Quantitatively assessed blood leukocyte Epstein–Barr virus in adult HIV-infected patients

Full Text

Введение

Вирус Эпштейна–Барр (ВЭБ) и вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) — лимфотропные вирусы, которые поражают преимущественно В-клетки и CD4⁺ Т-клетки соответственно. Оба вируса убиквитарны, характеризуются всеобщей восприимчивостью населения и пожизненной персистенцией в организме человека. Специфические средства профилактики до сих пор отсутствуют, а терапевтические стратегии не позволяют полностью элиминировать эти вирусы [12, 21].

Коинфицирование ВЭБ и ВИЧ является актуальной медико-биологической проблемой. Более 90% населения мира во взрослом возрасте являются серопозитивными к ВЭБ [5, 41, 49]. Большинство взрослых людей, которые заражаются ВИЧ, уже инфицированы ВЭБ [12, 21, 50]. К началу 2022 г. распространенность ВИЧ среди взрослого населения в возрасте от 15 до 49 лет во всем мире достигла 0,7% [24], в России — 1,42% [6], для сравнения, в Китае — 0,05% [49]. Россия относится к тем странам, в которых темпы увеличения случаев новых заражений ВИЧ-инфекцией и числа смертей, связанных с ВИЧ, велики [11].

На протяжении 40-летнего периода от начала эпидемии ВИЧ-инфекции наиболее широко в работах как зарубежных, так и российских исследователей изучались преимущественно вопросы реактивации ВЭБ-инфекции, взаимного влияния ВЭБ и ВИЧ друг на друга в контексте прогрессирования ВИЧ-инфекции, а также патогенеза ассоциированных с ними злокачественных новообразований [9, 11, 12, 18, 21, 29, 45, 47]. В то время как клинико-эпидемиологические особенности ВЭБ-инфекции у лиц с ВИЧ-инфекцией остаются недостаточно изученными.

По данным литературы у ВИЧ-инфицированных ВЭБ является возбудителем, наиболее часто выявляемым в самых разных биосубстратах и в широком диапазоне концентраций [13, 33, 39, 50]. ВЭБ, обнаруживаемый в периферической крови ВИЧ-инфицированных пациентов, преимущественно ассоциирован с мононуклеарными клетками периферической крови (МНПК) и в плазме крови выявляется редко [20, 40]. Частота обнаружения ДНК ВЭБ у ВИЧ-инфицированных в МНПК по данным разных исследователей существенно различается, варьируя от 6,7% [43] до 78,8% [36]. Вирусная нагрузка ВЭБ в МНПК у взрослых лиц быстро увеличивается после сероконверсии ВИЧ и остается на высоком уровне в течение многих лет [37]. Во всем мире исследования, направленные на количественную оценку выявления ДНК ВЭБ у ВИЧ-инфицированных, не носят систематический характер, а имеющиеся в литературе данные представляют собой разрозненную информацию, полученную на основе использования разных лабораторных протоколов, обследования разнородных групп пациентов и ограниченного набора клинико-лабораторных признаков [13, 34, 46, 50]. В РФ изучению данного вопроса посвящены единичные публикации [13].

Цель исследования — оценить частоту выявления и вирусную нагрузку ВЭБ в лейкоцитах крови у взрослых ВИЧ-инфицированных пациентов.

Материалы и методы

Проведено комплексное клинико-лабораторное обследование 138 ВИЧ-инфицированных пациентов в возрасте 20–69 лет, которые находились на диспансерном наблюдении в ГБУЗ НО «НОЦ СПИД» (г. Нижний Новгород), и 68 ВИЧ-неинфицированных лиц сопоставимого пола и возраста без клинических признаков инфекционной патологии, проходивших диспенсеризацию в ООО «НИКА СПРИНГ НН» (г. Нижний Новгород).

Соблюдение этических требований. Работа проводилась с деперсонализированными данными пациентов. Информированное согласие пациентов на проведение исследовательской работы в соответствии с положениями Хельсинкской декларации (2013) было получено лечащими врачами медицинских организаций. Работа получила одобрение на заседании локального этического комитета ФБУН ННИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора (Протокол № 3 от 11.11.2021 г.).

Группы сравнения. Сформированы группы сравнения:

1. ВИЧ-инфицированные пациенты (ВИЧ(+), n = 138) и ВИЧ-отрицательные лица (ВИЧ(–), n = 68);
2. ВИЧ(+) пациенты по клиническим стадиям ВИЧ-инфекции на основе действующей в РФ классификации [3]: стадия 3 (C₃, n = 64), стадия 4 (C₄, n = 74), в том числе 4А (C_4А, n = 46), 4Б (C_4Б, n = 9 ) и 4В (C_4В, n = 19 );
3. ВИЧ(+) пациенты на основе комбинации данных о степени иммунных нарушений (на основе классификации ВОЗ [48]) и антиретровирусной терапии (АРТ): «наивные» пациенты (без АРТ), CD4⁺ Т-лимфоциты < 200 клеток/мкл (G1, n = 30); «наивные» пациенты (без АРТ), CD4⁺ Т-лимфоциты > 500 клеток/мкл (G2, n = 20); «опытные» пациенты (получающие АРТ в среднем 36 месяцев), CD4⁺ Т-лимфоциты < 200 клеток/мкл (G3, n = 43); «опытные» пациенты (получающие АРТ в среднем 36 мес.), CD4⁺ Т-лимфоциты > 500 клеток/мкл (G4, n = 45).
4. ВИЧ(+) пациенты, получающие АРТ (n = 88), по схемам терапии: 2 НИОТ+ННИОТ (A, n = 41), 2 НИОТ+ИП (B, n = 27), 2 НИОТ+ИИ (C, n = 14), ИП+ИИ (D, n = 6)¹.
5. ВИЧ(+) пациенты, получающие АРТ (n = 88), по степени приверженности: высокая (Н, n = 55), средняя (M, n = 5), низкая (L, n = 28).

