Molecular and genetic characteristics of Epstein-Barr virus isolates in adult patients with HIV infection in Nizhny Novgorod region

Full Text

Введение

Вирус Эпштейна–Барр (ВЭБ) относится к семейству Herpesviridae, подсемейству Gammaherpesvirinae, роду Lymphocriptoviruses, виду Human gammaherpesvirus 4. Единой классификации ВЭБ до сих пор не существует. На протяжении 40 лет с момента расшифровки первой полногеномной последовательности ВЭБ [14] предложено множество авторских классификаций вируса, которые обобщены ранее в обзоре [4]. При этом большинство из них были разработаны на основе так называемого подхода «гена-кандидата», заключающегося в секвенировании и последующей оценке молекулярно-генетической вариабельности отдельных генов вируса (например, гена ядерного антигена 2 (EBNA-2), гена латентного мембранного белка 1 (LMP-1) и др.) или их фрагментов.

Первая и базовая классификация ВЭБ основана на вариабельности гена EBNA-2 и позволяет разделить популяцию вируса на два основных типа — тип 1 (ВЭБ-1) и тип 2 (ВЭБ-2) [4]. Показано, что ВЭБ-1 является доминирующим типом, обнаруженным во всем мире. В то время как высокая распространенность ВЭБ-2 ограничивается странами Африки к югу от Сахары и отдельными группами населения, включая лиц, живущих с вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) [21, 34, 37, 38, 40, 41, 49, 50]. К тому же в генотиповой структуре ВЭБ, выделенного от ВИЧ-инфицированных, чаще встречаются случаи коинфицирования обоими типами вируса (ВЭБ-1+ВЭБ-2) или разными вирусами одного типа [21, 40, 49, 50].

Как показал анализ литературных данных, для дальнейшего субтипирования ВЭБ исследователи применяли наиболее популярную и часто цитируемую классификацию по R. Edwards и соавт., основанную на структурно-функциональном полиморфизме самого вариабельного гена LMP-1 [4, 24]. Согласно этой классификации, выделяют 7 основных геновариантов: B95-8, China 1, China 2, China 3, Mediterranean (Med), North Carolina (NC), Alaskan [24]. Отметим, что до сих пор у ВИЧ-инфицированных лиц субтипирование ВЭБ проводилось крайне редко [13, 21, 23, 27, 30, 51]. При этом исследователи ограничились поиском только делеции 10 аминокислот (а.к.) в онкобелке LMP-1, охватывающую кодоны 346–355, известную также как САО-делеция и делетированный вариант LMP-1 [4, 21, 27, 51]. Полученные результаты противоречивы, поскольку по одним данным САО-делеция у пациентов с ВИЧ-инфекцией встречалась чаще, чем в контрольной группе [21, 27], по другим — различия отсутствовали [51]. Первая и пока единственная работа о распространенности при ВИЧ-инфекции вариантов LMP-1 ВЭБ на основе классификации по R. Edwards и соавт. [24] появилась только в мае 2023 г. [46].

В России до сих пор не проводились исследования, направленные на оценку молекулярно-генетического разнообразия ВЭБ у пациентов с ВИЧ-инфекцией. В целом характеристика молекулярно-генетических особенностей ВЭБ у ВИЧ-инфицированных лежит в основе изучения патогенеза, целевой разработки стратегий специфической профилактики, диагностики и терапии ассоциированных с коинфицированием этими вирусами заболеваний, включая злокачественные новообразования, а также совершенствования системы эпидемиологического надзора за ВЭБ-инфекцией и ВИЧ-инфекцией.

Цель исследования — оценка молекулярно-генетического разнообразия ВЭБ у взрослых ВИЧ-инфицированных лиц в Нижегородской области.

Материалы и методы

Характеристика групп исследования. В 2021–2022 гг. обследовано 138 ВИЧ-инфицированных пациентов в возрасте 20–69 лет (группа ВИЧ(+)), которые находились на диспансерном наблюдении в ГБУЗНО «НОЦ СПИД» (г. Нижний Новгород), и 68 ВИЧ-неинфицированных лиц сопоставимого пола и возраста без клинических признаков инфекционной патологии (группа ВИЧ(–)), проходивших диспансеризацию в ООО «НИКА СПРИНГ НН» (г. Нижний Новгород). Работа выполнена с соблюдением этических требований. Информированное согласие пациентов на проведение исследовательской работы в соответствии с положениями Хельсинкской декларации (2013) было получено лечащими врачами медицинских организаций. Работа получила одобрение на заседании локального этического комитета ФБУН ННИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора (Протокол № 3 от 11.11.2021 г.).

Сбор биологического материала. Материалом для исследования послужила цельная периферическая кровь, стабилизированная К3ЭДТА. Для получения фракции лейкоцитов крови использовали реагент «Гемолитик» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия) в соответствии с инструкцией производителя.

Определение ДНК ВЭБ. Выделение тотальной нуклеиновой кислоты проводили с помощью комплекта реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия). Выявление и количественное определение ДНК ВЭБ выполняли с помощью ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) с применением коммерческого набора «АмплиСенс^® EBV/CMV/HHV6-cкрин-FL» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия) на амплификаторе «Rotor-Gene Q 5plex HRM» (Qiagen, Германия). Лабораторный протокол на всех этапах ПЦР-РВ соблюдали согласно инструкции производителя.

Дифференциальная детекция ВЭБ-1/ВЭБ-2 методом ПЦР. Для раздельной детекции основных типов ВЭБ (ВЭБ-1 и ВЭБ-2) применен оптимизированный нами ранее вариант однораундовой ПЦР на основе гена EBNA-2 [5].

