Цитокиновый профиль плазмы иммунной анти-COVID-19 и его связь с исходом заболевания пациентов при лечении иммунной плазмой

Полный текст

Введение

Использование реконвалесцентной плазмы, полученной от пациентов, переболевших COVID-19 (плазмы иммунной анти-COVID-19, англ. Coronavirus disease 2019 convalescent plasma [CCP]), для лечения пациентов с инфекцией, вызванной SARS-CoV-2, имеет неоднозначную оценку. С одной стороны, ее терапевтическое применение рекомендуется для пациентов с COVID-19 средней тяжести и в ранние сроки инфекции [8, 11]. С другой стороны, применение CCP не оказывало существенного влияния на уровень смертности пациентов с COVID-19, особенно требовавших искусственной вентиляции легких [5, 10, 15]. ССР рассматривают как источник нейтрализующих антител к SARS-CoV-2, в то же время роль остальных компонентов иммунного ответа остается малоизученной [7, 9]. Цитокины в составе ССР рассматриваваются как действенные компоненты ССР, оказывающие при переливании иммуномодулирующее действие на пациента и участвующие в процессе выздоровления [6, 9, 14].

Цель исследования — оценить значение цитокинов и баланса цитокинов перелитой ССР для исхода заболевания у пациентов, получавших ее при проведении стационарного лечения COVID-19.

Материалы и методы

Был проведен ретроспективный анализ историй болезни 111 пациентов с COVID-19, получавших стационарное лечение в учреждении здравоохранения (УЗ) «Солигорская центральная районная больница», УЗ «Витебская областная клиническая инфекционная больница», УЗ «Витебский областной клинический специализированный центр», УЗ «Лиозненская центральная районная больница», государственного учреждения (ГУ) «Республиканский научно-практический центр (РНПЦ) пульмонологии и фтизиатрии», ГУ «РНПЦ неврологии и нейрохирургии». Пациенты с COVID-19 были обследованы и получали терапию в соответствии с рекомендациями, утвержденными Министерством здравоохранения Республики Беларусь (приказ № 255 от 06.03.2020 в редакции приказа № 430 от 13.04.2020). Она включала длительное пребывание в прон-позиции 15–24–36 часов подряд, гидратационно-инфузионную терапию, препараты ремдесивира, ингибиторов IL-6 по показаниям; профилактику и лечение тромбозов, коагулопатий и ДВС-синдрома, включая антиагрегантную терапию, антикоагуляционную терапию препаратами низкомолекулярного или нефракционированного гепарина по показаниям, препараты системных глюкокортикоидных гормонов. Пациентам, нуждающимся в респираторной поддержке, проводилась интенсивная терапия острой дыхательной недостаточности. Антибактериальная терапия проводилась строго по показаниям, исключительно для лечения бактериальных осложнений. Плазму иммунную анти-COVID-19 (ССР) получали все пациенты в дозе от 190 до 750 мл (1–3 дозы), заготовленную в ГУ «РНПЦ трансфузиологии и медицинских биотехнологий» (ГУ РНПЦ ТиМБ) и предоставленную пациентам после предварительной консультации с врачом-трансфузиологом ГУ РНПЦ ТиМБ. Сбор и анализ клинических данных пациентов, получавших плазму иммунную, осуществляли во исполнение приказа Министерства здравоохранения Республики Беларусь «Об оказании медицинской помощи пациентам с инфекцией COVID-19» от 05.06.2020 г. № 615.