Анализ клинико-лабораторных показателей каждого пациента (клинические стадии, схемы АРТ и приверженность терапии, результаты ИФА, иммуноблоттинга и ПЦР для определения маркеров ВИЧ-инфекции) проведен ретроспективно на основе данных медицинской документации. Для количественной оценки CD4⁺ Т-лимфоцитов использовали проточный цитофлуориметр BD FACSCalibur (Becton Dickinson, США). Вирусную нагрузку ВИЧ определяли методом ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) с помощью тест-системы «РеалБест РНК ВИЧ количественный» (АО «Вектор-Бест», Россия). Рекомендуемый производителем тест-системы порог определяемой вирусной нагрузки ВИЧ в плазме крови составляет 58 копий/мл.

ПЦР-исследования для детекции ДНК ВЭБ проводились в лаборатории молекулярной биологии и биотехнологии ФБУН ННИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора. Всем здоровым участникам исследования также было выполнено количественное определение абсолютного и относительного числа CD4⁺ Т-лимфоцитов на проточном цитофлуориметре BD FACSCanto II (Becton Dickinson, США) с использованием набора реагентов «BD Multitest™ 6-color TBNK» (BD Biosciences, США).

Материал для исследования. Материалом для исследования послужила цельная периферическая кровь, стабилизированная К3ЭДТА. Для получения фракции лейкоцитов крови использовали реагент «Гемолитик» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) в соответствии с инструкцией производителя.

Количественное определение ДНК ВЭБ. Выделение тотальной нуклеиновой кислоты из лейкоцитов крови проводили с помощью комплекта реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия). Выявление и количественное определение ДНК ВЭБ в лейкоцитах крови выполняли методом ПЦР-РВ с применением коммерческого набора «АмплиСенс^® EBV/CMV/HHV6-cкрин-FL» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) на амплификаторе Rotor-Gene Q 5plex HRM (Qiagen, Германия). Лабораторный протокол на всех этапах ПЦР соблюдали согласно инструкции производителя.

Статистическая обработка данных. Статистическая обработка данных проводилась с использованием языка программирования R версия 2022.12.0+353 (The R Foundation for Statistical Computing, Inc.)² и среды RStudio версия 2022.12.0+353 (RStudio, PBC)³. Принадлежность выборок к нормальному распределению определяли с помощью критерия Шапиро–Уилка и графиков квантилей. Для попарного сравнения независимых выборок использован критерий Манна–Уитни и коэффициент ранговой корреляции Спирмена (r_S). Количество ДНК, РНК и клеток представляли в виде Me [Q1; Q3] (где Ме — медиана, Q1, Q3 — первый и третий квартили). Долю описывали с указанием стандартного отклонения процентной доли (P±σ_p, %). Оценку различий относительных показателей в анализируемых группах проводили с применением критерия χ² (хи-квадрат) с поправкой Йетса и критерия Фишера. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05.

Оценку возможного влияния ВИЧ-инфекции на активность ВЭБ-инфекции проводили с использованием метода главных компонент (РСА-анализ). Анализировали распределение ВИЧ(+) пациентов в координатах первых двух главных компонент в зависимости от вирусной нагрузки ВИЧ, содержания СD4⁺ Т-лимфоцитов и приверженности пациентов АРТ. При этом приверженность терапии выражали в числовых значениях от 0 до 1, где 0 — без АРТ, 1 — высокая приверженность АРТ. Для оценки вклада исследуемых переменных в состав компонент рассчитывали их корреляцию — косинус угла между вектором переменной и осью компоненты. Возможные факторы группировки пациентов в координатах двух первых измерений выявляли методом визуального наложения.

Для оценки возможности применения показателей вирусной нагрузки ВИЧ и содержания CD4⁺ Т-лимфоцитов в качестве скрининговых лабораторных критериев отнесения ВИЧ(+) пациентов в группу риска активной ВЭБ-инфекции строили логит-модель зависимости выявления активной ВЭБ-инфекции от вирусной нагрузки ВИЧ и абсолютного количества CD4⁺ Т-лимфоцитов. ВЭБ-инфекцию считали активной, если вирусная нагрузка ВЭБ превышала установленный на основе описанной нами ранее методологии пороговый уровень ≥ 29 копий/10⁵ клеток [7]. Для оценки стабильности модели, воспроизводимости результата применяли метод кросс-валидации. Оценку качества модели производили на основании показателей AUC и коэффициента R² МакФаддена (AUC ≥ 0,750 и R² ≥ 0,200). Для определения порогового значения количества CD4⁺ Т-лимфоцитов, соответствующего активной ВЭБ-инфекции, рассчитывали значение индекса Юдена построенной ROC-кривой отношения специфичности и чувствительности теста. Затем всех исследуемых лиц объединяли в две группы: с низким содержанием CD4⁺ Т-лимфоцитов (ниже порогового) и с высоким (равным или выше порогового). Рассчитывали отношение рисков (ОР) выявления активной ВЭБ-инфекции у лиц с содержанием CD4⁺ Т-лимфоцитов ниже и выше выявленного порога. В расчетах применяли метод максимального правдоподобия и метод Вальда.

Результаты

Частота обнаружения и концентрация ДНК ВЭБ в лейкоцитах крови ВИЧ(+) и ВИЧ(–) взрослых лиц

На основе метода ПЦР-РВ установлено, что ДНК ВЭБ в лейкоцитах крови ВИЧ(+) пациентов выявляли чаще и в более высокой концентрации, чем среди ВИЧ(–) лиц (табл. 1). Рассчитанный относительный риск выявления ДНК ВЭБ в группе ВИЧ(+) был в 1,4 раза выше по сравнению с группой ВИЧ(–) (ОР 1,37 (95% ДИ: 1,09–1,72), р = 0,008). Вирусная нагрузка ВЭБ в группе ВИЧ(+) варьировала в широком диапазоне — от недетектируемого уровня до 11137 копий/10⁵ клеток, а по сравнению с группой ВИЧ(–) в среднем была выше на 14 (95% ДИ: 7–43) копий/10⁵ клеток (р < 0,001).

