Методические подходы к дифференциальной детекции ВЭБ-1/ВЭБ-2 и ВГЧ-6A/ВГЧ-6B в слюне

Полный текст

Введение

Вирус Эпштейна–Барр (ВЭБ) и вирусы герпеса человека 6А и 6В (ВГЧ-6А и ВГЧ-6В) убиквитарны, инфицируют представителей всех социальных групп, начиная с раннего детского возраста. Они характеризуются выраженной лимфотропностью, способностью к хромосомной интеграции генома, модуляции иммунного ответа организма хозяина, онкогенным потенциалом. ВЭБ общеизвестен как самый частый возбудитель инфекционного мононуклеоза (ИМ) (76,6% случаев) [4], ВГЧ-6В является этиологическим агентом внезапной экзантемы, реже ИМ, в то время как специфическая форма ВГЧ-6А- инфекции еще не определена [10]. Спектр ВЭБ- и ВГЧ-6А/В-ассоциированных заболеваний у детей и взрослых постоянно расширяется и уточняется. Специфические средства их лечения и профилактики до настоящего времени не разработаны.

ВЭБ характеризуется генетической гетерогенностью. Первой и общепринятой классификацией генетического разнообразия ВЭБ является деление на два основных типа — ВЭБ-1 и ВЭБ-2 [20]. Патогенетическая роль каждого из них до конца не изучена, доказательств о связи генотипов с развитием различных заболеваний недостаточно. ВГЧ-6А и ВГЧ-6В были официально ратифицированы в 2012 г. Международным комитетом по таксономии вирусов (ICTV) как два разных вида, заменив ВГЧ-6 [13]. Обобщающее название «ВГЧ-6» или «ВГЧ-6А/В» встречается в исследованиях, не предусматривающих видовую дифференциацию [21]. Эксперты призывают ученых и врачей четко различать ВГЧ-6А и ВГЧ-6В для их клинической и эпидемиологической стратификации [13].

Существующие серологические методы не позволяют раздельно определять ВГЧ-6А, ВГЧ-6В и основные типы ВЭБ. Для их дифференциальной детекции применяют методы, основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР), при этом основная часть исследований реализована с помощью «гнездовой» ПЦР [12, 42]. Зарегистрированных тест-систем для типирования ВЭБ-1/ВЭБ-2 и ВГЧ-6А/ВГЧ-6В в России нет, что ограничивает возможности их применения в клинической практике.

В публикациях отечественных авторов дифференциальная детекция ВГЧ-6А/ВГЧ-6В и основных типов ВЭБ носит эпизодический и противоречивый характер [6, 8, 12]. Объектами исследования преимущественно являются плазма и лейкоциты периферической крови, значительно реже используются соскобы или смывы из ротоглотки. В то же время в зарубежных публикациях показана принципиальная возможность исследования с этой целью слюны. При этом только единичные работы посвящены одновременной дифференциальной детекции ВЭБ-1/ВЭБ-2 и ВГЧ-6А/ВГЧ-6В [27].

Слюна — основной фактор передачи и распространения ВЭБ- и ВГЧ-6А/В-инфекции. Исследование слюны представляет собой доступный, недорогой и неинвазивный способ обнаружения вирусной ДНК [16, 31, 40]. Известно, что разные штаммы одного и того же вируса доминируют в разных биосубстратах (лейкоциты крови, плазма, слюна, опухолевые ткани), могут мигрировать между ними в ходе жизненного цикла или замещаться на новые в результате повторного инфицирования [28, 39, 40]. В целом характеристика генетических особенностей циркулирующих вирусов лежит в основе изучения патогенеза, целевой разработки методов лабораторной диагностики, вакцин, средств специфической терапии, а также совершенствования системы эпидемиологического надзора за инфекциями.

Целью данной работы явилось совершенствование методической базы для дифференциальной детекции ВГЧ-6А/ВГЧ-6B и основных типов ВЭБ в слюне.

Материалы и методы

Обследованию подлежали дети в возрасте 1–17 лет (медиана 6 [3; 10] лет), госпитализированные в ГБУЗ НО «Детская инфекционная больница № 8 г. Нижнего Новгорода» с клиническим диагнозом «Острый инфекционный мононуклеоз» (ОИМ) (n = 22). Группа сравнения сформирована из клинически здоровых детей сопоставимого пола и возраста (n = 26), проходивших диспансеризацию в ООО «Тонус Кроха и семейная стоматология» (г. Нижний Новгород). Взрослые условно здоровые доноры были привлечены для отработки методов и динамического наблюдения выделения вирусов со слюной (n = 9).

Материалом для исследования послужила нестимулированная смешанная слюна (далее — слюна). Образцы собирали однократно и в динамике. Однократный забор материала проводили: 1) у пациентов с ОИМ в первые 3–10 дней от начала клинических проявлений; 2) у здоровых волонтеров в день обследования. Для исследования динамики выделения ВЭБ и ВГЧ-6А/В со слюной у шести клинически здоровых вирусоносителей (5 взрослых 25–40 лет и 1 ребенок 3 лет) материал собирали ежедневно в течение 14 дней.

