Impact of Candida spp. metabolites on human skin fibroblasts

Full Text

Введение

Микромицеты рода Candida являются основной причиной внутрибольничных микозов, в том числе инфекций кровотока. Значительный вклад в развитие тяжелых форм оппортунистических кандидозов вносят преимущественно C. albicans и C. glabrata [4, 5, 15]. С. krusei не так часто выделяют из клинического материала, как другие виды кандид, но они также способны вызывать тяжелые инфекции у иммунокомпрометированных лиц [4, 6]. Кроме того, в последние годы наблюдается рост системных микозов, связанных с относительно новым патогеном — C. auris [3, 7, 11, 12]. Инфекция, вызванная C. auris, может представлять глобальную угрозу здоровью населения из-за высокого уровня смертности, достигающей, по некоторым данным, 60% [9].

Эпителиальные клетки человека функционируют как первый барьер, препятствующий инвазии Candida spp. во внутренние ткани хозяина. Для преодоления этого барьера кандиды могут использовать различные механизмы: адгезины, секрецию ферментов, морфологическую трансформацию и др. Известно, что C. albicans синтезируют широкий спектр экзоферментов, в частности аспартилпротеазы и фосфолипазы, которые могут способствовать повреждению слизистых оболочек, кожи человека и инвазии в ткани [2, 14, 15]. Ферменты патогенности других видов кандид менее изучены. Полагают, что C. glabrata в основном используют аспарагиновые протеазы [5], C. krusei — фосфолипазы [6].

Высокая способность кандид колонизировать эпителиальные ткани часто формирует систему устойчивого взаимодействия микроорганизма и здорового человека — кандидоносительство. В то же время способность продуцировать метаболиты, содержащие факторы патогенности, является одним из важных факторов перехода от носительства к инвазивному кандидозу у пациентов со сниженным иммунитетом [15]. Таким образом, оценивая агрессивность фунгальных метаболитов в отношении клеток кожи или слизистых, можно оценить инвазивный потенциал различных видов кандид.

Цель настоящего исследования — характеристика результатов воздействия метаболитов эпидемиологически значимых видов кандид на нормальные фибробласты кожи человека.

Материалы и методы

В работе использовали клинические изоляты С. albicans (штаммы 195, 258, 290, 601), С. auris (штаммы 70, 78, 84, 95), С. krusei (штаммы 489, 583, 780) и С. glabrata (44-1, 294, 584). Продукты секреции кандид (метаболиты) получали после культивирования (37°С, 24 ч) микромицетов в жидкой среде Сабуро (HiMedia, Индия) путем сепарации от клеток при помощи фильтра (Corning, Германия) с диаметром пор 0,2 мкм. В каждом эксперименте использовали метаболиты только одного штамма кандид.

В качестве объекта воздействия метаболитов использовали нормальные (без патологии) фибробласты кожи человека как в виде суспензии изолированных клеток, так и в виде монослоя. Монослой фибробластов получали путем культивирования (48 ч, 37°С, 5% СО₂) клеток в среде DMEM (Панэко, Москва) с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки в пластиковых 12- и 96-луночных планшетах Corning (Германия).

Оценка прямого биоцидного действия метаболитов кандид. Готовили суспензию изолированных фибробластов (3 × 10⁶/мл), предварительно обработанных 0,25% раствором трипсина. К 50 мкл взвеси клеток добавляли 300 мкл метаболитов, в контроле — среду Сабуро. Фибробласты термостатировали (37°С, 1–3 часа), затем отбирали 20 мкл суспензии клеток и окрашивали 0,4% водным раствором трипанового синего. Подсчет жизнеспособных (неокрашенных) клеток проводили на счетчике TC20 Automated Cell Counter (Bio-Rad, США).

Оценка цитопатического действия метаболитов кандид. К монослою фибробластов, выращенных в 12-луночном планшете, добавляли 1 мл метаболитов кандид (в контроле — стерильную среду Сабуро), затем термостатировали (37°С, 24 ч). После инкубации монослой клеток микроскопировали с помощью Leica DM IL (Германия).

Оценка апоптоза и некроза фибробластов. Для определения механизма гибели фибробластов использовали окрашивание клеток по технологии Apoptosis/Necrosis Detection Kit (ab176950, США). Согласно протоколу, в случае некроза мембранный краситель DNA Nuclear Green окрашивает ядерные мембраны поврежденных фибробластов в зеленый цвет; при апоптозе накопление фосфатидилсерина в клетках отмечается флуоресцентым красителем красного цвета. К монослою фибробластов, выращенных в 96-луночном планшете, добавляли метаболиты кандид (200 мкл в одну лунку), инкубировали при 37°С. Контролем служила культура фибробластов в стерильной среде Сабуро. Через 1 и 3 часа от начала инкубации выявляли в монослое наличие клеток, имеющих признаки апоптоза или некроза/позднего апоптоза при помощи флуоресцентного микроскопа (Leica DM IL, Германия).

