Отметим, что количественная характеристика ВЭБ у ВИЧ-инфицированных в контексте приверженности АРТ до сих пор не проводилась.

В основе типирования ВЭБ-1 и ВЭБ-2 лежат различия последовательностей генов EBNA-2, EBNA-3А, EBNA-3В и EBNA-3С. Данная классификация ВЭБ используется уже в течение 40 лет. Современные работы подтверждают четкое разделение вирусной популяции на два основных типа [8, 49]. Известно, что доминирующим типом во всем мире является ВЭБ-1. Его наибольшая распространенность отмечается в Европе, Азии, Северной и Южной Америке [49]. Представлены первые сведения о том, что преимущественно ВЭБ-1 обнаруживается и в России [6, 11]. ВЭБ-2 также встречается повсеместно, но наиболее высокая частота выявления данного типа ограничивается странами Африки к югу от Сахары и отдельными группами населения, включая лиц с ВИЧ/СПИД [18, 38, 48]. Отмечается, что ВЭБ-2 редко выявляется в общей европеоидной популяции, но стал эндемичным в сообществе гомосексуальных мужчин [48]. По данным зарубежных публикаций в популяции ЛЖВ преобладает ВЭБ-1, за ним следует ВЭБ-2 и коинфекция обоими типами вируса [18, 24, 35, 43]. Полученные нами результаты типовой структуры нижегородских изолятов ВЭБ у ВИЧ(+) пациентов согласуются с этими представлениями.

Анализ взаимосвязи изучаемых клинико-лабораторных показателей с выявленными типами ВЭБ у ВИЧ(+) пациентов на основе метода главных компонент показал, что вирусная нагрузка ВЭБ и ВИЧ при ВЭБ-1+ВЭБ-2 коинфицировании выше, а у пациентов, инфицированных только ВЭБ-2, ниже по сравнению с теми, у кого выявлен ВЭБ-1. Данные других исследователей на этот счет неоднозначны. В ряде работ приводятся аналогичные результаты [35, 38]. При этом в иммунологическом профиле пациентов инфицирование ВЭБ-2 значительно чаще сопряжено с количеством CD4⁺ Т-лимфоцитов ≥ 500 клеток/мкл [40] и низкими уровнями цитокинов, особенно IFNγ и IL-4 [35]. В других публикациях, наоборот, при инфицировании ВЭБ-2 регистрировалась более высокая вирусная нагрузка, чем при ВЭБ-1 и ВЭБ-1+ВЭБ-2 [43]. Вопрос, посвященный изучению биологических функций основных типов ВЭБ у ЛЖВ, требует продолжения исследований. В том числе в контексте последних данных о том, что ВЭБ-2, в отличие от ВЭБ-1, in vitro и in vivo инфицирует не только В-клетки, но и Т-клетки [16, 17].

Молекулярно-генетическая характеристика других генов ВЭБ также лежит в основе ряда классификаций вируса [8]. Однако у ВИЧ-инфицированных лиц они применялись редко. Так исследователи ограничились поиском отдельных САО-подобных мутаций в гене LMP-1 (делеция 30 н.о./10 а.к. (а.к. 346–355) и больший размер области тандемных повторов) в контексте изучения ВИЧ-ассоциированных лимфом [18, 24, 25, 29, 48]. Отметим, что использование наиболее популярной классификации по R. Edwards и соавт. [20] у ВИЧ-инфицированных было представлено только в одной публикации в 2023 г. [43].

Полученный нами спектр штаммов LMP-1 ВЭБ у ВИЧ-инфицированных включал варианты В95-8, China 1, Med–, NC и Alaskan, а также варианты rec вне классификации R. Edwards и соавт. [20]. Ранее последовательности LMP-1, изолированные в других регионах России, в основном у здоровых людей и онкологических больных, были отнесены к вариантам B95-8, China 1, Med+, Med– и NC [4, 10]. Российскими учеными были обнаружены также варианты LMP-1 «вне классификации», в том числе уникальный среди изолятов этнических татар Поволжья «LMP1-TatK» [11]. Собственные результаты дополняют уже имеющиеся сведения о доминировании на территории Европейской части России варианта B95-8 (62,2% нижегородских изолятов) [6, 10]. Напротив, в работе ученых из Китая штаммы LMP-1 В95-8 не были обнаружены совсем, а преобладал вариант China 1 (73,8%) и сопряженные с ним CAO-подобные мутации [43]. В настоящее время накоплено достаточно данных, свидетельствующих о взаимосвязи циркулирующих штаммов ВЭБ с определенным географическим положением или этнической принадлежностью. Однако ключевым вопросом остается оценка клинической значимости генетического разнообразия ВЭБ.