Информированное согласие родителей или опекунов на проведение исследовательской работы в соответствии с положениями Хельсинкской декларации (2013) было получено лечащими врачами медицинских организаций.

Сбор материала. Сбор материала проводили утром после сна натощак до проведения гигиенических процедур полости рта. Применяли традиционную методику накопления слюны в ротовой полости и сплевывания ее в контейнер для сбора биоматериала. Использовали пластиковые одноразовые емкости с крышкой. Образцы слюны доставляли в лабораторию в течение 2 часов, аликвотировали в микропробирки объемом 1,5 мл по 100 мкл для реализации способа 1, 300 мкл для реализации способа 2, дополнительно по 500 и 1000 мкл для отработки способа 2. Пробы хранили при –80°С до момента исследования. Допускалось только однократное замораживание–оттаивание биоматериала.

Пробоподготовка. Способ 1. Предварительная обработка проб слюны не требуется [3].

Способ 2. Пробы цельной слюны в объеме 300 мкл предварительно обрабатывали путем центрифугирования при 13 000 об/мин в течение 5 мин. На этапе отработки метода на биоматериале взрослых здоровых волонтеров таким же образом обрабатывали пробы по 500 мкл и 1000 мкл. Полученную надосадочную жидкость удаляли (на этапе отработки метода ее использовали для ПЦР-анализа). К осадку добавляли до 100 мкл деионизированной воды I типа и тщательно ресуспендировали. Полученную суспензию осадка использовали для выделения нуклеиновых кислот.

Выделение ДНК. Экстракцию тотальной ДНК проводили с помощью комплекта реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия).

Способ 1. При работе с цельной слюной и надосадочной жидкостью точно следовали инструкции производителя. Для выделения вирусной ДНК использовали 100 мкл пробы.

Способ 2. Материалом для выделения нуклеиновых кислот послужили 100 мкл предварительно подготовленной суспензии осадка слюны. В ходе выделения проводили дополнительный этап: смесь осадка слюны и лизирующего раствора после прогревания (65°С, 5 мин) центрифугировали при 13 000 об/мин в течение 5 мин. Полученный супернатант полностью отбирали и переносили в чистую пробирку объемом 1,5 мл, сразу добавляли к нему раствор для преципитации, продолжая процедуру выделения согласно инструкции.

Концентрацию и чистоту выделенной тотальной ДНК измеряли с помощью спектрофотометра BioPhotometer Plus (Eppendorf, Германия).

Количественное определение ДНК ВЭБ и ДНК ВГЧ-6А/В. Выявление и количественное определение ДНК вирусов выполняли с помощью ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) с применением коммерческих наборов «АмплиСенс^® EBV-cкрин/монитор-FL» и «АмплиСенс^® HHV6- cкрин-титр-FL» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия) на амплификаторе Rotor-Gene Q 5plex HRM (Qiagen, Германия). Лабораторный протокол для ПЦР-РВ соблюдался согласно инструкции производителя. Результаты выражали в количественном формате — в количестве копий ДНК на мл образца цельной слюны, а при сравнительном анализе двух способов пробоподготовки — в копиях ДНК в пробе.

Дифференциальная детекция ВЭБ-1/ВЭБ-2 и ВГЧ-6А/ВГЧ-6В. Для раздельной детекции основных типов ВЭБ (ВЭБ-1 и ВЭБ-2) применен модифицированный нами вариант описанной ранее двухраундовой «гнездовой» ПЦР [42]. ПЦР проводили в один раунд в разных пробирках с использованием специфических пар праймеров, ранее использовавшихся для второго раунда: Ap1 (5′-TCT TGA TAG GGA TCC GCT AGG ATA-3′) и Ap2 (5′-ACC GTG GTT CTG GAC TAT CTG GAT C-3′), амплифицирующих фрагмент 497 п.н. (англоязычная аббревиатура — bp), и Bp1 (5′-CAT GGT AGC CTT AGG ACA TA-3′) и Bp2 (5′-AGA CTT AGT TGA TGC CCT AG-3′), амплифицирующих фрагмент 150 п.н., которые детектируют ВЭБ-1 и ВЭБ-2 соответственно [42].

Для раздельной детекции ВГЧ-6А и ВГЧ-6В применен метод, описанный в статье S. Reddy и P. Manna [41]. Одностадийный вариант ПЦР проводили в одной пробирке, используя праймеры, специфичные к немедленно раннему гену (IE) вируса: forward (CTC ATA AGG TGC TGA GTG ATC AGT T) и reverse (CCT CAG TGA CAG ATC TGG GC) [41]. В данном случае используется одна пара праймеров, которые в реакции амплификации дают два разных по размеру фрагмента — 206 п.н. и 431 п.н., соответствующих ВГЧ-6А и ВГЧ-6В.

