Экспрессия генов FOXO1, FOXO3 и BECN1 в лейкоцитах периферической крови при хроническом течении саркоидоза легких

Полный текст

Введение

Транскрипционные факторы семейства Forkhead box O (FOXO) принимают участие в контроле широкого спектра клеточных процессов. Это эволюционно-консервативные белки, являющиеся ключевыми компонентами множества сигнальных путей в клетке. Они принимают участие в активации/ингибировании транскрипции нижестоящих генов-мишеней, играя важную роль в регуляции пролиферации, дифференцировки, апоптоза, роста и старения клеток и других внутриклеточных процессов [3, 14]. Белки FOXO локализуются в ядре клетки (активируют транскрипцию генов-мишеней) и перемещаются в цитоплазму под действие регуляторных механизмов [7, 9]. Их активность регулируется посттрансляционными модификациями, включая фосфорилирование, ацетилирование и убиквитинирование [14]. Показано, что белки FoxO участвуют в поддержании иммунного гомеостаза и регуляции иммунных реакций. Они играют важную роль в развитии и функционировании регуляторных Т-клеток, регуляции развития и созревания T- и B-лимфоцитов, а также других лейкоцитов [12]. Среди белков семейства FoxO, наиболее изучены и широко экспрессируются в различных органах и тканях человека белки FOXO1 и FOXO3 [14]. Показана их значимая роль в регуляции воспалительного ответа. Указанные белки способствуют повышению экспрессии генов провоспалительных цитокинов, Toll-подобных рецепторов [14].

В настоящее время установлено, что транскрипционные факторы FOXO вовлечены в патогенез многих заболеваний, в том числе саркоидоза (болезнь Бенье–Бека–Шаумана). Это системное иммунновоспалительное заболевание неустановленной этиологии, характеризующееся образованием эпителиоидно-клеточных гранулем в различных органах, преимущественно в легких. Результаты эпидемиологических исследований и использование мышиных моделей гранулематозного заболевания свидетельствуют о значимой роли инфекционных агентов (микобактерии, пропионобактерии) в этиологии саркоидоза легких [1, 4]. В работе Чжао и соавт. отмечено, что сигнальный путь FOXO вовлечен в патогенез данного заболевания [15]. По данным литературы, транскрипционные факторы FOXO участвуют в регуляции и дисрегуляции аутофагии [15]. Этот процесс имеет важное значение для поддержании клеточного гомеостаза, посредством удаления из клеток поврежденных органелл, агрегированных белков, внутриклеточных патогенов [2, 6]. Транскрипционные факторы FOXO (в частности, FOXO1 и FOXO3) хорошо известны как важнейшие индукторы аутофагии. Активация FOXO связана с повышением экспрессии генов аутофагии, что также регулируется белком аутофагии BECLIN 1 (Atg6). BECLIN 1 связывается с макромолекулярным комплексом, который активирует аутофагию. По данным литературы, нарушение процесса аутофагии имеет место при саркоидозе [2]. Цель настоящего исследования заключалась в изучении экспрессии генов FOXO1, FOXO3 и BECLN1 в ЛПК крови больных саркоидозом легких с хроническим течением заболевания и у здоровых людей.

Материалы и методы

Обследовано 44 человека (20 больных с хроническим течением саркоидоза легких, II стадия заболевания (средний возраст — 42,11±2,21)) и 24 человека из группы контроля (условно здоровые доноры) (средний возраст — 43,03±1,84). Диагноз саркоидоз легких установлен в соответствии с критериями на основе клинико-рентгенологических и лабораторных изменений. Саркоидоз у всех пациентов (100%) был верифицирован гистологически на основании исследования биоптата. Больные саркоидозом легких со стабильным течением, при отсутствии активности данного заболевания находились без терапии и не получали других видов лечения на момент проведения исследования. От всех пациентов было получено информированное согласие до проведения исследований. Критерии исключения из исследования: наличие сахарного диабета, выраженные нарушения функции внутренних органов, а также перенесенные в последний месяц инфекционные заболевания, курение табака, беременность и лактация, алкогольная зависимость, индекс массы тела ≥ 30 кг/м. Работа была выполнена с соблюдением этических норм согласно критериям Всемирной ассоциации медицинских редакторов (The World Association of Medical Editors — WAME) и одобрено локальным этическим комитетом ГБУ3 «Pеспубликанская больница им. В.А. Баранова» г. Петрозаводска, протокол № 165 от 02.11.2023 г. Пробы периферической крови использовали в качестве материала для исследования.

Из лейкоцитов крови выделяли тотальную РНК, с помощью реагента для выделения РНК PureZol (Bio-Rad). Синтез кДНК осуществляли с помощью набора «MMLV RT kit» (Евроген, Россия). Уровень транскриптов генов FOXO1, FOXO3, BECN1 в ЛПК оценивали c помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ), используя наборы «qPCRmix-HS SYBR» (Евроген, Россия). Гены 18sRNA и RPL19 были выбраны в качестве референсных. Для каждого образца ПЦР-РВ проводили не менее трех раз. Конструирование праймеров осуществляли в программе Beacon Designer 5.0. Нуклеотидная последовательность праймеров представлена в табл.