Анализ взаимосвязи изучаемых нами клинико-лабораторных показателей с выявленными вариантами LMP-1 ВЭБ на основе метода главных компонент показал, что при инфицировании пациентов вариантом LMP-1 В95-8 вирусная нагрузка ВЭБ и ВИЧ была меньше по сравнению с другими вариантами LMP-1. В предыдущих исследованиях нами продемонстрировано, что у детей, инфицированных вирусом с молекулярно-генетическим профилем ВЭБ-1/В95-8, ВЭБ-ИМ протекал легче и с меньшей выраженностью синдрома интоксикации [7].

Мировой опыт свидетельствует о том, что многочисленные попытки найти варианты ВЭБ высокого онкогенного риска или специфические для ИМ и других ВЭБ-ассоциированных заболеваний при использовании классификации R. Edwards и соавт. [20] были мало доказательными [4, 13, 41]. В то же время выход за рамки этой классификации в направлении поиска новых генетических маркеров ВЭБ (не только анализ транслированных аминокислотных замен в LMP-1, но и дополнительные характеристики этого и других генов) позволил достичь определенных успехов. Относительно недавно было показано, что высокий (32-кратный) риск развития рака носоглотки на эндемичной территории юга Китая ассоциирован с аминокислотными заменами в трех вирусных белках (BALF2 V317M, BNRF1 G696R, BNRF1 V1222I, RPMS1 D51E) [47]. Сербские ученые обнаружили, что повышение печеночных трансаминаз (АЛТ и АСТ) у больных ИМ, ассоциировалось с вариантами LMP-1 ВЭБ, в составе которых были обнаружены 3 или 4 тандемных повтора [13]. В наших ранних исследованиях было показано, что аминокислотные замены L338S и S229T в белке LMP-1 связаны с более тяжелым течением ВЭБ-ИМ у детей [7].

В данной работе нами также применен комплексный подход, основанный на оценке широкого спектра выявленных мутаций (делеции, количество и состав тандемных повторов, аминокислотные замены), обозначенных нами как субварианты вируса. В результате установлены субварианты LMP-1 ВЭБ на уровне аминокислотных замен (S309N, E328Q, Q334R, Н358Р), которые ассоциированы с изменением количества РНК ВИЧ и ДНК ВЭБ по сравнению с пациентами, инфицированными другими вариантами и субвариантами вируса. При этом полученные результаты указывают на то, что биологический потенциал этих мутаций реализуется в условиях иммунодефицита (ВИЧ(+) пациенты в группах G1 и G3), когда вследствие истощения пула CD4⁺ Т-лимфоцитов ≤ 200 клеток/мкл ВИЧ-инфекция приводит к потере иммунологического контроля над ВЭБ-инфекцией [34, 40, 45].

Известно, что LMP-1 представляет собой онкогенный сигнальный белок, экспрессирующийся как в латентном, так и литическом циклах [14, 33]. С-терминальный цитоплазматический домен ответственен за индукцию множества внутриклеточных сигнальных путей, включая NF-kB, митоген-активируемые белковые киназы JNK и р38, малую ГТФазу cdc42 и JAK/AP1/STAT каскады. Кроме того, в В- и эпителиальных клетках белок LMP-1 работает как гомолог семейства рецептора фактора некроза опухоли (TNFR) [44]. Следовательно, мутантный белок LMP-1 может оказывать влияние на нормальные клеточные процессы, изменяя результаты канонических сигнальных путей, непосредственно вмешиваясь в их реализацию. К настоящему времени лишь небольшая часть из описанных в литературе аминокислотных замен в белке LMP-1 была функционально охарактеризована.

Среди выявленных нами значимых субвариантов LMP-1 аминокислотная замена E328Q встречалась исключительно в изолятах В95-8 (с частотой до 100%). Выявление этого субварианта у ВИЧ(+) лиц было связано с меньшей репликативной активностью ВИЧ (в группе G1) и ВЭБ (в группах G1 и G3). Накоплены данные, что мутация E328Q преобладает в российских изолятах LMP-1 В95-8 как у больных, так и здоровых лиц [4, 6, 10]. В других географических регионах она встречается редко [12, 13]. Следует отметить, что в литературе описаны и другие аминокислотные замены в позиции 328 белка LMP-1. Например, мутация Е328A, которая характеризует известный штамм LMP-1 CAO, первоначально выделенный из образцов карциномы носоглотки у пациента из Китая [10, 25], или замена E328D, обнаруженная в 41% образцов карциномы слюнных желез и носоглотки в странах Юго-Восточной Азии [26]. При исследовании российских изолятов ВЭБ с набором часто встречающихся мутаций (I85L, F106Y, E328Q, S366T) было показано, что их функциональное значение проявляется в снижении цитотоксичности и усилении трансформирующей активности белка LMP-1 [4, 39]. Однако данные, экспериментально подтверждающие биологическую роль именно аминокислотной замены E328Q, пока отсутствуют.