ПЦР-анализ и секвенирование по Сэнгеру фрагмента гена LMP-1 ВЭБ. Положительные образцы, содержащие ДНК ВЭБ (по результатам ПЦР-РВ), были использованы для амплификации С-концевого фрагмента гена LMP-1 вируса методом ПЦР в оптимизированном однораундовом варианте [5]. Лабораторный протокол последующего секвенирования по Сэнгеру фрагмента гена LMP-1 ВЭБ описан ранее в [5].

Филогенетический анализ. Биоинформационный анализ данных проводился с помощью открытого программного обеспечения MEGA X (Mega Software, США)¹. Полученные исходные нуклеотидные последовательности выравнивались по алгоритму ClustalW. В качестве референсных последовательностей служили полученные из базы данных GenBank² полногеномные последовательности прототипного штамма B95-8 (V01555.1), а также нуклеотидные последовательности гена LMP-1-штаммы China 1 (AY337723.1), China 2 (AY337724.1), Med– (AY337721.2), Med+ (AY337722.2), NC (AY337726.2), Alaskan (AY337725.1), CAO (X58140.1) и AG876 (DQ279927.1). Нуклеотидные последовательности исследуемых изолятов ВЭБ и референсные последовательности транслировались в аминокислотные по стандартному генетическому коду. Координаты нуклеотидной последовательности анализируемого участка гена LMP-1 (168162–168763) соответствовали положению 187–386-й аминокислот в белке LMP-1.

Построение филогенетических деревьев выполнено на основе метода максимального правдоподобия (Maximum likelihood). Принадлежность исследуемых последовательностей LMP-1 к определенным вариантам в рамках классификации R.H. Edwards и соавт. устанавливалась по наличию сигнатурных аминокислотных замен (согласно табл. 1 в [24]).

 

Таблица 1. Сравнение частоты выявления вариантов LMP-1 ВЭБ (по классификации R. Edwards и соавт. [24]) у ВИЧ(+) и ВИЧ(–) взрослых лиц, проживающих в Нижегородской области

Table 1. Comparison of the frequency of detection of EBV LMP-1 variants (according to the classification of R. Edwards et al. [24]) in HIV(+) and HIV(–) adults living in the Nizhny Novgorod region

Группа сравнения Comparison group	Ед. измерения Units	Вариант LMP-1 ВЭБ по классификации R. Edwards и соавт. [24] EBV LMP-1 variant according to the classification of R. Edwards et al. [24]					Другие варианты LMP-1 Other LMP-1 variants
		B95-8	China 1	Med–	NC	Alaskan
ВИЧ(+) | HIV(+) (n = 82)	абс. abs.	51	4	10	13	2	2
	P±σp, %	62,2±5,4	4,8±2,3	11,9±3,6	15,5±4,0	2,4±1,7	2,4±1,7
ВИЧ(–) | HIV(–) (n = 20)	абс. abs.	12	0	4	3	1	0
	P±σp, %	60,0±10,9	0	20,0±8,9	15,0±7,9	5,0±4,9	0
Уровень значимости различий p-value	р	1,000	1,000	0,464	1,000	0,477	0,847

 

Рекомбинационный анализ. Предполагаемые рекомбинантные последовательности анализировали с помощью программного обеспечения 3SEQ (BoniLab, Вьетнам–США). Использовали длину окна 200 п.н. и шаг 10 п.н. Статистическую значимость вероятных рекомбинационных событий оценивали с применением непараметрического мозаичного теста.

Полученные нуклеотидные последовательности нижегородских изолятов ВЭБ депонированы в международную базу данных GenBank: номера доступа OR862230–OR862331 (присвоены 12.12.2023).

В данной работе оценка молекулярно-генетического разнообразия ВЭБ в нижегородских изолятах проводилась по нескольким направлениям: 1) анализ типовой структуры ВЭБ; 2) дифференциальный анализ вариантов LMP-1 ВЭБ на основе классификации R. Edwards и соавт. [24]; 3) поиск делеций и вставок; 4) характеристика тандемных повторов; 5) аминокислотные замены.

Статистическая обработка данных. Статистическая обработка данных проводилась с использованием языка программирования R версия 2022.12.0+353 (The R Foundation for Statistical Computing, Inc.)³ и среды RStudio версия 2022.12.0+353 (RStudio, PBC)⁴. Частоту показателя (долю) описывали с указанием стандартного отклонения процентной доли (P±σp) в %. Оценку различий относительных показателей в анализируемых группах проводили с применением критерия χ² (хи-квадрат) с поправкой Йетса и критерия Фишера. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05.

Результаты

Типовая структура ВЭБ. Частота обнаружения ДНК ВЭБ в лейкоцитах крови ВИЧ(+) пациентов составила 70,3±3,9% (97/138), а среди ВИЧ(–) лиц — 48,5±6,1% (33/68) (p = 0,008). В результате последующего типирования полученных изолятов в группе ВИЧ(–) был идентифицирован только ВЭБ-1 (33/33). В группе ВИЧ(+) тип вируса установлен для 93 из 97 изолятов. При этом доминирующим типом ВЭБ также являлся ВЭБ-1, который был выявлен в 88,2±3,4% (82/93) изолятов. ВЭБ-2 обнаружен в 5,4±2,3% (5/93), а коинфицирование двумя типами вируса (ВЭБ-1+ВЭБ-2) — в 6,4±2,6% (6/93) случаев.

Оценка молекулярно-генетического разнообразия ВЭБ на основе метода секвенирования по Сэнгеру С-концевого фрагмента гена LMP-1. Дальнейшее субтипирование ВЭБ осуществлено на основе метода секвенирования по Сэнгеру самого вариабельного участка генома ВЭБ — фрагмента С-концевой области гена LMP-1. Всего получено и исследовано 102 нуклеотидных последовательности, из них 82 изолята из лейкоцитов крови ВИЧ(+), а 20 — ВИЧ(–) лиц. По результатам филогенетического анализа сформировались 5 клад, которые представляют 5 из 7 известных штаммов вируса, а именно B95-8, China 1, Med, NC и Alaskan (рис.).

