Частота колонизации ротоглотки и резистентность к азолам грибов Candida spp., выделенных у реанимационных пациентов с COVID-19

Полный текст

Введение

Коронавирус SARS-CoV-2 — причина текущей пандемии респираторной инфекции с частым развитием вирусной пневмонии и полиорганных нарушений. По данным Всемирной организации здравоохранения, во всем мире за время пандемии зарегистрировано более 574 млн заражений COVID-19, в том числе более 14 млн смертей. Высокая смертность от COVID-19 связана не только с обширным вирусным повреждением легких, но и присоединением вторичных бактериальных или грибковых инфекции [17]. На сегодняшний день недостаточно информации об оппортунистических грибковых инфекциях, развивающихся у пациентов с COVID-19, и связанным с ними осложнениями [8, 19, 20]. Для пациентов с COVID-19 актуальными являются аспергиллез, инвазивный кандидоз и мукормикоз [12]. Инвазивные грибковые инфекции могут осложнять клиническое течение COVID-19 и связаны со значительным ростом смертности, особенно у тяжелобольных пациентов, поступивших в отделение интенсивной терапии (ОИТ) [10]. Пациенты, госпитализированные с COVID-19, подвержены риску развития внутрибольничных инфекций, включая кандидемию [14].

Многие факторы могут быть связаны с развитием грибковых суперинфекций, включая вирусную иммуносупрессию, повреждение эпителия дыхательных путей, использование антибиотиков, стероидов, антицитокиновых препаратов, искусственную вентиляцию легких и длительное пребывание в отделениях интенсивной терапии и реанимации [10, 19]. Доказано, что колонизация дыхательных путей грибами у пациентов, находящихся на искусственной вентиляции легких, связана с большей длительностью пребывания пациента в отделении реанимации, повышенным риском развития ИВЛ-ассоциированной пневмонии, и более высокой смертностью [11, 13, 15].

В настоящее время серьезной проблемой является рост устойчивости клинических штаммов грибов к антимикотикам, что может быть причиной неэффективности проводимой эмпирической терапии микозов, особенно во внутрибольничных условиях. Согласно данным литературы, механизм формирования резистентности грибов рода Candida к азолам может быть связан с генетическими мутациями самого микроорганизма, а также способностью Candida spp. к образованию биопленок. В механизме устойчивости к антимикотическим препаратам важную роль играет мутантный ген ERG11, который считают маркером резистентности Candida spp. и идентифицируют на практике методами ПЦР и ПЦР-РВ [2].

Целью нашей работы было изучение состава микрофлоры и определение чувствительности к антимикотикам группы азолов (флуконазол и вориконазол) грибов рода Candida, выделенных из ротоглотки у пациентов с тяжелой формой COVID-19.

Материалы и методы

Объектами исследования были пациенты с тяжелой и крайне тяжелой формой COVID-19, получавшие лечение в реанимационном отделении Республиканской клинической инфекционной больнице г. Казани с декабря 2020 по апрель 2021 г. У всех пациентов диагноз COVID-19 был подтвержден положительным результатам ПЦР-теста на РНК SARS-CoV-2 в мазках со слизистой носа и ротоглотки. Все исследования выполнены с информированного согласия испытуемых и в соответствии с этическими нормами Хельсинкской Декларации 2011 г.

На каждого пациента заполнялась индивидуальная регистрационная карта, включающая жалобы, анамнез заболевания, данные объективного осмотра, данные иммунологического и микробиологического исследований. Обследовано 39 пациентов в возрасте от 33 до 94 лет. Средний возраст пациентов составил — 67,4 лет. Пациентов в возрасте до 60 лет было 9 (23,1%), ≥ 60 лет — 30 человек (76,9%). Среди обследованных женщин было 24 (61,5%), мужчин — 25 (38,5%). Большинство пациентов (95%) имели коморбидную патологию: гипертоническая болезнь (68,5%), сахарный диабет (24%), ИБС (22,2%), хроническая сердечная недостаточность (38,9%), ожирение (23,8%), нарушение ритма сердца (20,4%), хроническая ишемия головного мозга (56,1%), варикозная болезнь вен нижних конечностей (5,5%), хроническая болезнь почек (20,4%), цирроз печени (5,5%), ВИЧ-инфекция (5,5%)

По результатам проведения РКТ органов грудной клетки вирусная пневмония с объемом поражения легких КТ-1 диагностирована у (5,6%), КТ-2 — (22,3%), КТ-3 — (33,4%), КТ-4 — у пациентов (30,6%), у 14,5% пациентов диагностирована вирусно-бактериальная пневмония.