 

Таблица. Нуклеотидная последовательность праймеров для ПЦР-РВ

Table. Nucleotide sequence of primers for RT-PCR

Ген (№ в NCBI) Gene (No. in NCBI)	Праймер Primer	Последовательность праймера 5'→3' Primer sequence 5'→3'	Источник Source
18sRNA (NR_145819.1)	Прямой Forward	agaaacggctaccacatcca	Pinto et al., 2010
	Обратный Reverse	caccagacttgccctcca
RPL19 (NM_000981.4)	Прямой Forward	aatcgccaatgccaactc	Собственный дизайн Own design
	Обратный Reverse	ccttccgcttacctatgc
FOXO1 (NM_002015.4)	Прямой Forward	aacagccaccactctatcatc	Собственный дизайн Own design
	Обратный Reverse	gcaccaagttcagttacatacc
FOXO3 (NM_001455.4)	Прямой Forward	tgagtgagaggcaatagcatac	Собственный дизайн Own design
	Обратный Reverse	agcacctatacagcaccataac
BECN1 (NM_004849.4)	Прямой Forward	gctgccgttatactgttctgg	Собственный дизайн Own design
	Обратный Reverse	cctcctgtgtcttcaatcttgc

 

Статистическая обработка данных проведена в программе StatGraphics Centurion XVI версия 16.1.11. Достоверность различий уровня транскриптов гена между группами оценивали с помощью непараметрического критерия U Вилкоксона–Манна–Уитни. Различия считали достоверными при p < 0,05

Исследования выполнены на научном оборудовании Центра коллективного пользования Федерального исследовательского центра «Карельский научный центр Российской академии наук».

Результаты и обсуждение

Представителей семейства FOXO объединяет наличие в структуре белков высококонсервативного ДНК-связывающего домена Forkhead (FKH). В его составе есть уникальная вставка из пяти аминокислотных остатков, что делает их более дивергентной группой белков семейства Fox [10]. FoxO являются нижестоящими мишенями сигнального пути фосфоинозитид-3-киназы (PI3K)/Akt и играют важную роль в регуляции клеточного цикла, включая пролиферацию, рост, апоптоз, экспрессию белков-антиоксидантов и белков аутофагии [5]. Согласно результатам исследований, в ЛПК пациентов с хроническим течением саркоидоза легких, без терапии, значимо повышена экспрессия мРНК генов транскрипционных факторов FOXO1 и FOXO3 по сравнению с контролем (p < 0,01 и p < 0,001) (рис.).

 

Рисунок. Уровень транскриптов генов FOXO1, FOXO3 и BECN1 в лейкоцитах периферической крови пациентов c хроническим течением саркоидоза легких (2) и в контрольной группе (1)

Figure. FOXO1, FOXO3 and BECN1 gene expression in peripheral blood leukocytes of patients with chronic pulmonary sarcoidosis (2) and in controls (1)

 

По данным литературы, FOXO3 может действовать на свой собственный промотор, промотор гена FOXO1, а также связываться с промоторами генов аутофагии, индуцируя их экспрессию. При этом отмечается транслокация FOXO3 из цитоплазмы в ядро клетки [5]. Согласно полученным нами данным, в лейкоцитах периферической крови больных саркоидозом легких отмечено достоверное повышение уровня транскриптов гена BECN1 по сравнению с контролем, p = 0,0002 (рис.). По результатам корреляционного анализа выявлена тесная положительная связь между экспрессией генов FOXO1, FOXO3 и BECN1. Коэффициенты ранговой корреляции Спирмена составили 0,69 (FOXO1/BECN1) и 0,61 (FOXO3/BECN1) (p = 0,0002 и p = 0,0016, соответственно). Активация FOXO1/FOXO3, вероятно, связана с усилением экспрессии гена BECN1 (ATG6), который является важным регулятором процессов аутофагии. BECN1 взаимодействует с ATG14L и фосфатидилинозитол-3-фосфат-киназами Vps34 и Vps15, образуя белковый комплекс, который индуцирует образование фосфатидилинозитол-3-фосфата (PI3P), участвуя в мембране зарождающегося фагофора [8, 11].

Таким образом, по результатам исследований, у больных саркоидозом легких II стадии, при хроническом течении заболевания (стабилизация состояния, без терапии), в лейкоцитах периферической крови значимо повышена экспрессия генов транскрипционных факторов FOXO и аутофагии.

Заключение

В настоящее время установлены многочисленные молекулярно-генетические маркеры, которые вносят вклад в развитие саркоидоза легких. Более полное понимание патогенеза данного заболевания, имеет важное значение для разработки более эффективных и безопасных методов лечения.

Об авторах

Ирина Евгеньевна Малышева

Институт биологии — обособленное подразделение ФГБУН Федерального исследовательского центра «Карельский научный центр Российской академии наук»

Автор, ответственный за переписку.
Email: I.E.Malysheva@yandex.ru

к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории генетики

Россия, Петрозаводск

Ольга Викторовна Балан

Институт биологии — обособленное подразделение ФГБУН Федерального исследовательского центра «Карельский научный центр Российской академии наук»

Email: ovbalan@mail.ru

к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории генетики

Россия, Петрозаводск

Элла Леонидовна Тихонович

Республиканская больница им. В.А. Баранова

Email: tikhonovich.ella@mail.ru

к.м.н., зав. отделением респираторной терапии

Россия, Петрозаводск

Список литературы

Дополнительные файлы