 

Рисунок. Филогенетическое дерево, построенное на основе сравнения аминокислотных последовательностей С-концевого участка LMP-1 102 нижегородских изолятов ВЭБ и 8 референсных последовательностей, полученных из базы данных GenBank (метод максимального правдоподобия)

 

Для подтверждения филогенетической группировки проверено наличие сигнатурных аминокислотных замен, определенных авторами классификации в семи основных локусах LMP-1 ВЭБ в позициях 229, 306, 312, 322, 334, 338, 344. В результате анализа в одной из клад, соответствующей варианту LMP-1 China 1, нами были отмечены две последовательности (номера HIV+ 1836 и HIV+ 1808), в которых отсутствовала характерная для штамма China 1 делеция в координатах аминокислот 346–355 (10 а.к.) и сигнатурная замена Q322N. При этом в последовательности № HIV+ 1836 выявлено сочетание мутаций Q322E, H352R и L306Q, которые являются сигнатурными аминокислотными заменами в вариантах LMP-1 Med– и NC соответственно. А в изоляте № HIV+ 1808 аминокислотная последовательность несла признаки как штамма AG876 (ВЭБ-2), в частности мутацию Q322D, так и варианта Med–.

Проведен рекомбинационный анализ. Последовательность LMP-1 № HIV+ 1836 тестировали в сравнении с референсными последовательностями штаммов NС и Med–. Последовательность № HIV+ 1808 — с референсными последовательностями штаммов AG876 и Med–. Референсную последовательность штамма China 1 использовали в качестве группы сравнения. Обнаружено, что последовательность № HIV+ 1836 могла возникнуть как результат перекрестной рекомбинации между штаммами NC и Med– в участке гена LMP-1 920 — 930 н.о. (p = 0,007, соответствует координатам 306–310 а.к.). В последовательности № HIV+ 1808 выявлена возможная точка перекрестной рекомбинации штаммов AG876 и Med– в участке 1010–1020 н.о. (p = 0,024, соответствует положению 336–340 а.к.).

Два охарактеризованных выше варианта LMP-1 вне известной классификации ВЭБ были названы нами «другие варианты». Они принадлежали изолятам вируса из лейкоцитов крови ВИЧ-инфицированных. Их расположение на филогенетическом дереве относительно референсных и нижегородских штаммов LMP-1 отмечено звездочкой (рис.).

Из данных табл. 1 следует, что на территории Нижегородской области в изолятах ВЭБ у взрослого населения доминирует вариант LMP-1 B95-8. Причем его распространенность в группах ВИЧ(+) и ВИЧ(–) была одинаковой (62,2±5,4% и 60,0±10,9% соответственно). Такие варианты LMP-1 как China 1, Med, NC и Alaskan выявлялись реже. Отметим, что вариант LMP-1 Med был представлен исключительно Med– (не содержащий САО-подобную делецию 30 п.н./10 а.к.), а Med+, China 2 и China 3 не были обнаружены ни в одном исследованном образце. Статистически значимые различия частоты обнаружения вариантов LMP-1 между исследуемыми группами ВИЧ(+) и ВИЧ(–) выявлены не были. Однако в их спектре наблюдались некоторые особенности. Так, только у ВИЧ(+) взрослых нижегородцев были выявлены изоляты China 1 и «другие варианты» LMP-1 ВЭБ.

Проведен анализ распределения вариантов LMP-1 ВЭБ относительно типов вируса. Выявлено, что в группе ВИЧ(+) основная часть изолятов ВЭБ имели молекулярно-генетический профиль ВЭБ-1/B95-8 (56,1±5,5% всех изолятов ВЭБ). Для сравнения ВЭБ-2/B95-8 выявлен в 1,2±1,2% изолятов. По нашим наблюдениям типы ВЭБ-1 и ВЭБ-2 характеризовались разным соотношением числа последовательностей LMP-1 B95-8 к общему количеству других выявленных вариантов LMP-1 (1,8:1 и 1:4 соответственно). Отметим, что в группе ВИЧ(–) доля изолятов ВЭБ-1/B95-8 также преобладала (60,0±10,9%) и их соотношение с другими вариантами вируса составило 1,5:1.

При анализе аминокислотных последовательностей С-концевой области LMP-1 были выявлены делеции. При этом как в группе ВИЧ(+), так и ВИЧ(–) делеции присутствовали в половине изолятов ВЭБ (48,8±5,5% и 40,0±10,9% соответственно, p = 0,581). Однако спектр делеций различался. В последовательностях LMP-1 ВЭБ у здоровых взрослых встречался только один вариант делеции 5 а.к. (а.к. 276–280) в 40,0±10,9% изолятов. В то время как изоляты ВЭБ у ВИЧ(+) пациентов характеризовались разнообразием вариантов делеций: 1 а.к. (а.к. 205), 4 а.к. (а.к. 209–212), 2 а.к. (а.к. 211–212), 6 а.к. (а.к. 345–350) — по 1,2±1,2%, 5 а.к. (а.к. 276–280) — 39,0±5,4%, 10 а.к. (а.к. 346–355) — 4,9±2,4%. Два варианта делеций (30 н.о./10 а.к., охватывающая кодоны 346–355, и 15 н.о./5 а.к. в положении 276–280), наиболее распространенные, являются известными САО-подобными делециями. Четыре другие делеции в координатах аминокислот 205, 209–212, 211–212, 345–350 ранее не были описаны.

Все четыре последовательности ДНК ВЭБ с делецией 30 н.о./10 а.к. были ассоциированы исключительно с вариантом LMP-1 China 1. Делеция 15 н.о./5 а.к., расположенная в области тандемных повторов LMP-1 (а.к. 253–306), обнаружена в половине полученных изолятов ВЭБ. Отметим, что данная делеция присутствовала во всех последовательностях LMP-1 China 1, Med–, NC, Alaskan и «другие варианты», независимо от их типовой принадлежности. Остальные выявленные нами четыре делеции встречались только в изолятах ВЭБ-1/B95-8.