Другой значимый субвариант S309N связан с группой всех остальных, так называемых высокодивергентных вариантов LMP-1 ВЭБ (не В95-8). В нашем исследовании он был ассоциирован с более высокими значениями концентрации РНК ВИЧ в плазме крови пациентов группы G1. Несмотря на то что данная аминокислотная замена входит в перечень известных САО-подобных мутаций, о ее функциональном значении известно мало. Только в ранних публикациях приводятся свидетельства того, что замена серина в положениях 309, 311, 313, как основных сайтов фосфорилирования в интактном LMP-1, может приводить к изменению биологической функции этого белка [30].

Субвариант Q334R (специфическая мутация для вариантов LMP-1 China 1 и Med–) характеризовал значительно более высокие уровни вирусной нагрузки ВЭБ у ВИЧ(+) пациентов в группе G1. Замена Q334R также известна как САО-мутация. Установлено, что в белке LMP-1 она находится в сайте распознавания Т-лимфоцитов молекулой HLA I класса А24. Так в последовательностях LMP-1 ВЭБ, установленных из образцов опухолей носоглотки, были охарактеризованы мутации в эпитопах связывания цитотоксических Т-лимфоцитов, в частности KGGRDGPPS (штаммы China 1 и Med–) в координатах а.к. 330–338, которые по сравнению с KGGDQGPPL (штамм В95-8) препятствуют презентации LMP-1 в составе HLA I класса, что приводит к снижению эффективности распознавания таких белков клетками иммунной системы [21].

Уровни вирусной нагрузки ВЭБ в группе G3 были также выше, если выявлялся субвариант H358P. Хотя это достаточно распространенная типичная аминокислотная замена в штаммах NC, ее функциональная роль остается неизученной [6, 10]. Мутация находится в координатах одного из С-концевых активирующих доменов LMP-1 — CTAR2 (а.к. 351–386), который является основным активатором NF-kB посредством TRAF2 и TRAF6 (канонический путь), участвуя в регуляции множества клеточных процессов, включая пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток [15]. Кроме того, предполагается, что указанная замена может приводить к нарушению способности LMP-1 связывать HOS белки, что приводит к повышению его концентрации в клетке [10].

Для выяснения функциональной роли выявленных мутаций LMP-1 необходимо продолжение экспериментальных работ in vitro и in vivo.

Заключение

Впервые в России выявлены особенности клинико-лабораторных показателей ВЭБ+ВИЧ-коинфекции при инфицировании разными субвариантами LMP-1 (на уровне аминокислотных замен). Коинфекция ВЭБ-1/LMP-1 (S309N)+ВИЧ у «наивных» пациентов с тяжелым иммунодефицитом протекала с более высокой, а ВЭБ-1/LMP-1(E328Q)+ВИЧ — с наименьшей вирусной нагрузкой ВИЧ. При этом наиболее высокие значения концентрации ДНК ВЭБ у этих пациентов наблюдались при коинфекции ВЭБ-1/LMP-1(Q334R)+ВИЧ. Субварианты ВЭБ-1/LMP-1(E328Q) и ВЭБ-1/LMP-1(H358P) в группе «опытных» пациентов с тяжелым иммунодефицитом на фоне проводимой АРТ (в течение 3-х лет и более) и, следовательно, низкой или неопределяемой вирусной нагрузкой ВИЧ были ассоциированы с вирусной нагрузкой ВЭБ. При этом уровень ДНК ВЭБ в лейкоцитах крови был значительно ниже при инфицировании вирусом с молекулярно-генетическим профилем ВЭБ-1/LMP-1(E328Q) и, наоборот, выше, в случае профиля ВЭБ-1/LMP-1(H358P).

На наш взгляд, важным аспектом является дальнейшее изучение функциональных свойств именно этих мутаций. В контексте решаемых в данном исследовании задач необходимо проведение более масштабных и системных исследований на разных территориях РФ с участием профильных специалистов научного и врачебного сообществ.

 

¹ URL: https://www.megasoftware.net

² URL: https://www.Rproject.org

³ URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank

⁴ URL: http://www.rstudio.com

About the authors

Mariia I. Popkova

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Author for correspondence.
Email: popmarig@mail.ru

PhD (Medicine), Leading Researcher, Laboratory of Molecular Biology and Biotechnology

Россия, Nizhniy Novgorod

E. N. Filatova

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: popmarig@mail.ru

PhD (Biology), Leading Researcher, Laboratory of Molecular Biology and Biotechnology

Россия, Nizhniy Novgorod

S. V. Minaeva

Privolzhskiy Research Medical University

Email: popmarig@mail.ru

PhD (Мedicine), Associate Professor of the Epidemiology, Microbiology and Evidence-Based Medicine Department

Россия, Nizhniy Novgorod

N. A. Sakharnov

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: popmarig@mail.ru

PhD (Biology), Senior Researcher, Laboratory of Molecular Biology and Biotechnology

Россия, Nizhniy Novgorod

O. V. Utkin

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: popmarig@mail.ru

PhD (Biology), Head of the Laboratory of Molecular Biology and Biotechnology

Россия, Nizhniy Novgorod

References

Supplementary files