Трогоцитоз адаптивными NK-клетками фрагментов мембран B-лимфоцитов при активации хронической ВЭБ-инфекции приводит к экспрессии CD19 на NK

Полный текст

Введение

В последнее десятилетие среди зарубежных публикаций встречаются упоминания о минорной популяции NK-лимфоцитов, экспрессирующих на мембране линейный В-клеточный антиген CD19 [15, 26]. Эту популяцию описывают в периферической крови и костном мозге детей и взрослых [7, 17, 26]. Частота встречаемости CD56+CD19+dim клеток невелика — среди образцов крови взрослых лиц, обследуемых с подозрением на иммунодефицитное состояние, она составляет 1,2% [3] и увеличивается до 4,4% среди образцов крови детей [15]. Максимальная частота встречаемости этой популяции, составляющая 15%, отмечается среди образцов костного мозга детей с В-клеточным острым лимфобластным лейкозом после этапов индукционной и консолидационной терапии [7]. Минимальный выявляемый объем субпопуляции CD56+CD19+dim определяется чувствительностью исследования, а именно количеством проанализированных клеток, и составляет 0,004% от лейкоцитов при анализе не менее 500 000 событий в лейкоцитарном регионе при исследовании минимальной определяемой болезни [26]. Эта популяция может составлять значимую долю от лейкоцитов [3] и влиять на результаты рутинных исследований по определению субпопуляционного состава лимфоцитов или минорных субпопуляций В-клеток при использовании CD19 в качестве единственного линейного В-лимфоцитарного маркера или отсутствии в пробе антител к CD56 и некоторым другим NK-клеточным антигенам.

В настоящее время отсутствуют представления о значении субпопуляции CD56+CD19+dim клеток при различной патологии. NK-лимфоциты с коэкспрессией CD19 отмечаются при острых и хронических В-клеточных лимфопролиферативных заболеваниях [7, 17], при инфекции COVID-19 [11] и других патологических состояниях [15].

В нашем предыдущем исследовании было показано, что фенотип CD56+CD19+dim соответствует адаптивным NK-лимфоцитам — особенной популяции клеток, формирование которой связано с цитомегаловирусной инфекцией [3]. Стабильные эпигенетические модификации, возникающие под влиянием цитомегаловируса (ЦМВ), приводят к изменению клеточного метаболизма, увеличению продолжительности жизни адаптивных NK-лимфоцитов и определяют преимущественную экспрессию молекул, опосредующих участие в реакциях антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ) с вовлечением CD16, но не противоопухолевую активность, опосредованную рецепторами естественной цитотоксичности [19].

В недавних экспериментальных исследованиях была показана возможность различных исходов взаимодействия В-лимфоцитов, опсонизированных гликопротеином gp350 вируса Эпштейна–Барр (ВЭБ), и NK-клеток в зависимости от вовлечения клетки-мишени в инфекционный процесс при наличии соответствующих специфических антител. Если в инфицированном В-лимфоците ВЭБ находится в литической фазе жизненного цикла, осуществляя активную репродукцию с формированием новых вирионов, то результатом является развитие реакций антителозависимой клеточной цитотоксичности и лизис В-лимфоцита. При взаимодействии с неинфицированной В-клеткой, имеющей на мембране связавшуюся с CD21 вирусную частицу, жизнеспособность клетки-мишени чаще всего сохраняется [21]. В последнем случае, как было продемонстрировано в более поздних экспериментальных исследованиях этого коллектива, элиминация ВЭБ осуществляется посредством антителозависимого трогоцитоза — захвата и переноса NK-клеткой фрагмента мембраны В-лимфоцита с вирусной частицей — и последующей интернализацией вируса в ранние эндосомы и лизосомы NK-клетки [4]. Трогоцитоз в условиях in vitro приводил к появлению на мембране NK-клеток ряда молекул клетки-донора, а именно CD19, CD20 и CD21. Однако фенотипирование CD19+ NK-клеток периферической крови пациентов с различными заболеваниями не выявило экспрессии других В-клеточных антигенов [3, 15, 26]. Тем не менее гипотеза о трогоцитозе В-клеток, опсонизированных ВЭБ, как причине появления CD19 на мембране NK-клеток представляется убедительной, и служит основанием для предположения о существовании взаимосвязи выявления в крови пациентов субпопуляции CD19+ NK-лимфоцитов с активацией хронической ВЭБ-инфекции.