Проведен анализ числа и аминокислотного состава повторяющихся элементов в С-концевой области LMP-1 (а.к. 253–306) в нижегородских изолятах ВЭБ у ВИЧ(+) и ВИЧ(–) взрослых. Установлено, что С-концевой участок LMP-1 содержит разное количество повторов из 11 а.к., вариабелен по наличию и местоположению между ними элемента из 5 а.к., а также спектру аминокислотных замен в них. Результаты представлены в табл. 2.

 

Таблица 2. Характеристика числа и аминокислотного состава повторяющихся элементов в С-концевой области LMP-1 ВЭБ

Table 2. Characteristics of the number and amino acid composition of repeating elements in the C-terminal region of EBV LMP-1

Штамм Strain	ВИЧ(+) HIV(+)	ВИЧ(–) HIV(–)	Повторяющиеся элементы в С-концевой области LMP-1 ВЭБ (а.к. 253–306) Repeat elements in the C-terminal region of EBV LMP-1 (aa 253–306)	Повторы Repeats
V01555.2 (B95-8)			PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL	4,5
B95-8	43/51	11/12	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL	4,5
	1/51	–	PQDPDNSDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL PQDLDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL	4,5
	1/51	–	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPV	4,5
	1/51	–	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL PHDPDDPDDPD PHDHDGPDDPD PHDHL	4,5
	1/51	–	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL	5,5
	1/51	–	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNA PHDPL PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL	6,5+
	1/51	–	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL	2
	1/51	1/12	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL	5,5
	1/51		PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDHDDPDDPD PQDHDDPDDPD PHDPL	4,0
China 1	1/4	–	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL	5
	2/4	–	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL	6
	1/4		PQDPDNTDGNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDSTDDNG PHDPL	8
Med–	1/10	–	PQDPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PHDPL	4
	2/10	1/4	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PHDPL	4
	1/10	–	PQDPDNSDDNG PQDPDNTDDNG PQGPDNTHDNG PQGPDNTDDNG PHDPL	4
	1/10	–	PQDPDNTDDNG PQDPDDTDDNG PQGPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PHDPL	4
	3/10	2/4	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PHDPL	5
	1/10		PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL	4
	1/10	–	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PHDPL	6
	–	1/4	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PHDPL	7
NC	7/13	2/3	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPQ	3
	3/13	1/3	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPQ	4
	1/13	–	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPQ	5
	2/13	–	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPQ	6
Alaskan	1/3	–	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PHDPP	4
	1/3	1/3	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PHDPP	5
Другие Other	1/2	–	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPQ	4
	1/2	–	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL	5

 

Показано, что количество повторов значительно варьировало (от 2 до 8 повторов). Однако основная часть изолятов имели размер этого участка 3–5 повторов (87,8±5,5% в группе ВИЧ(+) и 85,0±11,1% в группе ВИЧ(–)). В половине всех полученных последовательностей LMP-1, независимо от источника вируса, область тандемных повторов была идентична прототипному варианту «4,5». При этом все они были ассоциированы исключительно с вариантом B95-8. В свою очередь 15,7±5,1% изолятов B95-8 в группе ВИЧ(+) отличались вариабельным размером области тандемных повторов, присутствием модифицированных мотивов и точечными аминокислотными заменами в них. В изолятах China 1, NС, Med–, Alaskan и «другие варианты» LMP-1 число повторов варьировало в установленном диапазоне, при этом мотив PHDPL между повторами из 11 а.к. во всех этих последовательностях отсутствовал. Данную делецию 5 а.к. также относят к числу САО-подобных. Из данных табл. 2 видно, что в области тандемных повторов аминокислотные замены могут быть обнаружены в любом варианте LMP-1 и затрагивать разные повторяющиеся мотивы. Часть из них являются сигнатурными для определенного штамма. Например, в элементах PHDPL, завершающих повторяющийся мотив, штамм-характерными аминокислотными заменами в положении 306-й аминокислоты являются в варианте NC — L306Q (PHDPQ), в Alaskan — L306P (PHDPP). Модифицированные последовательности в варианте Med– характеризует замена аспарагиновой кислоты на глицин в третьем положении аминокислоты во втором — седьмом элементе: D266G, D282G, D293G. Мутации D282G, D293G были выявлены и в варианте LMP-1 Alaskan. Остальные аминокислотные замены в повторяющихся мотивах, как правило, встречались спорадически. Продемонстрировано, что среди всех изолятов вариант LMP-1 Med– отличается наибольшей вариабельностью тандемных повторов. Так, в 14 полученных изолятах Med– идентифицировано 8 субвариантов области повторов, которые различались за счет комбинации числа повторов и расположения относительно друг друга прототипных и модифицированных мотивов из 11 а.к. Отметим также, что в изолятах B95-8 у двух ВИЧ-инфицированных выявлены ранее не описанные модифицированные мотивы PHDPDDPDDPD, PHDHDGPDDPD, PQDHDDPDDPD и PHDHL.

Осуществлен поиск полного спектра аминокислотных замен в пределах анализируемого С-концевого участка белка LMP-1 с 187 по 386 а.к. Суммарно в нижегородских изолятах ВЭБ в группах ВИЧ(+) и ВИЧ(–) идентифицировано 112 мутаций аминокислот в 74 локусах (относительно референсной последовательности B95-8). Наиболее «горячими» точками мутаций стали аминокислоты в положениях 322 (6 мутаций) и 331, 338, 359 (по 4 мутации).