Дифференциальный ПЦР-анализ проводили в отдельных пробирках (для ВЭБ-1, ВЭБ-2 и ВГЧ-6А/ВГЧ-6В). Состав реакционной смеси общим объемом 25 мкл включал следующие реагенты: праймеры (5 пкМ в реакцию) (ДНК-синтез, Россия); 5-кратный Taq Red буфер 12,5 мМ Mg²⁺ (Евроген, Россия); 5 е.а. HS Taq ДНК-полимеразы (Евроген, Россия); смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (до конечной концентрации 0,1 мМ) (Евроген, Россия); деионизированную воду I типа (Milli-Q Integral 3, Франция). В качестве матрицы использовали выделенную ДНК в объеме 5 мкл на реакцию. В данном исследовании для дифференциальной детекции ВЭБ-1/ВЭБ-2 и ВГЧ-6А/ВГЧ-6В нами применялся оптимизированный единый лабораторный протокол приготовления реакционной смеси и температурного профиля ПЦР-анализа. Условия для проведения амплификации в работе не приведены, так как оптимизированный вариант является объектом патентной защиты. Амплификацию специфичных фрагментов проводили на амплификаторе MaxyGene Gradient (Axygen, США).

В качестве контрольных материалов при дифференциальной ПЦР использованы положительный контроль (К+) — ДНК ВЭБ-1, ДНК ВЭБ-2, ДНК ВГЧ-6В, полученная нами в предыдущих исследованиях из лейкоцитов периферической крови пациентов с ОИМ ВЭБ- или ВГЧ6-этиологии, а также отрицательный контроль (К–) — деионизированная вода I типа.

Продукты ПЦР-амплификации анализировали с помощью электрофореза в 1,8% агарозном геле, содержащем бромид этидия (0,02% по объему). В качестве стандарта для определения длины двуцепочечных молекул ДНК в интервале 100–1500 п.н. использовали маркер длин ДНК (М) 100+ bp DNA Ladder (Евроген, Россия). Результаты детектировали на трансиллюминаторе InGenius 3 с использованием программного обеспечения GeneSys (Syngene, Великобритания). Полученные данные выражали в качественном формате — положительный или отрицательный.

Статистическая обработка данных проводилась с использованием языка программирования R версии 4.0.0 (The R Foundation for Statistical Computing, Inc) ¹ и среды RStudio версия 1.4.1106 (RStudio, PBC) ². Принадлежность выборок к нормальному распределению определяли с помощью критерия Шапиро–Уилка и графиков квантилей. Для попарного сравнения независимых выборок использован критерий Манна–Уитни и коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Для поиска различий способов 1 и 2 использовали тест Уилкоксона для зависимых выборок. Рассчитанные значения р корректировали с применением поправки Холма–Бонферрони для множественных сравнений. Различия считали статистически значимыми при скорректированном р < 0,05. Полученные концентрации вирусной ДНК представляли в виде Me [Q1; Q3] (где Ме — медиана, Q1, Q3 — первый и третий квартили).

Результаты

На первом этапе исследования нами проведено тестирование проб вирусной ДНК, выделенной из цельной слюны без предварительной пробоподготовки (способ 1).

Количественное определение ДНК ВЭБ и ДНК ВГЧ-6А/В. Все образцы цельной слюны были исследованы на наличие ДНК ВЭБ и ДНК ВГЧ-6А/В методом количественной ПЦР-РВ. Среди детей с ОИМ ДНК ВЭБ обнаружена в 95% случаев (21/22), а ее концентрация составляла 730 455 [118 994; 5 053 700] копий/мл. Только у одного ребенка в слюне ДНК ВЭБ не детектировалась, при этом выявлялась ДНК ВГЧ-6А/В в концентрации 4866 копий/мл. В целом ДНК ВГЧ-6А/В обнаружена у 82% (18/22) обследованных пациентов при значениях концентрации ДНК вируса 15 [0; 5680] копий/мл (только у троих детей она была выше третьего квартиля).

В группе здоровых детей положительными на ДНК ВЭБ были 50% (13/26) проб слюны, ДНК ВГЧ-6А/В — 81% (21/26). При этом концентрация ДНК ВЭБ была значительно ниже, чем в группе ОИМ, — 447 [85; 2925] копий/мл (р < 0,001). Следует отметить, что на фоне отсутствия клинических симптомов у троих детей уровни ДНК ВЭБ отличались наиболее высокими значениями в данной группе обследованных (143 972–828 020 копий/мл) и были сопоставимы с показателями пациентов с ОИМ. Концентрация ДНК ВГЧ-6А/В у здоровых детей составила 27 800 [3742; 53 437] копий/мл, что статистически значимо превысило ее значение в группе детей с ОИМ (р = 0,009). При этом результаты измерения тотальной ДНК в группах сравнения не различались (р = 0,359).

Микст-инфекция (ВЭБ+ВГЧ-6А/В) по результатам исследования слюны в группе детей с ОИМ выявлялась у 82% (18/22), а в группе здоровых детей — у 46% (12/26) обследованных.