 

Таблица 1. Сравнительная характеристика частоты выявления и концентрации ДНК ВЭБ в лейкоцитах крови ВИЧ(–) и ВИЧ(+) взрослых лиц

Table 1. Comparative characteristics for EBV DNA detection and viral load in blood leukocytes of HIV(–) and HIV(+) adults

Группа сравнения Comparison group	Исследовано проб Samples examined
	Всего Total	из них ДНК ВЭБ(+) including EBV DNA(+)
	n	n	P±σp, %	ДНК ВЭБ, копии/105 клеток EBV DNA, copies/105 cells Ме [Q1; Q3]
ВИЧ(–) HIV(–)	68	33	48,5±6,1	2 [1; 3]
ВИЧ(+) HIV(+)	138	97	70,3±3,9^^	18 [5; 139]^
в том числе: including:
C3	64	33	51,6±6,3	9 [2; 24]^^
C4	74	62	83,8±4,3^,*	36 [6; 173]^,**
C4А/C4А	46	38	82,6±5,6^,*	35 [7; 196]^,**
C4Б/C4B	9	8	88,9±10,5^^,*	36 [6; 173]^^,**
C4В/C4C	19	16	84,2±8,4^^,*	49 [5; 115]^,**
G1	30	26	86,7±6,2^^	121 [34; 252]^
G2	20	14	70,0±10,3	6 [1; 9]#
G3	43	35	81,4±5,9^^	54 [8; 212]^
G4	45	22	48,9±7,4#	9 [2; 14]^^,#
A	41	27	65,9±7,4	22 [6; 167]^
B	27	21	77,8±8,2^^	14 [6; 147]^
C	14	7	50,0±13,9	6 [3; 30]^^
D	6	2	33,3±21,1	12 [7; 17]
H	55	29	52,7±7,4	6 [2; 22]^^
M	5	3	60,0±21,9	14 [14; 75]^^
L	28	25	89,3±5,9^,##	54 [14; 224]^,##

Примечание. ^ — р < 0,001 (относительно группы ВИЧ(–));^^ — р < 0,01 (относительно группы ВИЧ(–)); * — р < 0,001 (относительно группы С₃); ** — р < 0,01 (относительно группы С₃); ^# — р < 0,01 (относительно групп G1 и G3); ^## — р < 0,001 (относительно группы H).

Note. ^ — р < 0.001 (relative to group HIV(–));^^ — р < 0.01 (relative to group HIV(–)); * — р < 0.001 (relative to group C₃); ** — р < 0.01 (relative to group C₃); ^# — р < 0.01 (relative to groups G1 and G3); ^## — р < 0.001 (relative to group H).

 

Неоднородность группы ВИЧ(+) пациентов по частоте выявления и концентрации ДНК ВЭБ в лейкоцитах крови

На основе дифференциального анализа в группе ВИЧ(+) пациентов установлены различия по частоте выявления и концентрации ДНК ВЭБ в лейкоцитах крови. При оценке полученных результатов по стадиям ВИЧ-инфекции показано, что в группе С₃ частота обнаружения ДНК ВЭБ была одинаковой по сравнению с группой ВИЧ(–), но вирусная нагрузка отличалась более высокими значениями (р = 0,003) (табл. 1). Как общая тенденция, в группах C₄ (C_4А, C_4Б, C_4В) относительно группы C₃ резко возрастали частота выявления и концентрация ДНК ВЭБ (р < 0,001 и р = 0,023 соответственно). При этом между группами C_4А, C_4Б и C_4В статистически значимые различия выявлены не были. Дополнительно проведенный анализ данных по стадиям ВИЧ-инфекции с учетом проводимой АРТ позволил уточнить, что наиболее высокие значения вирусной нагрузки ВЭБ наблюдались в группе C₄ у пациентов без АРТ. Средняя концентрация ДНК ВЭБ у них была в 3,0 раза выше по сравнению с пациентами этой же группы, получавших АРТ (р = 0,043), и в 4,0 раза выше, чем у пациентов в группе C₃ без АРТ (р < 0,001).

Примененный нами подход разделения ВИЧ(+) пациентов на группы G1–G4 позволил выявить следующие закономерности. Наименьшая частота выявления ДНК ВЭБ, близкая по своим значениям к группе ВИЧ(–), отмечалась в группе G4 (табл. 1). Наиболее высокая частота обнаружения и вирусная нагрузка ВЭБ были выявлены в группе G1. Рассчитанный относительный риск выявления ДНК ВЭБ в этой группе был в 3,5 раза выше, чем у ВИЧ(–) лиц (ОР 3,53 (95% ДИ: 1,33–9,32), р = 0,003). Для сравнения, в совокупной группе ВИЧ(+) ОР составил 1,37. Между группами G1 и G3, а также G2 и G4 по частоте обнаружения и вирусной нагрузке ВЭБ статистически значимые различия не выявлены.

Дана оценка влияния АРТ на количественные показатели ВЭБ (табл. 1). Установлено, что применение той или иной схемы АРТ существенно не отражалось на обнаружении и концентрации ДНК ВЭБ в лейкоцитах крови ВИЧ-инфицированных. Выявление вирусной ДНК было обусловлено, главным образом, приверженностью терапии. Относительный риск выявления ДНК ВЭБ в группе L по сравнению с группой H был выше в 1,7 раза (ОР 1,69 (95% ДИ: 1,28–2,24), р < 0,05).