Последовательность, аналогичная прототипному штамму, выявлена только в одном изоляте (вариант B95-8), а наиболее дивергентная последовательность с 16 мутациями идентифицирована в Alaskan. Для наглядного сравнения степени дивергенции между вариантами LMP-1 проведен расчет индекса, характеризующего среднее число мутаций, приходящееся на одну последовательность. Анализ выполнен дифференцировано в группах ВИЧ (+) и ВИЧ(–). Получены следующие значения индекса: B95-8 — 3,9 и 2,2; Med– — 10,9 и 9,3; NC — 11,0 и 11,7; Alaskan — 15,5 и 15,0 соответственно. Относительный показатель аминокислотных замен в штаммах China 1 у ВИЧ(+) пациентов составил 6,9, в «других» вариантах LMP-1 — 10,5.

Все аминокислотные замены были сгруппированы по принадлежности к определенному варианту LMP-1 ВЭБ. Такие аминокислотные замены как G212S, D216H, S229T, D250N, G252A, T259S, D282G, D293G, L306Q, S309N, S313P, Q322D, Q322E, Q322T, L323M, E328Q, Q334R, L338P, L338S, H352R, G355C, H358P, S366T обнаруживали в двух и более вариантах LMP-1 независимо от ВИЧ-статуса.

Установлено, что наиболее распространенными в популяции ВЭБ среди взрослого населения Нижегородской области являются 4 мутации: G212S, S366T, E328Q и S309N. Замены G212S и S366T присутствовали во всех установленных вариантах LMP-1, их частота в группе ВИЧ(+) составила 86,6±3,8% и 89,0±3,5%, а в группе ВИЧ(–) — по 100±0% соответственно. Замена серина на аспарагин в 309 позиции (S309N) присутствовала в составе абсолютно всех анализируемых последовательностей China 1, NC, Med–, Alaskan и «другие». Мутация E328Q характеризовала 94,1±3,3% изолятов B95-8 в группе ВИЧ(+) и все изоляты B95-8 в группе ВИЧ(–). Варианты комбинаций аминокислотных замен G212S, E328Q и S366T в последовательностях LMP-1 B95-8 представлены в табл. 3. В основной части их них присутствовало сочетание G212S+E328Q+S366T.

 

Таблица 3. Комбинации аминокислотных замен G212S, E328Q и S366T в последовательностях LMP-1 B95-8

Table 3. Combinations of amino acid substitutions G212S, E328Q and S366T in LMP-1 B95-8 sequences

Аминокислотные замены в С-концевом участке LMP-1 B95-8 Amino acid substitutions in the C-terminal region of LMP-1 B95-8	ВИЧ(+) | HIV(+) (n = 51)		ВИЧ(–) | HIV(–) (n = 12)
	абс. abs.	P±σp,%	абс. abs.	P±σp,%
Без мутаций | No mutations G212S, E328Q, S366T	1	2,0±1,9	0
G212S	2	3,9±2,7	0
G212S+E328Q	2	3,9±2,7	0
E328Q+S366T	3	5,9±3,3	1	8,3±8,3
G212S+E328Q+S366T	43	84,3±5,1	11	91,7±8,3

 

Отдельные аминокислотные замены встречались с частотой 10–25% от общего числа изолятов. В их числе 10 сигнатурных аминокислотных замен в 6 основных локусах (S229T, L306Q, L306P, D312N, Q322E, Q322N, Q322T, Q334R, L338P, L338S), которые были нами использованы при дифференциальной оценке вариантов LMP-1 по классификации R. Edwards и соавт. [24]. А также дополнительные штамм-характерные мутации для NC (D250N, S313P, G331Q, H352N, H358P) и Med– (H352R и замена аспарагиновой кислоты на глицин в третьем положении аминокислоты в повторяющемся элементе из 11 а.к.: D266G, D282G, D293G).

В результате проведенного анализа определен широкий спектр аминокислотных замен, которые встречались спорадически (< 10%). При этом чаще других обнаруживали мутации D372N в изолятах B95-8 (4/51) и G335D в изолятах NC (5/16). Описаны 64 аминокислотные замены, которые ранее в нижегородских изолятах ВЭБ не выявлялись. Преимущественно они были сгенерированы в последовательностях LMP-1 ВЭБ из лейкоцитов крови ВИЧ(+) пациентов (57 из 64 мутаций):

• B95-8: D210S, R223K, C238S, N251H, T259S, Q281H, P283H, N285D, T286P (2), N289P, G290D, Q292H, P294H, N296G, N296D, T297P, N300P, G301A, G301D, P305H, L306V, S309I, A314V, N316S, Q322P, G343R, G345V, G353V, G355C, D356E, D356H, P357T, L359S, L359Y, S369P, D372N;
• China 1: D210N, D261G, L338F, G355C;
• Med–: N220D, G222D, T259S, N269D, D287H, N329H, N329S, H348D, D349A, L359I;
• NС: H224Q, Q322K, L323M, E325K, G331E, L338T, M339K;
• Alaskan: не выявлено;
• Другие варианты LMP-1: A231T, G232E, D349A, D349E, G355C.

В группе ВИЧ(–) уникальные замены встречались в единичных изолятах B95-8 и Med–: D210S, L359F, D372H, G319D, L323M, N329H, G355C.

Сравнительный анализ с САО-подобными (GenBank: X58140.1) аминокислотными заменами показал, что мутации G212S и S366T, как ранее было отмечено, представлены практически во всех нижегородских изолятах ВЭБ; Q322N является уникальной мутацией для штамма China 1, а Q334R, L338S — сигнатурные замены, характеризующие штаммы China 1 и Med–. В то же время мутации Q189P, S192T, E328A в анализируемых последовательностях обнаружены не были.

Обсуждение

Впервые в России в рамках данной работы выполнены исследования, направленные на оценку молекулярно-генетического разнообразия ВЭБ у ВИЧ-инфицированных. Анализ литературных данных свидетельствует о высоком генетическом разнообразии ВЭБ, циркулирующего во всем мире [4].