Дифференциальная детекция ВЭБ-1/ВЭБ-2. На этапе генотипирования ВЭБ дифференциальная детекция ВЭБ-1 и ВЭБ-2 проводилась не в формате двухраундовой «гнездовой» ПЦР, описанной в статье [42], а в оптимизированном нами однораундовом варианте, который ранее применялся для дифференциальной детекции ВЭБ-1 и ВЭБ-2 в лейкоцитах периферической крови и отличался проведением амплификации в один раунд с использованием праймеров, приведенных в разделе «Материалы и методы» (исходно использовались во втором раунде ПЦР). ПЦР-анализ выполнялся для каждой пробы в двух отдельных пробирках и позволил выявлять ВЭБ-1 (497 п.н.) и ВЭБ-2 (150 п.н.) (рис. 1).

 

Рисунок 1. Результаты оптимизированной однораундовой ПЦР для дифференциальной детекции ВЭБ-1 и ВЭБ-2 в пробах цельной слюны пациентов с острым ВЭБ-инфекционным мононуклеозом

 

В ходе тестирования проб цельной слюны детей с ОИМ был выявлен только ВЭБ-1. Установлено, что у здоровых вирусоносителей в слюне также доминировал ВЭБ-1. При типировании ВЭБ в однораундовой ПЦР был получен отрицательный результат в одной ВЭБ-положительной пробе по результатам ПЦР-РВ.

Раздельная детекция ВГЧ-6А/ВГЧ-6В. Определение ВГЧ-6А и ВГЧ-6В проводилось в ходе однораундовой ПЦР в одной пробирке [41]. При обследовании пациентов с ОИМ в цельной слюне выявлялся только ВГЧ-6В. Дискордантность результатов увеличилась: 4 ВГЧ-6А/В- позитивные пробы (по результатам ПЦР-РВ) прошли как отрицательные. В группе здоровых детей также единственным выявленным видом стал ВГЧ-6В. При исследовании материала в данной группе расхождения результатов не наблюдалось.

Проанализировав ситуацию с дискордантными результатами, мы установили, что в одном случае концентрация ДНК ВГЧ-6А/В составляла 5,8 копий в пробе, а в остальных количество вирусной ДНК было ≤ 1 копии в пробе. Следует отметить, что среди других пациентов и в группе здоровых детей при этих же концентрациях регистрировались и положительные результаты.

На следующем этапе для оптимизации дифференциальной детекции ВЭБ-1/ВЭБ-2 и ВГЧ-6А/ВГЧ-6В работа проводилась по двум направлениям: а) обогащение матрицы для ПЦР-анализа на основе оптимизации этапа пробоподготовки слюны; б) проведение второго раунда ПЦР с теми же праймерами, которые использовались в однораундовой ПЦР (реамплификация).

Оптимизация способа пробоподготовки слюны. На основе исследования слюны взрослых здоровых волонтеров выполнен сравнительный анализ трех ее фракций: цельная слюна без предварительной обработки (100 мкл), осадок и надосадочная жидкость, полученные из разных объемов того же образца слюны (300, 500 и 1000 мкл) после пробоподготовки путем центрифугирования при 13 000 об/мин в течение 5 минут. Этот же режим центрифугирования дополнительно применялся для последующего выделения вирусной ДНК из осадка слюны на этапе между лизированием проб и преципитацией.

На рис. 2 показано, что в образце одного и того же донора вирусная ДНК в пробах надосадочной жидкости не выявлялась ни при количественном, ни при качественном однораундовом варианте ПЦР-анализа. Отметим, что при отработке метода в отдельных случаях, когда концентрация ДНК ВЭБ в цельной слюне превышала 1000 копий в пробе, в надосадочной жидкости выявлялась вирусная ДНК в количестве 1–2 копии в пробе.

 

Рисунок 2. Сравнение результатов определения ВЭБ-1 и ВГЧ-6В во фракциях слюны, полученных из разных объемов образца одного донора

Примечание. Цельная слюна — проба S₀ (100 мкл); осадок слюны — пробы S₁ (300 мкл), S₂ (500 мкл), S₃ (1000 мкл); надосадочная жидкость — пробы S₁*(300 мкл), S₂*(500 мкл), S₃*(1000 мкл).

 

В осадке слюны, наоборот, во всех случаях наблюдалось повышение количества копий вирусной ДНК по сравнению с цельной слюной, что также выражалось в улучшении визуализации ПЦР-фрагментов на электрофореграмме. При этом значения концентрации вирусной ДНК в осадке слюны увеличивались непропорционально объему использованного для анализа образца цельной слюны. Количество копий вирусной ДНК в пробах осадка, полученных из 1000 мкл слюны, было меньше, чем количество копий, полученных из 300 мкл. В процессе отработки метода было установлено, что объем образца более 300 мкл значительно изменял качественные характеристики большинства проб осадка слюны. В этом случае отмечалось снижение специфичности и воспроизводимости выявления вирусной ДНК в триплетах на этапе дифференциального ПЦР-анализа (появление шмеров на электрофореграммах и отсутствие специфических фрагментов в повторах).