Материалом исследования также были образцы ССР, приготовленной в ГУ РНПЦ ТиМБ методом автоматического плазмафереза в 2020–2022 гг. на основании приказа Министерства здравоохранения Республики Беларусь «О дополнительных мерах по обеспечению бесперебойной работы субъектов службы крови» от 03.04.2020 г., № 379, и прошедшей патогенредукцию с использованием систем «Терафлекс», «Интерсепт», «Мирасол» на основании инструкций фирм — производителей систем патогенредукции. Получение компонента крови «плазма иммунная анти-COVID-19» (ССР) осуществляли на основании положительных результатов тестирования с целью обнаружения антител к SARS-CoV-2 при отрицательных результатах тестирования на вирус SARS-CoV-2 и отсутствии признаков заболевания не менее 2 недель после перенесенного заболевания. Определение титра антител производили с использованием тест-системы «ichroma™ COVID-19 Ab» (Boditech Med Inc., Корея). Эффективными титрами считали превышающие уровень cut off (≥ 1.1) установленный производителем тест-систем.

В качестве контроля использовали аналогичные образцы плазмы, полученной от доноров крови, не болевших COVID-19, и подвергнутой аналогичной патогенредукции. Забор крови и ее компонентов от доноров крови в количестве 2–4 мл проводили на основании решения Комитета по этике ГУ РНПЦ ТиМБ от 10.04.2020 г. (заседание № 1) и на основании подписанного информированного согласия донора крови.

В контрольных образцах плазмы лиц, не болевших COVID-19, антител в диагностически значимом уровне не выявлено (хотя они и определялись как следствие специфической вакцинации или латентно перенесенного заболевания).

Определение цитокинов в образцах плазмы проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА) в соответствии с инструкциями производителей для IFNγ, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10 (АО «Вектор-Бест», Россия), CXCL10/ IP-10, CCL2/MСP-1 (Cloud-Clone Corp., Китай), TGF-β (BT Lab, Китай), IL-15 (Wuhan Fine Biotech Co., Китай). Исследуемые образцы плазмы лиц-реконвалесцентов и здоровых лиц вносили в лунки микропланшета для определения уровней цитокинов. Для каждого цитокина по результатам ИФА были построены калибровочные кривые на основании данных титрования внутренних стандартов и получены расчетные значения концентрации цитокинов в исследуемых образцах плазмы в соответствии с рекомендациями фирм-производителей.

Статистическая обработка результатов экспериментов проводили с использованием пакета Statistica 10.0. Рассчитаны средние значения и ошибка средних значений вариационных рядов изученных показателей. Данные представлены как M±SD. Для установления различий между двумя исследуемыми группами использовали t-критерий Стьюдента для сравнения независимых выборок, статистический уровень значимости р < 0,05. Сравнение групп пациентов с различным исходом заболевания проводили на основе корреляционного анализа с использованием критерия χ² Пирсона. Дальнейший анализ полученных данных проводили с использованием программного обеспечения MedCalc 22.009 и программного пакета R 4.3.1. С использованием ROC-анализа определялись чувствительность, специфичность, прогностическая ценность положительного и отрицательного результатов анализируемых данных.

Результаты и обсуждение

Анализ когорты пациентов, получавших терапию с использованием ССР, показал, что большинство из них выздоровели (n = 84), а у остальных был зафиксирован смертельный исход (n = 27), связанный с прогрессией COVID-19. Сравнение этих подгрупп пациентов с различным исходом заболевания показал, что они достоверно не различались по возрасту (59,9 и 67,5 лет соответственно), распределению по полу (35/49 и 14/13 мужчин и женщин), индексу массы тела (32,8 и 33,32 соответственно). Сравниваемые подгруппы пациентов характеризовались одинаковыми исходными показателями течения заболевания (длительность амбулаторного этапа лечения, длительность заболевания, показатели поражения легочной ткани, потребность в кислороде. Основное отличие касалось необходимости искусственной вентиляции легких, которая потребовалась 3 (3,57%) пациентам подгруппы выздоровевших пациентов и 10 (37%) пациентам подгруппы умерших (χ² = 22,1; p << 0,001).

Ранее нами и другими авторами [1, 7] были отмечены различия цитокинового профиля ССР и плазмы здоровых лиц, не болевших COVID-19, связанные с увеличением содержания в ССР интерферона-гамма (IFNγ). Bonny T.S. c соавт. [7] также отметили повышение в ССР уровня интерлейкина-10 (IL-10), IL-15, IL-21, макрофагального воспалительного протеина (MIP-1α), а также уменьшение уровня антагониста рецептора IL-1 (IL-1RA), IL-8, IL-16, васкулярного эндотелиального фактора роста А (VEGF-A).