Последующая дифференциальная оценка частоты обнаружения и вирусной нагрузки ВЭБ у лиц, получающих АРТ, позволила выявить разные профили пациентов в группах G3 и G4 в зависимости от приверженности терапии. Так, в группе G4 вирусная нагрузка ВЭБ при низкой приверженности терапии статистически значимо превышала уровень у пациентов этой же группы с высокой приверженностью на 11 (95% ДИ: 2–20) копий/10⁵ клеток (р = 0,022) и даже соответствующей группы G2 (без АРТ) на 9 (95% ДИ: 2–19) копий/10⁵ клеток (р = 0,022). Частота обнаружения ДНК ВЭБ в группах G2, G4 с низкой приверженностью и G4 с высокой приверженностью АРТ составила соответственно 70,0±10,3%, 77,0±13,7% и 41,8±8,2% (статистически незначимые различия).

Аналогичные тенденции отмечались и в группе G3, когда при низкой приверженности АРТ наблюдались наиболее высокие значения вирусной нагрузки ВЭБ (123 [8; 234] копии/10⁵ клеток) по сравнению с теми пациентами этой же группы, у кого приверженность была высокой (19 [2; 187] копии/10⁵ клеток) и даже по сравнению с соответствующей группой G1 (без АРТ) (55 [7; 186] копии/10⁵ клеток). При этом частота обнаружения ДНК ВЭБ у них была одинаковой (87,5±6,8, 81,4±5,9, 86,7±6,2% соответственно).

На основе разработанной нами ранее методологии [7], установлено пороговое значение вирусной нагрузки ВЭБ (29 копий/10⁵ клеток или 1,5 lg копий/10⁵ клеток), которое может служить лабораторным критерием дифференциальной оценки активной и латентной формы ВЭБ-инфекции. В данном исследовании вирусная нагрузка ВЭБ ≥29 копий/10⁵ клеток выявлялась у 30,4±3,9% от общего числа пациентов в группе ВИЧ(+). При этом уровни, превышающие пороговое значение ДНК ВЭБ, чаще выявляли среди пациентов группы С₄ по сравнению с С₃ (50,0±5,9% против 14,1±4,4%, р < 0,001). Как общая тенденция, их доля увеличивалась от стадии 4а (43,5±7,4%) к 4в (70,0±10,5%) (р = 0,087). Вирусная нагрузка ВЭБ превышала 29 копий/10⁵ клеток у основной части группы G1 (70,0±8,5%) и у половины группы G3 (44,2±7,7%) (р = 0,030). В то время как в группах G2 и G4 такие случаи встречались редко (5,0±5,0% и 4,4±3,1% соответственно), характеризуя тем самым преимущественно латентную форму течения ВЭБ-инфекции. Значительные различия вирусной нагрузки ВЭБ ≥ 29 копий/10⁵ клеток наблюдались между группами Н и L (10,9±4,2% и 50,0±9,6% соответственно, р < 0,001).

Характеристика клинико-лабораторных показателей ВИЧ-инфекции при обнаружении ДНК ВЭБ в лейкоцитах крови пациентов

На следующем этапе исследования выполнен сравнительный анализ лабораторных показателей ВИЧ-инфекции и проводимой АРТ между пациентами, у которых ДНК ВЭБ была обнаружена или не обнаружена — ВЭБ(+)/ВИЧ(+) и ВЭБ(–)/ВИЧ(+) соответственно. Представленные в табл. 2 данные свидетельствуют, что при обнаружении ДНК ВЭБ в лейкоцитах крови отмечается более высокий уровень вирусной нагрузки ВИЧ и низкое содержание CD4⁺ Т-лимфоцитов по сравнению с теми пациентами, у кого ДНК ВЭБ не выявлялась. Различия по возрасту и полу пациентов между группами не выявлены.

 

Таблица 2. Сравнительная характеристика показателей ВИЧ-инфекции в зависимости от выявления ДНК ВЭБ

Table 2. Comparative characteristics of HIV infection indicators depending on EBV DNA detection

Группа Group	n	CD4+		РНК ВИЧ HIV RNA
		отн., % rel., %	абс. клеток/мкл abs., cells/μl	копии/мл copies/ml
ВЭБ(+)/ВИЧ(+) EBV(+)/HIV(+)	97	13,1 [6, 9; 30, 9]	160 [80; 556]	7600 [58; 260 000]
ВЭБ(–)/ВИЧ(+) EBV(–)/HIV(+)	41	29,3 [16, 7; 37, 6]	589 [223; 778]	58 [58; 1200]
Δ (95% ДИ) | Δ (95% CI)		–10,3 (–16,5–3,9)	–255 (–411–90)	3242 (131–27 942)
Уровень значимости различий (р) p-value		0,002	0,001	< 0,001

 

ДНК ВЭБ чаще обнаруживали при определяемом уровне вирусной нагрузки ВИЧ, чем при достижении неопределяемого уровня (то есть 58 копий/мл и ниже) (76,9±6,8% против 55,1±7,1% соответственно, р = 0,057). При этом вирусная нагрузка ВЭБ различалась наиболее значительно (15 [1; 162] против 1 [0; 8] копии/10⁵ клеток, р < 0,001).

По результатам корреляционного анализа у ВЭБ(+)/ВИЧ(+) пациентов установлено наличие прямой связи вирусной нагрузки ВЭБ и ВИЧ (r_S = +0,39, р < 0,001), а также обратной связи вирусной нагрузки ВЭБ и абсолютного/относительного количества CD4⁺ Т-лимфоцитов (r_S = –0,57/r_S = –0,52 соответственно, р < 0,001). При этом отметим, что статистически значимая связь количества CD4⁺ Т-лимфоцитов с вирусной нагрузкой ВИЧ наблюдалась только в группе ВЭБ(+)/ВИЧ(+) (r_S = –0,46, р < 0,001).

Последующий РСА-анализ позволил охарактеризовать зависимость между исследуемыми показателями. При анализе всех ВИЧ(+) пациентов удалось установить их распределение в координатах двух первых компонент, суммарно объяснявших 79,96% дисперсии. Выявлено, что в отношении первой компоненты вклад вирусной нагрузки ВИЧ равноценен, но противопоставлен вкладу содержания CD4⁺ Т-лимфоцитов и приверженности АРТ. Отметим, что параметр содержания CD4⁺ Т-лимфоцитов вносил сопоставимый вклад в формирование как первой, так и второй главных компонент. Для оценки возможного влияния исследованных переменных на ВЭБ-инфекцию провели графический анализ распределения ВИЧ(+) пациентов в координатах двух первых компонент в зависимости от вирусной нагрузки ВЭБ (рис. 1).