На основе полученных результатов в ходе дальнейших исследований нами применялся оптимизированный методический подход, основанный на ПЦР-анализе вирусной ДНК, выделенной модифицированным способом из осадка слюны, полученного путем центрифугирования 300 мкл образца (способ 2).

Результаты сравнения способа 1 и способа 2. Способ 2 был применен к тому же набору образцов слюны детей, что и способ 1. При попарном сравнении результатов количественной ПЦР-РВ, как суммарно среди всех обследованных, так и отдельно по группам детей с ОИМ и без клинических признаков данного заболевания, после применения способа 2 по сравнению со способом 1 в пробах получено статистически значимое повышение концентрации ДНК ВЭБ (р < 0,001; р < 0,001; p = 0,012), ДНК ВГЧ-6А/В (р < 0,001; р = 0,021; р < 0,001) и тотальной ДНК (р < 0,001 для всех вариантов межгруппового сравнения). Корреляция между концентрацией вирусной и тотальной ДНК не установлена.

Способ 2 дополнительно позволил выявить ДНК ВЭБ в пяти ранее отрицательных образцах, принадлежащих условно здоровым детям. Аналогичные изменения наблюдались и для ДНК ВГЧ-6А/В у двух пациентов с ОИМ и одного здорового ребенка. Как следствие, в группе пациентов с ОИМ повысилась частота обнаружения ДНК ВГЧ-6А/В с 82 до 91% (20/22), ВЭБ+ВГЧ-6А/В с 81 до 86% (19/22). Среди условно здоровых детей доля ВЭБ-позитивных лиц увеличилась с 50 до 69% (18/26), ВГЧ-6А/В-позитивных индивидов с 81 до 85% (22/26), а сочетанные формы инфицирования (ВЭБ+ВГЧ-6А/В) возросли с 46 до 61,5% (16/26).

По результатам однораундового дифференциального ПЦР-анализа после выполнения процедуры дополнительной пробоподготовки слюны ранее дискордантные пробы стали положительными на ВЭБ-1 и ВГЧ-6В. Как общая тенденция отмечалось повышение качества визуализации специфических ПЦР-фрагментов на электрофореграмме по мере увеличения концентрации вирусной ДНК в пробах (рис. 3). На примере детекции ВЭБ-1 показано, что дополнительно выявленные после применения способа 2 ВЭБ-позитивные пробы могут быть дискордантными. Установлено, что в целом подобная картина отмечалась в 5 из 8 аналогичных проб в случае низкого содержания вирусной ДНК (≤ 1 копии в пробе).

 

Рисунок 3. Сравнение результатов детекции ВЭБ-1 и ВГЧ-6В в пробах слюны с разными концентрациями вирусной ДНК до и после применения способа 2

Примечание. Способ 1 — пробы 1, 2, 3, 4; способ 2 — пробы 1*, 2*, 3*, 4*.

 

На рис. 4А две пробы, содержащие ВЭБ-1, с целевыми для нас концентрациями менее 1 копии в пробе представлены в триплетах. Проведен анализ проб под номером 1* (0,6 копий в пробе) и номером 2 (0,4 копии в пробе), представленных ранее на рис. 3. Данные свидетельствуют о низкой сходимости результатов исследований при установленных предельных значениях чувствительности используемых методов. Обнаружение вирусной ДНК в этих образцах во многом может носить случайный характер независимо от применения способа 1 или способа 2.

 

Рисунок 4. Результаты детекции ВЭБ-1 в пробах с низкой концентрацией вирусной ДНК (≤ 1 копии в пробе)

Примечание. А) детекция в триплетах при концентрации ДНК 0,6 (линии 1, 2, 3) и 0,4 копии в пробе (линии 4, 5, 6); Б) реамплификация при концентрации ДНК 0,6 (линии 1, 2, 3) и 0,4 копии в пробе (линии 4, 5, 6).

 

Реамплификация, когда во втором раунде ПЦР используется матрица и праймеры, фигурирующие в первом раунде ПЦР, в пробах с низким содержанием вирусной ДНК (≤ 1 копии в пробе) позволяет повысить эффективность детекции результатов амплификации с помощью горизонтального электрофореза (рис. 4Б).

Таким образом, дифференциальная детекция ВЭБ-1/ВЭБ-2 и ВГЧ-6А/ВГЧ-6В в однораундовом варианте ПЦР в сочетании со способом 2 возможна в отношении образцов цельной слюны с минимальной концентрацией вирусной ДНК > 33 копий/мл.

Следует отметить, что ни в одном из исследуемых образцов слюны, в том числе после оптимизации, ВЭБ-2 и ВГЧ-6А обнаружены не были.

Исследование динамики выделения ВЭБ и ВГЧ-6А/В со слюной. Проведена динамическая оценка концентрации ДНК ВЭБ и ДНК ВГЧ-6А/В с помощью количественной ПЦР-РВ в серии образцов слюны, которые собирались ежедневно в течение 14 дней. На рис. 5 представлены результаты сравнительного исследования слюны условно здоровых доноров (взрослого и ребенка) с помощью способа 1 и способа 2.