Все эксперименты ставили в трех повторах. Статистическую обработку результатов проводили с использованием непараметрического критерия Манна–Уитни в программе Statistica 6.0.

Результаты и обсуждение

Через час после добавления метаболитов кандид к суспензии фибробластов в ряде случаев отмечалась гибель клеток, которая усиливалась к трем часам от начала эксперимента (табл.). При этом наблюдалась следующая тенденция: чаще всего агрессивность фунгальных метаболитов в отношении фибробластов была отмечена у штаммов C. glabrata и C. krusei, наименьший биоцидный эффект наблюдали у штаммов C. auris. Так, продукты секреции C. glabrata и C. krusei обладали существенным (p < 0,05) биоцидным действием в отношении фибробластов. Наиболее выражена биоцидность у штамма C. glabrata 44-1: его метаболиты в течение 3 часов увеличивали количество погибших фибробластов в 14,24±9,1 раза (p < 0,05). Метаболиты C. glabrata 294, C. glabrata 584, C. krusei 780 и C. albicans 601 через три часа инкубации вызывали гибель почти половины (42–49%) фибробластов в суспензии, а метаболиты C. auris 70 были способны индуцировать гибель около 13% фибробластов по окончании 3-часового эксперимента (табл.).

 

Таблица. Влияние метаболитов Candida spp. на жизнеспособность дермальных фибробластов человека

Table. Candida spp. metabolites influence on dermal human fibroblasts viability

Штаммы кандид Candida strains	Процент жизнеспособных фибробластов после 1- и 3-часовой инкубации с метаболитами кандид Percentage of viable fibroblasts 1- and 3-hour after incubation with Candida metabolites		Кратность снижения жизнеспособности фибробластов относительно контроля Fold decrease in fibroblast viability compared to control
	1 ч/1 h	3 ч/3 h	1 ч/1 h	3 ч/3 h
Контроль/Control	98,67±0,58	96,67±0,57	–	–
C. albicans 195	96,67±1,53	96,00±2,00	1,02±0,02	1,01±0,02
C. albicans 258	95,33±1,66	93,26±1,71	1,04±0,03	1,06±0,02
C. albicans 290	92,00±1,00	92,00±1,20	1,07±0,01	1,05±0,01
C. albicans 601	87,25±2,36*	41,50±5,25*	1,12±0,01*	2,27±0,26*
C. auris 70	92,75±0,58*	80,00±1,53*	1,05±0,01	1,19±0,02*
C. auris 78	97,82±0,79	96,22±2,03	1,02±0,02	1,04±0,02
C. auris 84	98,00±1,00	97,67±0,58	1,01±0,01	0,98±0,01
C. auris 95	97,33±0,57	96,33±2,08	1,01±0,01	1,01±0,03
C. glabrata 44-1	65,67±1,53*	7,50±5,57*	1,50±0,03*	14,24±9,10*
C. glabrata 294	89,00±6,56*	40,25±11,24*	1,11±0,08*	2,31±0,56*
C. glabrata 584	91,14±4,22*	56,71±7,35*	1,07±0,04	1,78±0,23*
С. krusei 489	93,35±2,33*	87,29±3,13*	1,04±0,03	1,12±0,04*
С. krusei 583	94,00±2,01*	84,67±3,21*	1,05±0,03	1,14±0,05*
С. krusei 780	90,67±4,04*	50,33±6,80*	1,09±0,04	1,94±0,25*

Примечание. * — статистически значимые различия c контролем (p < 0,05).

Note. * — significant differences with control group (p < 0,05).

 

Для последующих экспериментов с монослоем дермальных фибробластов были отобраны штаммы C. glabrata 44-1, C. albicans 601, С. krusei 780 и C. auris 70 как обладающие максимальным биоцидным потенциалом среди представителей вида. Монослой фибробластов инкубировали (37°С) с продуктами метаболизма каждого штамма кандид в течение 1, 3 или 24 часов.

Эксперименты показали, что кратковременное (до 3 часов) воздействие метаболитов всех исследуемых штаммов на культуру фибробластов не меняло ее морфологию. В то же время 24-часовое воздействие метаболитов C. auris 70 приводило к изменению структуры монослоя (рис., А, III обложка). Данный цитопатический эффект проявлялся в том, что фибробласты в значительной мере утрачивали межклеточные связи и отслаивались одиночно или небольшими группами от поверхности планшета; форма клеток существенно менялась.

Суточное воздействие метаболитов C. albicans 601 также способствовало нарушению структуры монослоя, но в меньшей степени: слой фибробластов разрыхлялся, клетки округлялись, однако сцепление с поверхностью планшета сохранялось (рис., А). В то же время инкубация культуры фибробластов с метаболитами С. krusei 780 или C. glabrata 44-1 не приводила к существенным изменениям в структуре монослоя клеток (рис., А). Стоит отметить, что проведение дополнительных экспериментов с другими штаммами C. auris подтвердило ведущие позиции данного вида в способности разрушать межклеточные связи фибробластов в культуре (цитопатический эффект) по сравнению с различными штаммами C. albicans, С. krusei и C. glabrata.