В кислородной поддержке нуждались 94,7% пациентов, из них на НИВЛ находились 83,9%, на ИВЛ — 6,8%.

Антибиотики на догоспитальном этапе принимали 23,5% пациентов. В стационаре все пациенты получали антибиотики и глюкокортикостероиды (дексаметазон, преднизолон, метипред). Большинство пациентов (61,9%) получали антицитокиновые препараты (олокизумаб, левилимаб, тоцилизумаб, сарилумаб, барицитиниб), 11,2% пациентам проводилось переливание антиковидной плазмы. Летальный исход наступил у 63,2% пациентов Основными причинами смерти являлись: острый респираторный дистресс синдром, острая сердечно-сосудистая недостаточность, ТЭЛА и синдром полиорганной недостаточности.

Взятие материала осуществляли до назначения антимикотиков стерильными ватными тампонами со слизистой зева. Тампон помещали в транспортную среду и в течение 2 ч доставляли в микологическую лабораторию. Микологическое исследование проводили на базе «Казанского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (КНИИЭМ). Микроскопические грибы идентифицировали общепризнанными микроскопическими, биохимическими методами. В работе использовали селективные хромогенные среды (Bio-Rad, США) и коммерческие тест-системы, основанные на исследовании ауксанограммы, — «Auxacolor 2» (Bio-Rad, США).

Определение чувствительности штаммов Candida spp. к препаратам in vitro выполняли по протоколу CLSI М27-А3 методом определения минимальных ингибирующих концентраций (МИК) с помощью метода разведения в жидкой питательной среде. В исследовании использовали сухую питательную среду RPMI 1640 с 0,2% глюкозы без бикарбоната (Sigma-Aldrich, США) [7]. Субстанции антимикотиков: флуконазол и вориконазол (Hetero Drugs Limited, Индия) растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО). Последующее разведение антимикотиков проводили в RPMI1640 в 96-луночных U-образных планшетах в концентрациях от 1000 до 0,9 мкг/мл.

Для приготовления взвесей Candida spp. культуры выращивали в течение 1–2 суток при 30°С и 37°С на агаре Сабуро. Затем клеточную массу снимали с поверхности агара бактериологической петлей, суспендировали в пробирке с 0,85% стерильным раствором натрия хлорида до густоты рабочих взвесей 0,5 КД по МакФарланду. Готовые взвеси разводили в 0,85% стерильном растворе натрия хлорида с дальнейшим разведением в RPMI 1640 до концентрации 10³ клеток/мл. В каждую лунку вносили 0,1 мл рабочей взвеси. Для каждой культуры ставили следующие контроли: питательной среды (среда без культуры и без препарата), культуры (питательная среда с культурой без препарата) и качества исследования с использованием тест-культуры С. albicans АТСС 10231. Засеянные планшеты инкубировали при 37°С в течение 48 часов. Определение МИК осуществляли визуально. За МИК принимали минимальную концентрацию исследуемых соединений, обеспечивающую полное подавление видимого роста исследуемых штаммов микроорганизмов.

Согласно критериям интерпретации метода M27-A3 МИК чувствительных к флуконазолу штаммов < 8 мкг/мл, умеренно чувствительных — 16–32 мкг/мл, устойчивых > 64 мкг/мл; МИК чувствительных к вориконазолу штаммов — < 1 мкг/мл, умеренно чувствительных — 2 мкг/мл, устойчивых — > 4 мкг/мл [7].