 

Рисунок 5. Сравнение способа 1 и способа 2 в ходе динамического наблюдения за выделением ВЭБ и ВГЧ-6А/В со слюной

Примечание. N4 — взрослый донор, N6 — здоровый ребенок.

 

Независимо от возраста доноров после применения способа 1 в исследованных образцах за весь период наблюдения отмечались ежедневные колебания концентрации вирусной ДНК. При этом наиболее выраженный размах значений наблюдался в отношении ДНК ВЭБ: от недетектируемых уровней до 10²–10³ копий в пробе (или 10⁴–10⁵ копий/мл). В этих же пробах концентрация ДНК ВГЧ-6А/В изменялась только в 4–6 раз и характеризовалась более низким уровнем по сравнению с ВЭБ, бóльшим постоянством значений без резких перепадов и отрицательных результатов. Использование способа 2 позволило повысить концентрацию вирусной ДНК в каждой пробе и исключить период отсутствия детекции ДНК ВЭБ у взрослого донора в 11 и 12 дни наблюдения.

Сравнительный анализ результатов применения способа 2 к исследованию слюны у 6 условно здоровых доноров подтверждает, что профили кривых ежедневного выделения ВЭБ и ВГЧ-6А/В различаются и для каждого участника наблюдения индивидуальны (рис. 6).

 

Рисунок 6. Профиль ежедневного выделения ВЭБ и ВГЧ-6А/В со слюной у здоровых доноров в течение 14 дней наблюдения (применен способ 2)

Примечание. N1, N2, N3, N4, N5 — взрослые доноры, N6 — здоровый ребенок.

 

За период наблюдения пиковые концентрации ДНК ВЭБ достигали у разных доноров значений от 1475 до 54 627 копий в пробе, а концентрации ДНК ВГЧ-6А/В — от 72 до 2401 копий в пробе. В то время как у некоторых участников (N2, N3, N5) периоды непрерывного выделения ВЭБ сменялись периодами отсутствия его детекции в слюне, у других (N1, N4, N6) отмечалось обнаруживаемое выделение вируса в течение всего времени наблюдения. Результаты исследования свидетельствуют о том, что в зависимости от дня, на который приходился сбор биоматериала, участники N2, N3 и N5 могли рассматриваться либо как ВЭБ-позитивные лица, выделяющие вирус с разной степенью интенсивности, либо, наоборот, как ВЭБ-негативные индивиды. Для детекции ДНК ВГЧ-6А/В применение способа 2 полностью нивелировало данную проблему.

По результатам дифференциального ПЦР-анализа во всех образцах слюны взрослых волонтеров также были обнаружены только ВЭБ-1 и ВГЧ-6В.

Обсуждение

В настоящее время доказана основная роль воздушно-капельного пути передачи в распространении ВЭБ- и ВГЧ-6А/В-инфекций [19, 22, 34, 37]. При сравнительном анализе различных биосубстратов ротовой полости (цельная слюна, жидкость десневой щели, секрет отдельных слюнных желез, мазки ротовой полости) наибольшая частота обнаружения вирусной ДНК была установлена в цельной слюне [40, 43]. Кроме того, слюна является легкодоступным клиническим материалом, не требующим инвазивных вмешательств, что особенно актуально при обследовании детей. Именно поэтому в нашей работе биоматериалом для исследования послужила цельная слюна.

Обращает на себя внимание тот факт, что, по данным литературы, результаты ПЦР-исследований сильно контрастируют. Так, при ОИМ частота выявления ДНК ВЭБ в слюне у детей составляет у разных авторов от 69% [5] до 100% [11]. Несмотря на то что ИМ — полиэтиологичное заболевание, определение ВГЧ-6А/В в контексте этиологической расшифровки проводилось лишь в единичных работах, а данные о частоте обнаружения вируса варьировали от 31 до 52% случаев [1, 5]. Среди условно здоровых детей ДНК ВЭБ и ВГЧ-6А/В в слюне обнаруживалась, по данным одних авторов, у 28 и 35% обследованных [16], по данным других — у 90 [35] и 66% [13, 14] соответственно. Концентрация вирусной ДНК также значительно варьирует и составляет от < 2 до 9300 копий/мл ДНК ВЭБ в слюне здоровых детей [25, 30].