 

Рисунок 1. Расположение точек ВИЧ(+) пациентов в координатах двух первых главных компонент с визуальным наложением фактора выявления ДНК ВЭБ выше или ниже порогового уровня (1,5 lg копий/10⁵ клеток). Эллипс отображает 95%-й доверительный интервал расположения барицентра групп. Стрелками обозначены вектора изученных переменных

 

На графике барицентры двух групп располагались на выраженном удалении друг от друга во втором и четвертом квадрантах. Кроме того, все исследованные нами переменные оказывали влияние на риск повышенной вирусной нагрузки ВЭБ. Исходя из этого можно предположить, что у пациентов с низкой приверженностью АРТ (или без АРТ), низким содержанием CD4⁺ клеток и/или высокой вирусной нагрузкой ВИЧ риск выявления ДНК ВЭБ ≥ 1,5 lg копий/10⁵ клеток (или ≥ 29 копий/10⁵ клеток), а, следовательно, активной ВЭБ-инфекции возрастал, и наоборот.

Проведена оценка возможности применения показателей вирусной нагрузки ВИЧ и количества CD4⁺ Т-лимфоцитов в качестве скрининговых лабораторных критериев отнесения пациентов в группу риска активной ВЭБ-инфекции. При тестировании вирусной нагрузки ВИЧ статистически значимых коэффициентов получить не удалось, поэтому была построена модель зависимости вероятности активной ВЭБ-инфекции только от количества CD4⁺ Т-лимфоцитов. Результаты кросс-валидации показали, что из 100 построенных моделей ни для одной показатель AUC не был ниже 0,750. Полученная медиана значений AUC 0,850 [0, 800; 0, 870] свидетельствует о том, что бинарная логистическая модель качественно описывает тестируемую зависимость и обладает хорошей воспроизводимостью результатов.

Для предсказания зависимости вероятности активной ВЭБ-инфекции от количества CD4⁺ Т-лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных построена модель бинарной логистической регрессии. Показатель AUC модели составил 0,829, а значение коэффициента МакФаддена — 0,231, что свидетельствует о высоком качестве модели. Сама модель имела вид:

Logit(p) = LogЕ (p/(1–p)) = 0,558–0,005 × [CD4⁺],

где [CD4⁺] — количество CD4⁺ Т-лимфоцитов (клеток/мкл), р — вероятность выявления активной ВЭБ-инфекции.

Для данной модели построена ROC-кривая и определено пороговое значение вероятности, соответствующее комбинации максимальных значений чувствительности и специфичности модели (рис. 2А). Пороговое значение вероятности составило 0,398, а соответствующие ему значения специфичности и чувствительности — 0,73 и 0,90. При указанных условиях пороговое значение количества CD4⁺ Т-лимфоцитов было эквивалентно 200 клеток/мкл. Также были рассчитаны вероятности выявления активной ВЭБ-инфекции в зависимости от количества CD4⁺ Т-лимфоцитов (рис. 2Б). При этом уровень ложноположительных результатов составил 27% (26 из 96 случаев латентной ВЭБ-инфекции), ложноотрицательных — 10% (4 из 42 случаев активной ВЭБ-инфекции).

 

Рисунок 2. Анализ предиктивной силы показателя абсолютного количества CD4⁺ Т-лимфоцитов для выявления активной ВЭБ-инфекции. Примечание. А) ROC-анализ. Точкой обозначено пороговое значение вероятности и соответствующие ему значения специфичности и чувствительности. Б) Предсказанные вероятности активной ВЭБИ. Закрашенная область соответствует доверительному интервалу вероятности. Пунктирными линиями обозначено пороговое значение вероятности 0,398 и соответствующее ему пороговое значение количества CD4⁺ Т-лимфоцитов (200 клеток/мкл). ВЭБИ — ВЭБ-инфекция.

 

Проведено распределение ВИЧ(+) пациентов в группах активная ВЭБ-инфекция и латентная ВЭБ-инфекция на две категории в зависимости от количества CD4⁺ Т-лимфоцитов: с низким количеством (ниже 200 клеток/мкл) и высоким количеством (равным или выше 200 клеток/мкл). Установлено, что в категории лиц с низким количеством CD4⁺ Т-лимфоцитов доля пациентов из группы активная ВЭБ-инфекция составила 59% (38 из 64 человек), а при высоком количестве — 5% (4 из 74 человек). Различия в частоте выявления активной ВЭБ-инфекции, когда значения вирусной нагрузки ВЭБ у ВИЧ-инфицированных составляли ≥ 29 копий/10⁵ клеток, были статистически значимыми (р < 0,001). Рассчитанный вероятный риск активной ВЭБ-инфекции у ВИЧ-инфицированных при низком количестве CD4⁺ Т-лимфоцитов был в 3,3 раза выше (95% ДИ: 2,4–4,7), чем у пациентов с высоким содержанием CD4⁺ Т-лимфоцитов.

Обсуждение

Клинические наблюдения зарубежных и российских специалистов свидетельствуют о том, что у лиц, живущих с ВИЧ (ЛЖВ), учащаются и продлеваются эпизоды реактивации ВЭБ, что может существенно влиять на показатели заболеваемости и смертности [1, 21]. ВЭБ-инфекция может приводить к развитию хронической активной ВЭБ-инфекции, волосатой лейкоплакии, лимфоидным интерстициальным пневмонитам и широкому спектру злокачественных новообразований (лимфом) у ЛЖВ. Симптомы развиваются независимо от длительности инфицирования ВИЧ и стадии заболевания, а выраженность и тяжесть симптомов ВЭБ-инфекции коррелируют с уровнем СD4⁺ Т-лимфоцитов [1, 2].