Полученные в процессе исследования результаты различия между показателями микроорганизмов, выделенных из ротоглотки двух возрастных групп, обрабатывали с помощью программной системы STATISTICA for Windows ver. 6.0. Критерием статистической достоверности получаемых данных считали общепринятую в медицине величину р < 0,05.

Результаты

По результатам исследования выявлено, что микробный пейзаж ротоглотки у больных COVID-19 был представлен полимикробной флорой, состоящей из условно-патогенных бактерий и микроскопических грибов. Бактериальная микрофлора преобладала среди выделенных культур микроорганизмов у пациентов всех возрастных групп. Среди грамположительных видов доминировали Enterococcus faecalis (21,8%), Streptococcus pneumoniae (59,9%), Staphylococcus haemolyticus (35,9%), Staphylococcus аureus (15,9%), среди грамотрицательных микробов — Acinetobacter baumannii (15,9%), Serratia marcescens (5,9%), Pseudomonas aeruginosa (5,9%), Klebsiella pneumoniae (15,9%) (рис. 1).

 

Рисунок 1. Видовой состав микробного пейзажа ротоглотки у больных COVID-19

 

Грибы рода Candida выделены у 35 (89,7%) пациентов. Среди кандид доминировали C. albicans, которые обнаружены у 30 (85,7%) пациентов. C. pararapsilosis выделена у 9 (25,7%), C. tropicalis — у 1 (2,8%), С. krusei — у 1 (2,8%), C. kefyr — у 1 (2,8%), C. glabrata — у 1(2,8%) пациента (рис. 2) (p < 0,05).

 

Рисунок 2. Частота выделения различных видов грибов рода Candida из ротоглотки у пациентов с тяжелой и крайне тяжелой формой COVID-19

 

У 11 (20,4%) пациентов выделены ассоциации C. albicans и других видов Candida. Концентрация грибов в материале составила 10²–10⁵ КОЕ/мл, однако у большинства пациентов (81%), грибы выделены из ротоглотки в этиологически значимых количествах (> 10⁴–10⁵ КОЕ/тамп.) (p < 0,05).

Сравнительный анализ микробного биоценоза слизистой ротоглотки показал отличия в частоте встречаемости условно-патогенных видов микроорганизмов, а также в количестве участников микробных ассоциаций. Выявлены микробные ассоциации характерные для больных с тяжелой и крайне-тяжелой формой COVID-19 (рис. 3), где поливидовые грибково-бактериальные ассоциации встречались достоверно чаще и доминировали над поливидовыми бактериальными ассоциациями (p < 0,05). Причем в группе пациентов старше 60 лет ассоциации в отсутствии микроскопических грибов встречались в два раза реже (9,7%), чем в группе < 60 лет (20,0%).

 

Рисунок 3. Частота встречаемости бактериальных и бактериально-грибковых ассоциаций, выделенных от пациентов с тяжелой и крайне тяжелой формой COVID-19 в разных возрастных группах

 

На сегодняшний день существует несколько классов антимикотиков для лечения инфекций, вызванных грибами рода Candida. Полиены, азолы, эхинокандины, аналоги нуклеозидов и аллиламины используются с различной эффективностью в зависимости от клинической формы и локализации грибковой инфекции и чувствительности клинического изолята гриба. Азоловые антимикотики (флуконазол, вориконазол) являются основными препаратами для лечения инвазивного кандидоза.

По результатам оценки чувствительности клинических изолятов грибов к антимикотическим препаратам выявлено, что более 70% штаммов грибов Candida spp., выделенных от пациентов с тяжелой и крайне тяжелой формами COVID-19, были резистентны к флуконазолу и вориконазолу (табл.). Выявлено, что МИК для флуконазола к штаммам C. albicans составила: для 3 изолятов — 1024 мкг/мл, для 7 изолятов — 512 мкг/мл и для 11 изолятов — 128 мкг/мл. Таким образом, 21 (70,0%) штамм C. albicans был резистентен к флуконазолу. К вориконазолу были резистентны 32 (86,6%) штамма C. albicans. Максимальное значение МИК вориконазола в отношении C. albicans составило 256 мкг/мл. Штамм C. glabrata (n = 1) был чувствительным к флуконазолу и вориконазолу. Штаммы C. kefyr (n = 1) и С. krusei (n = 1) были устойчивы к флуконазолу и чувствительны к вориконазолу. Один штамм C. pararapsilosis (11,1%) был чувствительным к флуконазолу и 2 штамма C. pararapsilosis (22,2%) — к вориконазолу. Штамм C. tropicalis (n = 1) был устойчив к вориконазолу и флуконазолу.