Проведенное нами сравнение выявило некоторые различия в уровнях и балансах цитокинов в ССР, перелитой пациентам с COVID-19 с различным исходом заболевания. Как показано в табл. 1, содержание IL-6 и IFNγ оказалось достоверно выше в сериях ССР, перелитой пациентам, впоследствии умершим. Содержание IL-1-β, IL-8, IL-10, IL-15, TGF-β, IP-10/CXCL10, MCP-1/ССL2 достоверно не различалось в подгруппах пациентов, впоследствие выживших или умерших.

 

Таблица 1. Уровень цитокинов в плазме иммунной анти-COVID-19, использованной для лечения пациентов с различными исходами заболевания

Table 1. Cytokine level in COVID-19 convalescent plasma used for therapy of patients with different disease outcome.

Цитокины Cytokines	Уровень цитокинов (пг/мл) в плазме иммунной анти-СOVID-19, использованной для лечения пациентов Cytokine level (pg/ml) in ССР, used for therapy of patients				p
	выздоровевших recovered		умерших deceased
	n	М±SD	n	M±SD
IL-6	38	3,22±1,67	12	5,23±0,45	0,0002
IFNγ	33	7,40±2,72	16	15,83±9,67	0,00002
IL-10	43	11,39±2,89	13	12,14±2,14	0,3943
IL-15	30	7,34±1,87	11	7,99±2,43	0,3714
TGF-β	43	1,065±0,55	15	0,96±0,45	0,5055
IP-10/CXCL10	40	22,93±6,20	14	23,90±6,38	0,6215
MCP-1/ССL2	24	8,04±2,95	8	8,34±2,09	0,7921
IL-8	43	3,24±1,98	14	3,12±2,07	0,8461
IL-1β	42	9,47±3,81	13	9,26±3,01	0,8536

 

Для цитокинов IL-6 и IFNγ построены графики распределения их содержания в ССР, перелитой пациентам подгрупп выздоровевших или умерших. Как видно из рисунка, для IL-6 четко выделяются два отдельных непересекающихся пика соответствующих низкому содержанию IL-6 (0–4 пг/мл), что характерно для ССР, перелитой пациентам, впоследствии выздоровевшим, и более высокому содержанию IL-6 (4–7 пг/мл), что характерно для ССР, перелитой пациентам, впоследствии умершим. Для IFNγ картина распределения несколько отличается. Уровень IFNγ в ССР, перелитой выздоровевшим пациентам, преимущественно формируют единый пик (2–10 пг/мл). В сериях ССР, перелитой пациентам, впоследствии умершим, наблюдались два пика содержания IFNγ, один из которых совпадает со значениями (2–10 пг/мл), характерными для ССР, перелитой пациентам, впоследствии выздоровевшим. Второй пик содержания IFNγ в ССР (24–32 пг/мл) наблюдался только у пациентов, впоследствии умерших. Такие распределения IL-6 и IFNγ в ССР свидетельствуют о роли цитокинов как прогностических факторов неблагоприятного исхода COVID-19 у пациентов, получавших лечение с использованием ССР.

 

Рисунок. Распределение содержания IL-6 и IFNγ (пг/мл) в плазме иммунной, анти-COVID-19, перелитой пациентам групп выздоровевших (сплошная линия) или умерших (пунктирная линия). Примечание. По оси абсцисс — содержание цитокина в ССР, по оси ординат — частота встречаемости (Density).

Figure. Distribution of the level of IL-6 and IFNγ (pg/ml) in the COVID-19 convalescent plasma (CCP) transfused to patients of the groups recovered (solid line) or deceased (dotted line). Note. On the abscissa axis is the cytokine content in the CCP, on the ordinate axis is the frequency of occurrence (Density).