Типы ВЭБ. В России только в последние два года появились первые публикации, посвященные оценке распространенности основных типов вируса — ВЭБ-1 и ВЭБ-2 [2, 5, 11]. Пока эти исследования были ограничены контингентами условно здоровых взрослых лиц определенной этнической принадлежности (славяне, татары, калмыки) и детей с активной или латентной ВЭБ-инфекцией [2, 5, 11]. В то время как зарубежные публикации убедительно свидетельствуют об особенностях распространенности ВЭБ-1 и ВЭБ-2 в популяции ВИЧ-инфицированных [21, 34, 37, 38, 40, 41, 49, 50].

В результате проведенного нами исследования лейкоцитов крови установлено доминирование ВЭБ-1 в структуре нижегородских изолятов ВЭБ у взрослых. Преобладание типа ВЭБ-1 ранее нами было выявлено и в детской популяции Нижегородской области [5]. Однако в изолятах ВЭБ у взрослых ВИЧ-инфицированных пациентов в данном исследовании идентифицированы также ВЭБ-2 и коинфицирование обоими типами вируса. Такое распределение, в целом, соответствует предыдущим оценкам распространенности ВЭБ-1 и ВЭБ-2 у ВИЧ-инфицированных, проживающих в разных регионах мира, по сравнению с иммунокомпетентными лицами (табл. 4) [13, 21, 22, 27, 34, 35, 37, 39, 41, 46, 50].

 

Таблица 4. Распространенность ВЭБ-1 и ВЭБ-2 у взрослых ВИЧ-инфицированных в разных географических регионах

Table 4. Prevalence of EBV-1 and EBV-2 in HIV-infected adults in different geographic regions

Географическое место Geographical location	Группа Group	Материалы Materials	Частота выявления типов ВЭБ, % Frequency of detection of EBV types, %			Ссылка Reference
			ВЭБ-1	ВЭБ-2	ВЭБ-1+ВЭБ-2
Россия (Нижегородская область) Russia (Nizhny Novgorod region)	ВИЧ(+) HIV(+)	лейкоциты крови blood leukocytes	88,2	5,4	6,4	результаты данного исследования results of this study
	ВИЧ(–) HIV(–)		100	–	–
Пакистан Pakistan	ВИЧ(+) HIV(+)	кровь blood	40,0	15,0	5,0	[37]*
	ВИЧ(–) HIV(–)		90,0	–	–
Китай (Шанхай) China (Shanghai)	ВИЧ(+) HIV(+)	слюна saliva	62,3	9,3	12,9	[46]**
	ВИЧ(–) HIV(–)		28,9	15,4	–
Аргентина Argentina	ВИЧ(+) HIV(+)	МНПК PBMC	48,6	18,8	32,6	[21]
	ВИЧ(–) HIV(–)		74,3	12,4	13,3
Бразилия (Рио-де-Жанейро) Brazil (Rio de Janeiro)	ВИЧ(+) HIV(+)	мазки из ротоглотки oropharyngeal swabs	32,9	45,7	14,3	[39]
Бразилия (Рио-де-Жанейро) Brazil (Rio de Janeiro)	ВИЧ(–) HIV(–)	слюна saliva	79,6	20,4	–	[13]
Бразилия (Ботукату) Brazil (Botucatu)	ВИЧ(+) HIV(+)	МНПК PBMC	75,8	9,5	14,7	[27]
Бразилия (регион Амазонки) Brazil (Amazon region)	ВИЧ(+) HIV(+)	кровь blood	47,4	26,3	26,3	[34]
Бразилия (Буркина-Фасо) Brazil (Burkina Faso)	ВИЧ(+) HIV(+)	кровь blood	3,9	4,6	2,1	[41]**
Италия Italy	ВИЧ(+) HIV(+)	МНПК PBMC	97,4	2,6	–	[35]

Примечание. ВИЧ(+) — лица, живущие с ВИЧ. ВИЧ(–) — здоровые доноры. МНПК — мононуклеарные клетки периферической крови. * — 40% и 10% изолятов ВЭБ у ВИЧ(+) и ВИЧ(–), соответственно, не типированы. ** — частота рассчитана исходя из общей численности выборки.

Note. HIV(+) — persons living with HIV. HIV(–) — healthy donors. PBMC — peripheral blood mononuclear cells. * — 40% and 10% of EBV isolates in HIV(+) and HIV(–), respectively, are not typed. ** — frequency calculated based on the total sample size.

 

На основании данных табл. 4 хотелось бы акцентировать внимание на широкий спектр биосубстратов и используемых лабораторных протоколов при проведении исследований разными научными группами, даже в пределах территории одной страны (например, Бразилии), что в сочетании с весьма разнородными контингентами обследуемых и различным представлением частоты обнаружения типов ВЭБ создает определенный информационный хаос [13, 34, 39, 41].

Предполагается, что инфицирование ВЭБ-2 может происходить в условиях хронической иммунной активации, например, в тех частях Африки, где много сопутствующих инфекций, включая малярию, или у иммунокомпрометированных лиц [25, 43]. Известно, что распространенность штаммов ВЭБ-2 выше в когорте гомосексуальных мужчин, инфицированных ВИЧ (превышает 30%), и среди них чаще выявляются случаи коинфекции ВЭБ-1+ВЭБ-2 или разных вирусов одного типа [37, 39, 49]. Отсутствие лечения или позднее начало антиретровирусной терапии у ВИЧ-инфицированных детей и взрослых повышает риск коинфекции ВЭБ-1+ВЭБ-2 и развитие симптомов [33, 36].