 

Таблица. Определение МИК флуконазола и вориконазола в отношении штаммов Candida spp.

Table. Determination of MIC of fluconazole and voriconazole in relation to Candida spp. strains

Вид Candida Candida species

Антимикотик Antimycotic

Количество штаммов Candida чувствительных к антимикотикам при различных показателях МИК The number of Candida strains sensitive to antimycotics at different MICs

МИК (мкг/мл)/MIC (µg/ml)

1

2

4

8

16

32

64

128

256

512

1024

C. albicans (n = 30)

Флуконазол Fluconazole

–

–

–

4

–

5

–

11

–

7

3

Вориконазол Voriconazole

–

5

1

6

–

–

8

–

10

–

–

С. рarapsilosis (n = 9)

Флуконазол Fluconazole

–

–

–

–

–

1

3

4

1

–

–

Вориконазол Voriconazole

–

2

–

3

–

4

–

–

–

–

–

С. tropicalis (n = 1)

Флуконазол Fluconazole

–

–

–

–

–

–

1

–

–

–

–

Вориконазол Voriconazole

–

–

–

–

–

–

1

–

–

–

–

С. krusei (n = 1)

Флуконазол Fluconazole

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

1

Вориконазол Voriconazole

–

–

–

–

–

1

–

–

–

–

–

C. kefyr (n = 1)

Флуконазол Fluconazole

–

–

–

–

–

–

–

–

1

–

–

Вориконазол Voriconazole

–

1

–

–

–

–

–

–

–

–

–

C. glabrata (n = 1)

Флуконазол Fluconazole

–

–

–

–

1

–

–

–

–

–

–

Вориконазол Voriconazole

–

1

–

–

–

–

–

–

–

–

–

 

Обсуждение

В условиях пандемии новой коронавирусной инфекции COVID-19 отмечается рост числа микозов, что может быть связано с иммуносупрессивным действием SARS-CoV-2, широким применением антибиотиков, глюкокортикостероидов (ГКС) и антицитокиновых препаратов у пациентов с тяжелой формой инфекции [9, 18]. Повреждение эпителия, вызванное SARS-CoV-2, также способствует прикреплению грибов Candida к базальной мембране, вызывая в дальнейшем развитие кандидоза слизистых оболочек. Факторы патогенности самого гриба играют ведущую роль в патогенезе кандидоза, поскольку способны противостоять иммунным защитным механизмам хозяина и действию противомикробных препаратов [6]. Преобладающее большинство пациентов с тяжелой формой COVID-19 cоставляют пожилые люди, имеющие коморбидную патологию (ожирение, сахарный диабет и др.), что также повышает риск развития микозов. Неблагоприятной тенденцией в настоящее время является рост устойчивости грибов к антифунгальным препаратам, что является серьезной клинической проблемой [17]. Исследователи акцентируют внимание на росте числа случаев летальных исходов от кандидозов в связи с поздним началом адекватной противогрибковой терапии [16]. Известно, что колонизация слизистых грибами рода Candida является независимым фактором риска развития инвазивного кандидоза у пациентов ОРИТ [3, 4, 5].

В нашем исследовании мы изучили состав микрофлоры ротоглотки у 39 пациентов ОРИТ с тяжелой формой COVID-19, среди которых преобладали пожилые люди (75,9%) с коморбидной патологией (метаболическими заболеваниями, болезнями сердечно-сосудистой системы, почек и печени), получавшие антибиотики, ГКС. Большинство пациентов (61,9%) получили антицитокиновые препараты, вызывающие иммуносупрессию.