Наше исследование было основано на определении ДНК ВЭБ в лейкоцитах крови ВИЧ(+) и ВИЧ(–) взрослых. По данным литературы у взрослых доноров крови частота выявления ДНК ВЭБ в МНПК варьировала от 5,1% [42] до 72,0% [25], а у ВИЧ-инфицированных лиц от 6,7% [43] до 78,8% [36]. Однако, обобщив данные разных исследований, становится очевидным, что ДНК ВЭБ в когорте ЛЖВ выявляют значительно чаще, чем в среднем в популяции [14, 16, 17, 31, 39, 50].

По результатам собственных исследований ДНК ВЭБ была выявлена у 70,3% ВИЧ-инфицированных пациентов, медиана вирусной нагрузки составила 18 [5; 139] копий/10⁵ клеток. Близкие данные ранее были получены в другой работе итальянскими исследователями, при этом частота обнаружения ДНК ВЭБ составила 73,1%, а медиана вирусной нагрузки — 43 [1–151] копии/10⁵ клеток (указана медиана [межквартильный интервал]) [36]. Полученные результаты подтверждают, что в группе ВИЧ(+) наблюдается значительно более высокая частота выявления и концентрация ДНК ВЭБ в лейкоцитах крови по сравнению с ВИЧ(–) лицами [20, 21, 36].

В свою очередь наши наблюдения, а также ряд зарубежных исследований свидетельствуют о том, что группа ВИЧ(+) является неоднородной по частоте выявления и вирусной нагрузке ВЭБ [20, 23, 36, 43]. Отметим, что сравнительный анализ литературных данных существенно затрудняют используемые исследователями разные методологические стратегии при формировании групп исследования, анализируемые биосубстраты (слюна, плазма крови, МНПК, биоптаты опухолей) и отсутствие стандартизации количественной ПЦР [13, 34, 46, 50]. Именно поэтому мы планировали и проводили наше исследование комплексно с учетом как российской клинической классификации [3], так и классификации ВОЗ по степени выраженности иммунных нарушений на основе количества CD4⁺ Т-лимфоцитов [48], а также применения и приверженности АРТ.

По материалам одной из публикаций российских авторов у ВИЧ-инфицированных пациентов, из которых основная часть случаев (75,5%) приходилась на стадию 4В, при исследовании цельной крови ДНК ВЭБ была обнаружена в 25,6% случаев, а вирусная нагрузка варьировала от 1,0 до 3,3 lg копий/10⁵ клеток [13]. Для сравнения, в нашем исследовании в данной группе пациентов ДНК ВЭБ в лейкоцитах крови выявляли с частотой 84,2%, а разброс концентраций составил от 2 до 362 копии/10⁵ клеток (или 0,2–2,6 lg копий/10⁵ клеток). Выполненный нами сравнительный анализ по клиническим стадиям российской классификации позволил расширить представления о характере ВЭБ-инфекции у ЛЖВ. Как общая закономерность, наиболее высокие показатели определения ДНК ВЭБ были нами выявлены у пациентов с более тяжелым течением ВИЧ-инфекции на 4 стадии заболевания по сравнению с теми, у кого была диагностирована 3 стадия. При этом от стадии 3 к стадии 4В наблюдалось увеличение случаев с клинически значимыми уровнями ДНК ВЭБ в лейкоцитах крови (выше 29 копии/10⁵ клеток или 1,5 lg копий ДНК ВЭБ/10⁵ клеток) — 14,1% против 70,0%, что отражает тенденцию к повышению репликативной активности ВЭБ на фоне прогрессирования ВИЧ-инфекции [20].

Между тем разделение пациентов по клиническим стадиям ВИЧ-инфекции дает общее представление о течении ВЭБ-инфекции у ЛЖВ и, к сожалению, не позволяет исследователю оценить основные факторы, которые могут влиять на частоту обнаружения и вирусную нагрузку ВЭБ при коинфицировании ВИЧ, а именно количество CD4⁺ Т-лимфоцитов и вирусную нагрузку ВИЧ, а также их особенности в зависимости от проводимой АРТ и степени приверженности терапии. Выявленные нами особенности рекомендуется учитывать при планировании дальнейших исследований, посвященных изучению коинфекции ВЭБ и ВИЧ.

Полученный профиль ВИЧ(+) пациентов с обнаруживаемой вирусной нагрузкой ВЭБ соответствует тому, что встречается в большинстве работ зарубежных авторов: ДНК ВЭБ выявляли у пациентов с более высокой вирусной нагрузкой ВИЧ и более низким количеством CD4⁺ Т-лимфоцитов [23, 30, 36, 38, 50]. В некоторых публикациях встречаются противоречащие данные, согласно которым корреляция между вирусной нагрузкой ВЭБ и вирусной нагрузкой ВИЧ или количеством CD4⁺ Т-лимфоцитов не была обнаружена [19, 26, 40]. Совсем исключительным представляется вариант, когда на основе оценки вирусной нагрузки ВЭБ в плазме крови ВИЧ-инфицированных наблюдалась положительная корреляция с количеством CD4⁺ клеток [46].

При естественном течении инфекционного процесса в отсутствие терапии ВИЧ-инфекция приводит к потере иммунологического контроля над ВЭБ-инфекцией (вследствие истощения пула CD4⁺ клеток) и усилению литической репликации ВЭБ [19, 20, 21]. Это объясняет, почему в нашем исследовании группа G1, представленная «наивными» пациентами с тяжелым иммунодефицитом (CD4⁺ Т-лимфоциты < 200 клеток/мкл), по сравнению с остальными отличалась самыми высокими показателями частоты обнаружения ДНК ВЭБ в лейкоцитах крови (86,7%) и вирусной нагрузки ВЭБ (121 [34; 252] копий/10⁵ клеток). Кроме того, в большинстве случаев (70,0%) концентрация вируса характеризовала активную форму ВЭБ-инфекции. В явном контрасте с ними группа «наивных» ВИЧ-инфицированных, у которых содержание СD4⁺ Т-лимфоцитов превышало 500 клеток/мкл, продемонстрировали относительно низкие значения вирусной нагрузки ВЭБ (6 [1; 9] копий/10⁵ клеток), а уровни выше порогового значения были выявлены только у 5,0% пациентов.

