Конструирование рекомбинантных штаммов E. coli — продуцентов специфических антигенов Burkholderia pseudomallei

Возможность завоза в Российскую Федерацию экзотических инфекций, в том числе и мелиоидоза, лабораторно подтвержденные случаи которого регулярно регистрируются в неэндемичных регионах мира, обуславливает необходимость разработки и совершенствования методов их ускоренной диагностики. Наличие перекрестной реактивности между филогенетически близкими видами рода Burkholderia затрудняет диагностику мелиоидоза методами экспресс-анализа, предусматривающими применение препаратов на основе моноклональных антител к эпитопам экзополисахарида возбудителя. Исследования, направленные на поиск антигенов-мишеней для создания группо- и видоспецифических иммунодиагностических препаратов нового поколения, позволяющих выявлять Burkholderia pseudomallei, не теряют актуальности. Цель работы заключалась в клонировании полных кодирующих последовательностей дифференцирующих поверхностных биополимеров Burkholderia pseudomallei с последующей оптимизацией схемы очистки рекомбинантных антигенов. В результате сравнительного in silico исследования в качестве целевых биомолекул были выбраны обладающие высокой иммуногенностью протеины внешней мембраны B. pseudomallei Omp38 и OmpA/МotB. В ПЦР были получены необходимые для клонирования специфические ампликоны генов omp38 и ompA/motB, которые лигировали с линейным экспрессирующим вектором RIC-Ready pPAL7. Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E. coli C-Мах5α для накопления рекомбинантных плазмидных молекул, после чего их выделяли и вводили в E. сoli BL21(DE3) для высокоэффективной экспрессии рекомбинантных протеинов. По-видимому, из-за мультимерной организации белков стандартная процедура их очистки из нативного клеточного дезинтеграта оказалась неэффективной. Модификация методики очистки привела к повышению концентрации рекомбинантного белка в элюате. Однако ввиду привнесенных денатурирующих условий на промежуточных этапах очистки произошел гидролиз пептидных связей в молекулах целевых протеинов. Предполагаемым местом разрыва являлась ковалентная связь между аминокислотами пролин и аспарагин. В элюатах содержались N-концевые фрагменты, посредством которых рекомбинантные белки были связаны с неподвижной фазой хроматографической колонки. Аминокислотные последовательности N-концевых участков, соответствующих молекулярным массам элюированных пептидов, были оценены на предмет содержания линейных эпитопов. По результатам in silico анализа на исследуемых полипептидах было установлено присутствие ряда участков, обладающих выраженной антигенной активностью. Сконструированные штаммы E. coli BL21(DE3) BpsOmp39 и E. coli BL21(DE3) BpsOmpА являютя продуцентами поверхностных протеинов Omp38 и ОmpA/МotB возбудителя мелиоидоза, очищенные формы которых могут быть использованы в качестве основы разрабатываемых диагностических тест-систем.