По результатам исследования выделены различные условно-патогенные бактерии (E. faecalis, S. pneumoniae, S. аureus, A. baumannii, P. аeruginosa, K. рneumoniae и др.), которые доминировали в микробиоценозе ротоглотки и представляли угрозу в плане развития бактериальных суперинфекций. Подавляющее большинство 89,7% пациентов ОРИТ были колонизированы микроскопическими дрожжевыми грибами рода Candida. C. albicans занимали лидирующее место среди других видов грибов и обнаруживались не только в монокультуре, но и в ассоциации с другими видами Candida spp. Candida non-albicans были представлены следующими видами: C. pararapsilosis, C. tropicalis, С. krusei, C. glabrata, C. kefyr. Исследование показало, что в большинстве случаев грибы высевались в этиологически значимых количествах, что повышает риск развития поверхностного и инвазивного кандидоза у данных пациентов.

В ходе исследования нами было проведено определение чувствительности штаммов Candida spp. к препаратам азолового ряда (флуконазол и вориконазол), которые широко применяются в клинике для эмпирического лечения кандидоза. Ранее отечественными учеными проводились масштабные исследования по изучению чувствительности к антимикотикам клинических штаммов Candida spp. у пациентов с инвазивным кандидозом, и выявлено, что 78,3% штаммов кандид были чувствительны к флуконазолу и 86,9% — к вориконазолу [2]. Исследование, проведенное Ароновой Н.В. и др. (2021) в период пандемии COVID-19, выявило высокую частоту устойчивости C. albicans, выделенных у пациентов с коронавирусной инфекцией, к флуконазолу (80%) [1]. В нашем исследовании к флуконазолу были резистентны 70,0% штаммов C. albicans и 84,6% штаммов Candida non-albicans; к вориконазолу — 80,0% штаммов C. albicans и 69,2% штаммов Candida non-albicans.

Таким образом, по результатам проведенного исследования установлена высокая частота колонизации ротоглотки пациентов с тяжелой формой COVID-19 штаммами грибов рода Candida, устойчивыми к азолам, в связи с чем необходимо тестировать чувствительность выделенных штаммов грибов к антимикотикам. Эмпирическая терапия кандидоза, развившегося у пациентов с COVID-19, препаратами из группы азолов с высокой степенью вероятности будет неэффективной.

Об авторах

Светлана Анатольевна Лисовская

ФБУН Казанский НИИ эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора; ФГБОУ ВО Казанский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения РФ; ФГАОУ ВО Казанский (Приволжский) федеральный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: S_Lisovskaya@mail.ru

к.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории микологии; доцент кафедры микробиологии; ведущий научный сотрудник лаборатории биологически активных терпеноидов

Россия, г. Казань; г. Казань; г. Казань

Гузель Шавхатовна Исаева

ФБУН Казанский НИИ эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора; ФГБОУ ВО Казанский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения РФ

Email: S_Lisovskaya@mail.ru

д.м.н., профессор, зам. директора по инновационному развитию; зав. кафедрой микробиологии

Россия, г. Казань; г. Казань

Ирина Венедиктовна Николаева

ФГБОУ ВО Казанский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения РФ

Email: S_Lisovskaya@mail.ru

д.м.н., профессор, зав. кафедрой инфекционных болезней

Россия, г. Казань

Софья Евгеньевна Гусева

ГАУЗ Республиканская клиническая инфекционная больница имени профессора А.Ф. Агафонова МЗ РТ

Email: S_Lisovskaya@mail.ru

врач-инфекционист

Россия, г. Казань

Лилия Рифкатовна Гайнатуллина

ГАУЗ Республиканская клиническая инфекционная больница имени профессора А.Ф. Агафонова МЗ РТ

Email: S_Lisovskaya@mail.ru

врач-инфекционист, зав. отделением

Россия, г. Казань

Никита Сергеевич Чумарев

ФГБОУ ВО Казанский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения РФ

Email: S_Lisovskaya@mail.ru

ассистент кафедры микробиологии

Россия, г. Казань

Список литературы

Дополнительные файлы