Внедрение в 1996 г. в мировую практику антиретровирусной терапии резко изменило естественное течение ВИЧ-инфекции у детей и взрослых [27]. АРТ направлена на медикаментозное подавление репликации ВИЧ и восстановление иммунитета. Однако на течение ВЭБ-инфекции, по данным литературы, АРТ оказывает неоднозначное влияние [23, 36, 44]. По одним сведениям, при эффективной АРТ вирусная нагрузка ВЭБ была ниже, чем в отсутствие терапии или при неэффективной терапии [23, 36]. В других источниках, наоборот, на фоне проводимой АРТ отмечалось повышение вирусной нагрузки ВЭБ в МНПК [26, 40]. Отметим, что в литературе встречаются схожие результаты количественного определения ВЭБ у пациентов при проведении АРТ и без нее [43] или при разной длительности лечения [46].

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что в общем у ВИЧ(+) пациентов, получавших АРТ, относительный риск выявления ДНК ВЭБ при низкой приверженности терапии был значительно (в 1,7 раза) выше по сравнению с теми, у кого сформировалась высокая приверженность. ДНК ВЭБ обнаруживали чаще при определяемом уровне вирусной нагрузки ВИЧ, чем при достижении неопределяемого уровня. Дифференциальный анализ в разных группах ВИЧ(+) пациентов позволил установить, что вирусная нагрузка ВЭБ у лиц с количеством CD4⁺ Т-лимфоцитов > 500 клеток/мкл при высокой приверженности АРТ была существенно ниже, достигая недетектируемого уровня. Однако у лиц с количеством CD4⁺ Т-лимфоцитов <200 клеток/мкл даже при высокой приверженности АРТ ДНК ВЭБ в лейкоцитах крови определяли одинаково часто и у 36,7% из них вирусная нагрузка характеризовала активную ВЭБ-инфекцию. Снижение влияния АРТ на ВЭБ-инфекцию в данном случае, может быть обусловлено выраженным нарушением общего иммунного надзора за ВЭБ-инфекцией в этой группе пациентов [36].

Более того, у пациентов с низкой приверженностью АРТ по сравнению с высоко приверженными или «наивными» пациентами без АРТ мы наблюдали даже более высокую вирусную нагрузку ВЭБ. Ранее были предложены две теории повышения вирусной нагрузки ВЭБ после начала АРТ [35]. Но если подобные наблюдения до сих пор были описаны в литературе только в отношении лиц с тяжелым иммунодефицитом [26, 35, 36], то в нашем исследовании аналогичные, причем статистические значимые различия, были получены и для лиц с количеством CD4⁺ Т-лимфоцитов >500 клеток/мкл.

На основе полученных в настоящем исследовании данных о повышенной репликативной активности ВЭБ у ВИЧ(+) взрослых по сравнению с ВИЧ(–) лицами, к тому же наиболее выраженной у отдельных категорий пациентов, нами впервые был разработан методический подход скрининга активной формы ВЭБ-инфекции. Поскольку в настоящее время в РФ клинический стандарт обследования ВИЧ-инфицированных не включает определение специфических маркеров ВЭБ-инфекции, проведена оценка возможности применения показателей вирусной нагрузки ВИЧ и количества CD4⁺ Т-лимфоцитов в качестве скрининговых для отнесения пациентов в группу риска активной ВЭБ-инфекции. В качестве дифференциального лабораторного критерия латентной и активной формы ВЭБ-инфекции был применен установленный нами пороговый уровень вирусной нагрузки ВЭБ (29 копий/10⁵ клеток или 1,5 lg копий ДНК ВЭБ/10⁵ клеток (методология изложена нами ранее [7]). Количественное ПЦР-исследование ДНК ВЭБ в лейкоцитах крови является особенно актуальным у лиц с иммунодефицитом, поскольку определение только серологических маркеров острой ВЭБ-инфекции у них может быть неэффективным [4, 13].

Как и в ряде других исследований, анализ показал взаимосвязь клинически значимых уровней вирусной нагрузки ВЭБ только с количеством CD4⁺ Т-лимфоцитов [1, 2, 38]. Установлено пороговое значение абсолютного количества CD4⁺ Т-лимфоцитов на уровне 200 клеток/мкл. В диагностическом аспекте данный количественный критерий является приемлемым: чувствительность — 0,90; специфичность — 0,73. В результате предложена диагностическая стратегия, которая может быть рекомендована к применению в лабораторной и клинической практике, а также научно-исследовательской работе для лабораторного скрининга активной ВЭБ-инфекции у ВИЧ-инфицированных пациентов с целью формирования группы риска и дальнейшего углубленного обследования на ВЭБ-ассоциированные заболевания, включая злокачественные новообразования [44]. По данным собственных исследований группу риска составили 30,4% от общего числа ВИЧ(+) пациентов. Отметим, что в группе ВИЧ(–) вирусная нагрузка ВЭБ ни у кого не превышала пороговое значение. Согласно немногочисленным литературным данным, маркеры и клинические симптомы ВЭБ-инфекции (реактивация) выявлялись у 23% лиц с ВИЧ-инфекцией [1].