 

Хорошо известно, что прогрессирование COVID-19 связано с вовлечением цитокинов, особенно при развитии системного воспалительного ответа [3, 4, 6, 13]. Активность и тяжесть заболевания проявляется совместным действием цитокинов с изменением их баланса на разных этапах патологического процесса. Поэтому мы оценили в ССР не только уровни, но и балансы отдельных цитокинов, их возможную связь с исходом заболевания у пациентов, пролеченных ССР. Как нами показано ранее, ССР по сравнению с контрольной плазмой здоровых лиц имеет выраженный дисбаланс цитокинов, связанный с повышением уровня IFNγ, IL-6, IL-8, IL-10 [1]. Как видно из табл. 2, баланс цитокинов первой, второй, третьей волны в ССР, использованной для терапии пациентов с COVID-19, является важным для развития и исхода заболевания [3, 4]. Прежде всего отмечают баланс IL-6/IL-10, повышение которого в крови пациентов связывают с плохим прогнозом заболевания. При этом IL-10 рассматривается как цитокин, снижающий иммуноопосредованное воспаление, а IL-6 ассоциируется с тяжелым течением и летальными осложнениями при заболевании [4]. IL-6 и IFNγ не связаны прямо с вирусной нагрузкой у пациентов с тяжелым течением COVID-19, но отражают системное воспаление в организме пациентов, особенно при развитии острого респираторного дистресс-синдрома. Цитокин-опосредованный эффект благоприятного терапевтического эффекта ССР не связан c уровнем антител к S-антигену SARS-CoV-2 или нормальных антител [6]. Это указывает на самостоятельный иммуномодулирующий эффект цитокинов при переливании ССР пациентам с COVID-19 [6, 12, 14].

 

Таблица 2. Сравнительная характеристика балансов цитокинов в плазме иммунной анти-COVID-19, перелитой выжившим и умершим пациентам

Table 2. Comparison of cytokine ratios in COVID-19 convalescent plasma, transfused to patients with different disease outcome

Баланс цитокинов Cytokine ratio	Значение показателей в ССР, использованной для лечения пациентов Value of cytokine ratio in COVID-19 convalescent plasma, used for therapy of patients				p
	выздоровевших recovered		умерших deceased
	n	М±SD	n	M±SD
IL-6/IL-10	37	0,29±0,12	10	0,4±0,04	0,0058
IL-6/IL-1β	36	0,37±0,14	9	0,52±0,13	0,0075
IL-6/IL-8	37	1,38±0,93	10	2,38±1,14	0,0058
IL-6/IP-10	36	0,14±0,09	10	0,23±0,07	0,0058
IL-6/IL-15	28	0,48±0,3	8	0,79±0,36	0,0181
IFNγ/IL-10	32	0,74±0,27	13	1,26±0,76	0,0014
IFNγ/IL-1β	31	1,05±0,51	13	1,55±0,71	0,0126
IFNγ/IL-8	32	3,45±1,9	14	5,57±4,16	0,0209
IFNγ/IP-10	31	0,34±0,18	14	0,73±0,63	0,0023
IFNγ/TGF-β	32	0,01±0,01	15	0,02±0,02	0,0008
IFNγ/IL-15	25	1,1±0,69	11	2,08±2,15	0,0444
IFNγ/MCP-1	15	1,14±0,69	8	2,44±1,16	0,0029

 