В контексте фенотипических свойств известно, что ВЭБ-1 более эффективно трансформирует В-лимфоциты человека, чем ВЭБ-2 [41]. Кроме того, разные штаммы ВЭБ-1 in vitro продемонстрировали выраженные различия в трансформирующем потенциале и клеточном тропизме, возможно, предопределяя развитие разных типов опухолей [42]. Относительно недавно появились сообщения о том, что ВЭБ-2 инфицирует Т-клетки in vitro и in vivo [19, 20]. Описаны также различия в иммунологическом профиле ВИЧ-инфицированных в зависимости от инфицирующего типа ВЭБ. Так, ВЭБ-1 более часто выявляли среди пациентов с меньшим количеством CD4⁺ Т-лимфоцитов и высокой вирусной нагрузкой ВИЧ, в то время как ВЭБ-2 преобладал в иммунных профилях, включающих CD4⁺ Т-лимфоциты > 500 клеток/мкл и низкую вирусную нагрузку ВИЧ [34, 39, 41].

Геноварианты LMP-1 ВЭБ. Многие десятилетия внимание как зарубежных, так и российских исследователей было сосредоточено на изучении основного онкогена ВЭБ — LMP-1 [1, 3, 6, 7, 9, 10, 11, 16, 24, 40, 48]. В нашем исследовании получены первые данные о распространенности вариантов LMP-1 ВЭБ у ВИЧ-инфицированных пациентов. В общем выявлено 5 из 7 известных вариантов LMP-1, а именно B95-8, China 1, Med–, NC и Alaskan. Результаты собственных исследований дополняют уже имеющиеся сведения о доминировании на территории Европейской части России варианта LMP-1 B95-8 [1, 3, 5, 6, 11]. Они отличаются от штаммового распределения, представленного в работе ученых из Китая (China 1 — 73,8%, China 2 — 21,3%, Med+ — 3,8%), которое описывает у ВИЧ-инфицированных характерное для географического места выделения изолятов преобладание варианта China 1 и сопряженные с ним CAO-подобные мутации (делеция 10 а.к. или больший размер области тандемных повторов) [46]. Статистически значимые различия частот обнаружения вариантов LMP-1 между исследуемыми группами ВИЧ(+) и ВИЧ(–) в нашем исследовании выявлены не были. Однако в их спектре у ВИЧ-инфицированных наблюдались некоторые особенности, включая обнаружение «других вариантов» LMP-1 вне классификации.

К настоящему времени накоплены сравнительные данные о биологических свойствах вариантов LMP-1. Так, варианты САО, Alaskan, China 1 и Med+ повышают активность транскрипционного фактора NF-κB по сравнению с иными вариантами [29, 43]. Для изучения фенотипических характеристик вновь выявленных рекомбинантных вариантов LMP-1 необходимо в дальнейшем проведение экспериментальных исследований in vitro и in vivo.

Нами представлено детальное описание полученных изолятов ВЭБ на уровне так называемых субвариантов (тандемные повторы, делеции и аминокислотные замены).

Делеции. В последовательностях LMP-1 ВЭБ у ВИЧ-инфицированных выявлен более широкий спектр делеций. Делеция 5 а.к. (276–280 а.к.) в области тандемных повторов между повторяющимися мотивами из 11 а.к. была обнаружена во всех последовательностях LMP-1 China 1, Med–, NC, Alaskan и «другие варианты», независимо от их источника и типовой принадлежности. Данная делеция из 5 а.к. является частью функционального домена CTAR3 (а.к. 275–330), который отвечает за активацию STAT3 посредством рекрутирования JAK3 [9, 10]. Другая делеция в 30 н.о./10 а.к. (а.к. 346–355) широко известна как «делетированный вариант LMP-1» с установленной выраженной транформирующей активностью в фибробластах грызунов или эпителиальных клетках, имплантированных голым мышам [18, 28, 43], а также повышенным риском отдаленного метастазирования [31, 43]. Отметим, что на основе данных литературы и по результатам собственных наблюдений штаммы с этой делецией ассоциированы только с определенными САО-подобными вариантами LMP-1, такими как China 1 и Med+ [24]. Возможно, это объясняет контрастирующие данные литературы, когда у ВИЧ-инфицированных из Бразилии и Аргентины (регионы с высоким распространением штаммов China 1 и Med+) делеция 30 п.н./10 а.к. встречалась чаще [21, 27], а в Швейцарии (регион Европы, в котором доминирует штамм B95-8) различия отсутствовали [51].

Область тандемных повторов. Известно, что прототипный штамм ВЭБ в области тандемных повторов (а.к. 253–306) включает четыре идеальных повтора, состоящих из 11 а.к. (PQDPDNTDDNG) с разрывом в 5 а.к. (PHDPL) между вторым или третьим повторами (так называемые «4,5 повтора»). Другой мотив из 5 а.к. PHDPL (а.к. 302–306) завершает область тандемных повторов. Анализируемые последовательности ВЭБ у ВИЧ-инфицированных пациентов характеризовались выраженным разнообразием области тандемных повторов. В то время как в изолятах LMP-1 B95-8 у ВИЧ(–) взрослых или в ранее проведенном нами исследовании у детей [5] встречались, как правило, прототипные последовательности тандемных повторов, у 15,7±5,1% ВИЧ-инфицированных пациентов при этом были выявлены их модифицированные субварианты. Клинико-эпидемиологическая оценка полиморфизма области тандемных повторов ограничивается единичными публикациями [16, 26, 46].