Для исследования динамики и механизмов гибели клеток в монослое после воздействия фунгальных метаболитов использовали окрашивание культуры с помощью технологии Apoptosis/Necrosis Detection Kit (рис., Б, В, III обложка). Было обнаружено, что через 3 часа после обработки слоя дермальных клеток фунгальными метаболитами наблюдалась гибель фибробластов, которая происходила в равной мере как путем апоптоза, так и некроза. При этом продукты секреции разных представителей кандид отличались по способности индуцировать гибель клеток в монослое: наибольший биоцидный эффект в культуре фибробластов проявляли метаболиты штаммов C. krusei, C. glabrata и C. albicans, в меньшей степени — C. auris (рис., Б, В).

Наши эксперименты выявили высокую биологическую активность продуктов секреции исследуемых видов кандид. Метаболиты ряда штаммов C. krusei, C. glabrata, C. albicans и C. auris были способны вызывать гибель фибробластов (биоцидный эффект). Кроме того, метаболиты C. auris и в меньшей степени — C. albicans могли разрушать межклеточные связи в монослое дермальных клеток. Исследование вариантов гибели фибробластов показало, что продукты метаболизма кандид не только способны вызывать деструкцию клеток, ведущую к некрозу, но и обладают более сложным контакт-зависимым механизмом, способным запускать апоптоз. Примечательно, что биоцидная активность была наиболее выражена у метаболитов C. glabrata и C. krusei, а не у наиболее патогенного вида кандид — C. albicans. По-видимому, это связано с тем, что C. albicans, кроме деструктивных ферментов, широко использует дополнительные стратегии и факторы патогенности, позволяющие данному виду до сих пор удерживать лидирующие позиции в списке основных возбудителей оппортунистических микозов [10, 13, 15].

Обнаружение у метаболитов C. auris сильно выраженной способности к расщеплению межклеточных контактов в монослое фибробластов указывало на более развитые инвазивные способности данного вида по сравнению с другими кандидами [1]. При анализе данных по биоцидной активности метаболитов C. auris было установлено, что большинство исследуемых штаммов не оказывали прямого повреждающего (биоцидного) действия на клетки человека. Это согласуется с исследованием J.L. Brown и соавт. [8], где было показано, что C. auris не вызывают воспаление в неповрежденной коже, хотя и способны индуцировать воспалительные реакции при раневых инфекциях и в кровотоке, что подчеркивает опасность этих микроорганизмов в условиях интенсивной терапии.

Заключение

Таким образом, эксперименты показали, что метаболиты кандид могут непосредственно вызывать гибель фибробластов кожи человека, при этом биоцидная активность является штамм-зависимым признаком. Прямая биоцидность в отношении дермальных клеток была наиболее характерна для штаммов C. glabrata и C. krusei, менее выражена у C. albicans и очень слабо — у штаммов C. auris. Длительное воздействие метаболитов кандид на клетки человека приводило к гибели фибробластов как через активацию апоптоза, так и путем некроза. Метаболиты некоторых кандид могли расщеплять монослой фибробластов на фрагменты, при этом не была отмечена корреляция между способностью штамма индуцировать гибель отдельных клеток и способностью к разрушению межклеточных связей в культуре. Наибольший деструктивный эффект в отношении монослоя дермальных клеток показали штаммы C. auris. Возможно, именно это качество C. auris, позволяющее данному виду эффективнее прочих кандид разрушать плотную структуру тканей в организме человека, может служить объяснением их высокой инвазивности.

About the authors

Nadezhda I. Ignatova

Privolzhsky Research Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: n.i.evteeva@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-4570-9342

PhD (Biology), Associate Professor, Department of Epidemiology, Microbiology and Evidence-Based Medicine

Russian Federation, 603005, Nizhny Novgorod, Gagarina pr., 70

M. I. Zaslavskaya

Privolzhsky Research Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: maya.zaslav@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-1895-0699

PhD, MD (Biology), Associate Professor, Professor, Department of Epidemiology, Microbiology and Evidence-Based Medicine

Russian Federation, 603005, Nizhny Novgorod, Gagarina pr., 70

N. A. Alexandrova

Privolzhsky Research Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: natalyuskova@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0003-4845-8056

PhD (Biology), Senior Lecturer, Department of Epidemiology, Microbiology and Evidence-Based Medicine

Russian Federation, 603005, Nizhny Novgorod, Gagarina pr., 70

O. E. Orlova

City Clinical Hospital No. 67 named after L.A. Vorokhobov

Email: o.e.orlova@yandex.ru

PhD (Biology), Head of the Laboratory of Microbiology

Russian Federation, Moscow

V. G. Melnikov

Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology named after G.N. Gabrichevsky of Rospotrebnadzor

Author for correspondence.
Email: goutch@mail.ru

PhD (Medicine), Associate Professor, Leading Researcher

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files