Для пациентов с COVID-19 с различным исходом заболевания мы оценили в использованной для их лечения ССР баланс цитокинов с участием IFNγ и IL-6. IL-6 в когорте всех исследованных образцов ССР и использованных в группе выживших пациентов имел сильную прямую корреляционную связь (r = 0,8 и r = 0,9) с балансами IL-6/IL-10 и IL-6/IP-10, в то время как в группе умерших таковой связи не наблюдалось (r = 0,6 и r = 0,6 соответственно), что может быть связано с повышением уровней IL-6 также в ССР, использованной для пациентов группы выживших. В ССР наблюдалась сильная прямая корреляционна связь уровней IFNγ со значениями всех проанализированных балансов цитокинов (IFNγ/IL-10 (r = 0,9), IFNγ/IP-10 (r = 0,9), IFNγ/TGF-b (r = 0,8), IFNγ/MCP-1 (r = 0,9)). При этом наблюдались различия в значениях баланса цитокинов в ССР, использованной для лечения пациентов групп умерших и выздоровевших. Так, в ССР, использованной для лечения группы выздоровевших, были снижены значения балансов IFNγ/IL-10, IFNγ/MCP-1 по сравнению с ССР, использованной для лечения пациентов группы умерших. В ССР, перелитой пациентам группы выживших, было также снижено значение баланса IFNγ/TGF-β относительно содержания в ССР, перелитой пациентам группы умерших. Полученные данные свидетельствуют о том, что балансовые соотношения цитокинов в ССР наряду с уровнем цитокинов имеют значение для исхода заболевания у пациентов, получавших терапию с использованием ССР. Баланс цитокинов IL-6/IFNγ, характеризующийся высокими значениями в крови пациентов с тяжелым COVID-19, в ССР имел невысокие значения (0,39±0,158, n = 31 для группы выздоровевших и 0,45±0,366, n = 12 для группы умерших пациентов, r = — 0,15; p = 0,38), что связано с забором плазмы по прошествии 2–3 недель после исхода заболевания и общим снижением уровня цитокинов к этому сроку [2, 4].

Выводы

Таким образом, ССР, использованная для лечения пациентов с COVID-19, характеризуется дисбалансом цитокинов, которые способны оказывать влияние на исход заболевания. Неблагоприятный исход заболевания пациентов с COVID-19, получавших терапию с использованием плазмы иммунной анти-COVID-19, ассоциируется с наличием в ССР повышенного содержания IL-6 и IFNγ, повышенными значениями баланса IFNγ/IL-10, IFNγ/IP-10, IFNγ/TGF-β, IFNγ/MCP-1, IL-6/IL-8, IL-6/IL-10, IL-6/IP-10, IL-6/IL-15. Низкий уровень IL-6 и IFNγ, сниженные значения балансов IL-6/IP-10, IL-6/IL-15, IFNγ/MCP-1, IFNγ/IP-10, IFNγ/TGF-β IFNγ/IL-15 были характерны для ССР, которую перелили пациентам, впоследствии выздоровевшим.

Благодарности

Авторы выражают благодарность врачу-трансфузиологу Вагановой Т.В. (ГУ РНПЦ ТиМБ) за консультации пациентов при назначении плазмы иммунной анти-COVID-19.

Об авторах

Михаил Петрович Потапнев

Республиканский научно-практический центр трансфузиологии и медицинских биотехнологий

Автор, ответственный за переписку.
Email: mpotapnev@yandex.by

д.м.н., профессор, зав. отделом клеточных биотехнологий

Белоруссия, Минск

А. В. Максимович

Республиканский научно-практический центр трансфузиологии и медицинских биотехнологий

Email: mpotapnev@yandex.by

младший научный сотрудник лаборатории биологии и генетики стволовых клеток

Белоруссия, Минск

И. А. Дунаев

Республиканский научно-практический центр трансфузиологии и медицинских биотехнологий

Email: mpotapnev@yandex.by

к.м.н., врач-трансфузиолог

Белоруссия, Минск

Л. М. Гущина

Республиканский научно-практический центр трансфузиологии и медицинских биотехнологий

Email: mpotapnev@yandex.by

зам. директора по трансфузиологии

Белоруссия, Минск

Ф. Н. Карпенко

Республиканский научно-практический центр трансфузиологии и медицинских биотехнологий

Email: mpotapnev@yandex.by

к.м.н., директор

Белоруссия, Минск

Список литературы

Дополнительные файлы