Подводя итоги, отметим, что выявленная при количественной оценке ВЭБ неоднородность популяции ВИЧ-инфицированных в зависимости от иммунного статуса и приверженности АРТ является методической основой для совершенствования и планирования профилактических и противоэпидемических мероприятий. Кроме того, полученные нами результаты количественной оценки ДНК ВЭБ у ВИЧ-инфицированных в перспективе имеют важное эпидемиологическое значение в свете имеющихся в литературе данных о том, что высокая вирусная нагрузка ВЭБ в клетках периферической крови ассоциирована с увеличением молекулярно-генетического разнообразия ВИЧ [17, 22]. Также следует отметить, что на фоне ВИЧ-инфекции у пациентов наблюдалась смена штаммов, соответствующих генотипам ВЭБ-1 и ВЭБ-2 [15]. Причинно-следственные связи этих взаимодействий ВЭБ и ВИЧ еще предстоит изучить. Несмотря на успехи АРТ, в клиническом аспекте прогнозы специалистов сводятся к тому, что эпидемический потенциал ВИЧ-инфекции на фоне увеличения продолжительности жизни пациентов будет сопровождаться ростом числа случаев выявления ВЭБ-ассоциированных опухолей, что требует продолжения междисциплинарных исследований в контексте данной проблемы [8, 10, 27, 44, 47, 50].

Заключение

Впервые в РФ проведена количественная оценка ВЭБ у ВИЧ-инфицированных пациентов в разрезе разных клинических стадий ВИЧ-инфекции, степени иммунных нарушений, применения и приверженности АРТ.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что в лейкоцитах крови взрослых ВИЧ(+) пациентов частота обнаружения ДНК ВЭБ значительно выше по сравнению с ВИЧ(–) лицами (ОР 1,37 (95% ДИ: 1,09–1,72), р = 0,008). При этом медиана вирусной нагрузки ВЭБ составила соответственно 18 [5; 139] против 2 [1; 3] копий/10⁵ клеток (р < 0,001).

Показано, что группа ВИЧ(+) пациентов является неоднородной по частоте выявления и вирусной нагрузке ВЭБ. Полученные результаты в контексте разных клинических стадий объективно отражают закономерное повышение репликативной активности ВЭБ на фоне прогрессирования ВИЧ-инфекции. При этом показано, что использование только лишь клинической классификации ВИЧ-инфекции имеет ограниченные возможности в контексте изучения особенностей течения ВЭБ+ВИЧ-коинфекции.

Установлено, что «наивные» ВИЧ(+) пациенты с тяжелым иммунодефицитом (CD4⁺ Т-лимфоциты < 200 клеток/мкл) отличаются наиболее высокими показателями частоты обнаружения ДНК ВЭБ в лейкоцитах крови (86,7±6,2%) и вирусной нагрузки ВЭБ (121 [34; 252] копий/10⁵ клеток), к тому же в большинстве случаев (70,0±8,5%) концентрация вируса характеризовала активную форму ВЭБ-инфекции.

Выявлено, что среди «опытных» ВИЧ(+) пациентов, получавших АРТ, относительный риск выявления ДНК ВЭБ при низкой приверженности терапии был значительно выше по сравнению с теми, у кого сформировалась высокая приверженность (ОР 1,69 (95% ДИ: 1,28–2,24), р < 0,05). При достижении неопределяемого уровня вирусной нагрузки ВИЧ в плазме крови (≤ 58 копий/мл) концентрация ДНК ВЭБ была существенно ниже, чем в случаях, когда РНК ВИЧ определялась (1 [0; 8] против 15 [1; 162] копии/10⁵ клеток, р < 0,001).

Продемонстрировано, что обнаружение ДНК ВЭБ в лейкоцитах крови сопряжено с менее благоприятным течением ВИЧ-инфекции, что выражается в более высоком уровне вирусной нагрузки ВИЧ и низком содержании CD4⁺ Т-лимфоцитов по сравнению с теми пациентами, у кого ДНК ВЭБ не выявлялась.

Впервые установлена взаимосвязь между количеством CD4⁺ Т-лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных и вероятностью активной ВЭБ-инфекции. Пороговым значением является 200 клеток/мкл. Применение такого порога позволяет достичь высоких значений чувствительности и специфичности (0,90 и 0,73 соответственно).

Количество CD4⁺ Т-лимфоцитов < 200 клеток/мкл ассоциировано с повышенным в 3,3 раза риском выявления активной ВЭБ-инфекции по сравнению с пациентами, у которых количество CD4⁺ Т-лимфоцитов ≥ 200 клеток/мкл (ОР 3,3 (95% ДИ: 2,4–4,7), р < 0,001).

В целом полученные результаты создают предпосылки для более активного внедрения количественных исследований ДНК ВЭБ в контексте совершенствования ранней диагностики ВЭБ-ассоциированных заболеваний у ВИЧ-инфицированных лиц.

 

¹ НИОТ — нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы, ННИОТ — ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы, ИП — ингибиторы протеазы, ИИ — ингибиторы интегразы.

² URL: https://www.R-project.org

³ URL: http://www.rstudio.com

About the authors

M. I. Popkova

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Author for correspondence.
Email: popmarig@mail.ru

PhD (Medicine), Leading Researcher, Laboratory of Molecular Biology and Biotechnology

Россия, Nizhniy Novgorod

E. N. Filatova

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: popmarig@mail.ru

PhD (Biology), Leading Researcher, Laboratory of Molecular Biology and Biotechnology

Россия, Nizhniy Novgorod

S. V. Minaeva

Privolzhskiy Research Medical University

Email: popmarig@mail.ru

PhD (Мedicine), Associate Professor of the Epidemiology, Microbiology and Evidence-Based Medicine Department

Россия, Nizhniy Novgorod

N. V. Neumoina

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: popmarig@mail.ru

PhD (Medicine), Head Physician of the Infectious Diseases Clinic

Россия, Nizhniy Novgorod

K. M. Perfilova

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: popmarig@mail.ru

PhD (Medicine), Deputy Head Physician of the Infectious Diseases Clinic

Россия, Nizhniy Novgorod

O. V. Utkin

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: popmarig@mail.ru

PhD (Biology), Head of the Laboratory of Molecular Biology and Biotechnology

Россия, Nizhniy Novgorod

References

Supplementary files