Аминокислотные замены. Выявлен широкий спектр аминокислотных замен в нижегородских изолятах ВЭБ у взрослых. Несмотря на то что замена глицина на серин в 212 положении является штамм-характерной для China 1, China 2, China 3 и Alaskan, а замена серина на треонин в 366 кодоне присутствует в референсных штаммах LMP-1 China 1, Med–, Med+, NC и Alaskan [24], в нижегородских изолятах ВЭБ у взрослых они также были обнаружены практически во всех изолятах LMP-1 B95-8. Поскольку эти мутации относятся к САО-подобным, их фенотипические характеристики были достаточно хорошо изучены как зарубежными, так и российскими исследователями. Мутация G212S приходится на первый сайт распознавания HOS-белков (одного из компонентов E3-лигазы, участвующего в процессинге молекулы IkB — супрессора NF-kB) [8]. Замена S366T локализуется в одном из сайтов связывания белков SCFHOS/βATrCP и приводит к тому, что мутантный белок теряет способность связываться с белками Е3-лигазного комплекса. В результате в клетке концентрация LMP-1 повышается, пул белков SCFHOS/βTrCP не истощается, и подавления сигнального пути NF-kB не происходит. Накопление же транскрипционного фактора NF-kB играет важную роль в процессе трансформации инфицированных вирусом клеток [12]. По данным других исследователей любая из замен (G212S либо S366T) ассоциирована с усилением активации Erk и индукции экспрессии c-Fos [44], что влияет на процессы выживания, пролиферации, дифференцировки и миграции клеток. Примечательно, что в основной части нижегородских изолятов ВЭБ у взрослых, и, как ранее нами было установлено, у детей присутствовала двойная замена G212S/S366T [5]. Данное сочетание функционально ассоциировано с повышением уровня активации сигнального пути NF-kB и протеинкиназы-В (PKB/Akt) [1, 9]. По данным литературы у больных раком носоглотки (РНГ) из России довольно часто наблюдали замену S366А [6, 7], которая также была нами обнаружена в одном изоляте ВЭБ у взрослого ВИЧ-инфицированного пациента (вариант Med–), а ранее также у детей с инфекционным мононуклеозом (варианты B95-8 и China 1) [5].

В нижегородских изолятах ВЭБ мутация E328Q ассоциирована исключительно с вариантом LMP-1 B95-8 с частотой выявления близкой к 100%. Замена E328Q достаточно широко распространена среди жителей России [2, 5, 11], а также была описана в изолятах ВЭБ от больных инфекционным мононуклеозом и раком носоглотки в Сербии [15, 16]. Замена E328Q расположена в координатах области CTAR3 и способствует метаболизму глюкозы путем усиления экспрессии c-Myc посредством STAT3 [47]. Ее функциональную роль связывают со снижением цитотоксичности и усилением трансформирующей активности белка LMP-1. Предполагается, что обнаруженные аминокислотные замены в 212, 328 и 366 положениях LMP-1 придают этому онкобелку агрессивные характеристики и характерны для высокотуморогенных вариантов [8].

Остальная часть выявленных в настоящем исследовании мутаций остаются фенотипически не охарактеризованными. Можно предположить, что они потенциально могут изменять профиль внутриклеточной активности ряда сигнальных путей и их биологические свойства [10]. Для выяснения роли каждого из них необходимо проведение экспериментальных работ in vitro и in vivo.

Таким образом, все перечисленные особенности изолятов ВЭБ у пациентов с ВИЧ-инфекцией характеризуют эту группу лиц как резервуар генетической нестабильности ВЭБ и источник молекулярно-генетического разнообразия циркулирующих штаммов вируса.

Заключение

Впервые в России проведена оценка молекулярно-генетического разнообразия ВЭБ у ВИЧ-инфицированных лиц. Расширены представления о типовой структуре изолятов ВЭБ в Нижегородской области. Установлено, что у взрослых ВИЧ-инфицированных преобладает тип ВЭБ-1, реже выявляются ВЭБ-2 и коинфицирование обоими типами вируса. В отличие от ВИЧ(+) пациентов в группе ВИЧ(–) обнаружен исключительно ВЭБ-1.

Получены новые данные о распространенности различных вариантов LMP-1 ВЭБ у ВИЧ-инфицированных. Всего выявлено 5 вариантов LMP-1 по классификации R. Edwards и соавт.: B95-8, China 1, Med–, NC и Alaskan, среди которых доминировал геновариант B95-8. При этом их частота встречаемости между исследуемыми группами ВИЧ(+) и ВИЧ(–) не различалась.

Как общая тенденция, при ВИЧ-инфекции отмечено появление рекомбинантных вариантов LMP-1 ВЭБ, более широкий спектр делеций, выраженная вариабельность области тандемных повторов с присутствием модифицированных мотивов и точечными аминокислотными заменами в них, а также описаны 57 аминокислотных замен, которые ранее в нижегородских изолятах ВЭБ не выявлялись.

Полученные результаты лежат в основе перспективного изучения взаимосвязи клинико-лабораторных особенностей ВЭБ+ВИЧ-коинфекции и генетической гетерогенности популяции ВЭБ на уровне типов, вариантов и субвариантов вируса.

 

¹ URL: https://www.megasoftware.net

² URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank

³ URL: https://www.R-project.org

⁴ URL: http://www.rstudio.com

About the authors

Mariia I. Popkova

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Author for correspondence.
Email: popmarig@mail.ru

PhD (Medicine), Leading Researcher, Laboratory of Molecular Biology and Biotechnology

Россия, Nizhny Novgorod

E. N. Filatova

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: popmarig@mail.ru

PhD (Biology), Leading Researcher, Laboratory of Molecular Biology and Biotechnology

Россия, Nizhny Novgorod

S. V. Minaeva

Privolzhskiy Research Medical University

Email: popmarig@mail.ru

PhD (Мedicine), Associate Professor of the Epidemiology, Microbiology and Evidence-Based Medicine Department

Россия, Nizhny Novgorod

N. A. Sakharnov

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: popmarig@mail.ru

PhD (Biology), Senior Researcher, Laboratory of Molecular Biology and Biotechnology

Россия, Nizhny Novgorod

O. V. Utkin

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: utkino2004@mail.ru

PhD (Biology), Head of the Laboratory of Molecular Biology and Biotechnology

Россия, Nizhny Novgorod

References

Supplementary files