В числе возможных причин этих различий специалисты чаще всего отмечают популяционные особенности исследуемых групп из разных географических регионов, отсутствие стандартизированных лабораторных протоколов, представление количественных результатов в разных единицах измерения, наличие в слюне ингибиторов, которые мешают амплификации ДНК и обусловливают ложноотрицательные результаты [30, 31]. Еще одним важным аспектом данной проблемы, на который мало обращают внимание, является недостаточность информации об особенностях динамики выделения вируса со слюной. В зарубежных исследованиях сообщается о выраженном стохастическом характере обнаружения ДНК ВЭБ как в течение суток [24], так и ежедневно [17], еженедельно [33], ежемесячно [29]. В то время как одни авторы демонстрировали 30-кратную разницу между максимальным и минимальным количеством ВЭБ за один день [24], другие установили колебания его концентрации до 5 логарифмов в течение более длительного периода наблюдения, вплоть до перемежающихся отрицательных результатов детекции [23]. Мониторинг вирусной нагрузки ВГЧ-6А/В в слюне проводился преимущественно в проспективных исследованиях, посвященных изучению времени первичного инфицирования детей [22, 33, 34], реже при обследовании здоровых вирусоносителей [36]. Как правило, выделение ВГЧ-6А/В отличалось непрерывным характером и относительно низкой вирусной нагрузкой [33]. Механизмы, лежащие в основе регуляции выделения ВЭБ и ВГЧ-6А/В со слюной, остаются до конца не изученными [9, 23, 26].

Результаты наших собственных исследований подтверждают, что применение разных методических подходов при тестировании одних и тех же образцов генерирует отличающиеся по своей сути данные. Применение оптимизированного нами способа пробоподготовки слюны позволило повысить концентрацию вирусной и тотальной ДНК в пробах и, как следствие, частоту выявления ДНК ВЭБ на 19%, ДНК ВГЧ-6А/В на 4–9%, сочетанных форм инфекции на 15,5% (по результатам количественной ПЦР-РВ). Достигнутые преимущества отразились в том числе на эффективности обнаружения ДНК вирусов, минимизируя вероятность получения ложноотрицательных результатов при динамическом исследовании образцов слюны в течение 14 дней. На примере исследования образцов слюны вирусоносителей (детей и взрослых) показано, что для ВЭБ характерны резкие колебания вирусной нагрузки вплоть до недетектируемых уровней, а также более высокие пиковые концентрации в сравнении с ВГЧ-6А/В. Таким образом, инфицированность или интенсивность выделения ВЭБ у каждого человека не может быть достоверно определена из исследования единственного образца слюны. Однако в клинической и, в частности, педиатрической практике однократный забор биологического материала является наиболее распространенным диагностическим подходом. В то время как механизмы регуляции выделения ВЭБ со слюной являются отдельным направлением зарубежных исследований [23, 26], для ВГЧ-6А/В этот вопрос в литературе не освещен. Мы полагаем, что более постоянный и равномерный характер обнаружения ВГЧ-6А/В у здоровых волонтеров может быть следствием латенции вируса в эпителиальных клетках слюнных желез и/или ротоглотки в уникальной для него хромосомно-интегрированной форме.

Полученные нами данные о частоте обнаружения вирусной ДНК свидетельствуют о высокой доле здоровых вирусоносителей ВЭБ и ВГЧ-6А/В среди детей — жителей Нижегородского региона (69 и 85% соответственно). В более раннем исследовании нижегородских ученых распространенность ВЭБ составляла 52% [2], что согласуется с нашими данными (50%), полученными с помощью способа 1. Микст-инфекция детектировалась у 61,5% обследованных, в то время как более ранние наблюдения российских исследователей свидетельствуют о том, что у детей разного возраста инфицированность ВЭБ+ВГЧ-6А/В изменяется от 25 до 60% [7].

Установлено, что концентрация ДНК ВЭБ в группе детей с ОИМ достигала высоких значений — 730 455 [118 994; 5 053 700] копий/мл. В этой же группе концентрация ДНК ВГЧ-6А/В отличалась наименьшими, даже по сравнению с группой здоровых детей, показателями (15 [0; 5680] против 27 800 [3742; 53 437] копий/мл; р = 0,009). Следует отметить, что на этапе дизайна данного исследования был сделан выбор в пользу использования раздельных (ориентированных на конкретный вирус), а не мультиплексных тест-систем для количественной ПЦР. Именно поэтому можно предположить, что выявленные особенности отражают существующие механизмы конкурентного взаимодействия ВЭБ и ВГЧ-6А/В в организме человека при определенных условиях. Подобные наблюдения описаны ранее в публикациях, посвященных исследованиям ВГЧ-6 и ВИЧ [18], а также ВЭБ и вируса саркомы Капоши [38], и требуют дальнейшего изучения.

В России типирование ВЭБ и ВГЧ-6А/В в слюне до настоящего времени не проводилось. По результатам зарубежных исследований у детей и взрослых в слюне доминирующим типом ВЭБ во всем мире является ВЭБ-1 (70–90%) [28, 44]. В современных работах продемонстрирована принципиальная возможность обнаружения в слюне детей ВГЧ-6А и ВГЧ-6В [30, 32, 34, 36]. В основном преобладает ВГЧ-6В (96-100%), а ВГЧ-6А детектируется значительно реже. Однако встречаются публикации, согласно которым ВГЧ-6А выделяется со слюной у большей части детей в возрасте до 4 лет [32]. Открытым остается вопрос, обусловлена ли частота обнаружения преимущественно ВГЧ-6B какими-либо техническими и физиологическими детерминантами или является реальным отражением более активного участия данного вида вируса в развитии инфекционной патологии человека по сравнению с ВГЧ-6А [14].

Оптимизированный в данной работе методический подход позволяет раздельно детектировать ВГЧ-6А, ВГЧ-6В и основные типы ВЭБ по единому лабораторному протоколу, а в сочетании с предварительной пробоподготовкой слюны повышает диагностическую чувствительность ПЦР-анализа, минимизирует долю дискордантных и ложноотрицательных результатов.

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что у обследованных детей Нижегородского региона доминирует ВЭБ-1 и ВГЧ-6В, что согласуется с существующими представлениями об их географическом распределении на прилегающих территориях [8, 12]. ВЭБ-2 и ВГЧ-6А в слюне не были обнаружены ни в одной из исследуемых групп детей, а также у взрослых.

Для клинико-эпидемиологической характеристики ВГЧ-6А, ВГЧ-6В, а также типов ВЭБ-1/ВЭБ-2 требуются дальнейшие более масштабные исследования.

Заключение

На основе метода ПЦР оптимизированы методические подходы для дифференциальной детекции ВЭБ-1/ВЭБ-2 и ВГЧ-6А/ВГЧ-6В в слюне.

Впервые в России проведен раздельный анализ ВГЧ-6А, ВГЧ-6В и основных типов ВЭБ в слюне. Представлены первые результаты 14-дневного динамического мониторинга выделения вирусов со слюной у здоровых вирусоносителей (взрослых и детей). Установлено, что цельная слюна является доступным, неинвазивным клиническим материалом для выделения вирусной ДНК с целью изучения генетического разнообразия ВЭБ и ВГЧ-6А/В. Показано, что определение ДНК ВЭБ в единственном образце слюны не позволяет достоверно оценить инфицированность лиц или интенсивность выделения ВЭБ. ВГЧ-6А/В характеризуется более постоянным и равномерным выделением.

Оптимизация раздельной детекции основных типов ВЭБ, а также видов ВГЧ-6А и ВГЧ-6В основывалась на использовании комплексного подхода, включающего применение однораундового варианта ПЦР вместо двухраундового, а также единого лабораторного протокола исследования для разных вирусов, что существенно упрощает диагностический процесс и делает его экономически целесообразным. Другой аспект оптимизации направлен на концентрирование вирусной ДНК в образцах цельной слюны с целью обогащения матрицы для ПЦР-анализа, что особенно важно при низкой вирусной нагрузке и позволяет повысить чувствительность исследования, а также снизить долю ложноотрицательных результатов.

Среди пациентов с ОИМ и в контрольной группе установлено преобладание ВЭБ-1 и ВГЧ-6В. ВЭБ-2 и ВГЧ-6А не детектировались ни в одном из исследованных образцов слюны.

Описанный в рамках настоящего исследования методический подход может применяться в диагностических, эпидемиологических и научно-исследовательских целях.

¹ https://www.R-project.org

² http://www.rstudio.com

Об авторах

Мария Игоревна Попкова

ФБУН Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора

Автор, ответственный за переписку.
Email: popmarig@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5864-5862
SPIN-код: 4485-2459

к.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии и биотехнологии

Россия, Нижний Новгород

Олег Владимирович Уткин

ФБУН Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора

Email: utkino2004@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7571-525X

к.б.н., зав. лабораторией молекулярной биологии и биотехнологии

Россия, Нижний Новгород

Дарья Алексеевна Брызгалова

ФБУН Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора

Email: moskvinadara7@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-6663-8440
SPIN-код: 5626-3491

младший научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии и биотехнологии

Россия, Нижний Новгород

Анна Олеговна Сенатская

ФБУН Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора

Email: seanna@bk.ru
ORCID iD: 0000-0003-2024-4283
SPIN-код: 6891-2140

младший научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии и биотехнологии

Россия, Нижний Новгород

Евгения Андреевна Соболева

ФГБОУ ВО Приволжский исследовательский медицинский университет Минздрава России

Email: Fullofcarrot@pimunn.ru
ORCID iD: 0000-0003-3591-9618

врач-инфекционист, ассистент кафедры инфекционных болезней

Россия, Нижний Новгород

Николай Александрович Сахарнов

ФБУН Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора

Email: saharnov@nniiem.ru
ORCID iD: 0000-0003-3965-2033
SPIN-код: 8457-3501

научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии и биотехнологии

Россия, Нижний Новгород

Елена Николаевна Филатова

ФБУН Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора

Email: filatova@nniiem.ru
ORCID iD: 0000-0002-6683-7191
SPIN-код: 1986-8147

к.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии и биотехнологии

Россия, Нижний Новгород

Екатерина Александровна Кулова

ООО «Тонус Кроха и семейная стоматология»

Email: dr_kulova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5207-1164
SPIN-код: 4331-6958

к.м.н., врач-инфекционист, аллерголог-иммунолог

Россия, Нижний Новгород

Список литературы

Дополнительные файлы