Цель исследования: определить факторы, способствующие появлению в периферической крови субпопуляции CD56+CD19+dim NK-лимфоцитов у пациентов с герпетической инфекцией.

Материалы и методы

Проанализированы результаты обследования пациентов с клиническими симптомами герпетической инфекции (n = 225), обратившихся к врачу-инфекционисту в период с 2015 по 2023 г. для клинико-лабораторного обследования и лечения. Значительная часть лиц имела в анамнезе лабораторно подтвержденную хроническую персистирующую герпетическую инфекцию: у 29% — ассоциированную с ВЭБ, у 2,2% — ассоциированную с ЦМВ, у 10% — микст-вирусную инфекцию. Некоторые пациенты наблюдались на протяжении нескольких лет, им обследование проводили неоднократно. Выполнено 255 комплексных лабораторных исследований. Средний возраст пациентов составил 34,6±8,5 лет, преобладали женщины (71%).

Лабораторные исследования проводились на базе ФГБУ ВЦЭРМ им. А.М. Никифорова МЧС России и включали: определение в сыворотке крови иммуноглобулинов классов M и G (IgG с индексом авидности) к антигенам ЦМВ (n = 255), общих иммуноглобулинов классов A, M, G (n = 24); выявление ДНК ЦМВ и ВЭБ в слюне (n = 255), крови (n = 180) и других биологических жидкостях (n = 18); изучение субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови (n = 255) с оценкой содержания CD56+CD19+dim субпопуляции NK-лимфоцитов.

Взятие крови проводили из локтевой вены с использованием вакутейнеров с ЭДТА или активатором свертывания. Взятие слюны осуществляли в стерильный пластиковый контейнер с завинчивающейся крышкой после трехкратного полоскания полости рта кипяченой водой.

Концентрацию общих иммуноглобулинов оценивали методом турбидиметрии (DxC 700AU, реактивы и прибор Beckman Coulter, США). Содержание специфических иммуноглобулинов к белкам ЦМВ определяли следующими методами: IgM — методом иммунохемилюминесценции (Immulite 2000, Siemens, США), IgG с индексом авидности — иммуноферментного анализа (ВектоЦМВ-IgG-авидность, АО «Вектор-Бест», Россия). Определение концентрации вирусной ДНК в биологических жидкостях проводили методом ПЦР-РВ (Ампли-Сенс EBV/HHV6/CMV-FL, ЦНИИ эпидемиологии, Россия). При выявлении вирусных ДНК в биологических жидкостях говорили об активной местной репликации соответствующего вируса.

Для оценки субпопуляционного состава лимфоцитов использовали восьмицветную панель моноклональных антител: HLADR-FITC, CD4-PE, CD3-ECD, CD56-PC5.5, CD25-PC7, CD8-APC, CD19-APC-AF700, CD45-APC-AF750. Для лизиса эритроцитов применяли VersaLyse. Анализ образцов проводили на проточном цитофлюориметре Navios в соответствии с инструкциями к реактивам (реактивы и прибор Beckman Coulter, США). При исследовании субпопуляционного состава лимфоцитов накопление проводили до 5000 событий в лимфоцитарном регионе, определяемом как CD45+brightFSdimSSdim. Субпопуляцию NK-лимфоцитов с коэкспрессией CD19 (CD56+CD19+dim) оценивали как CD56+CD19+dimCD3–HLADR–+dim клетки и считали положительной при выявлении более 10 событий в целевом регионе, что составляло 0,2% и более от лимфоцитов.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета Statistica 12.0 (StatSoft). Для выявления и оценки тесноты связи между количественными признаками использовали непараметрический корреляционный анализ по Спирмену. Частотный анализ проводили с использованием четырехпольных таблиц сопряженности на основании критерия χ2 Пирсона. Для сравнения групп использовали критерий Манна–Уитни. Статистически значимыми различия сравниваемых показателей считали при p < 0,05.

Результаты

Наличие в крови субпопуляции NK-лимфоцитов с коэкспрессией CD19 связано с предшествующей ЦМВ-инфекцией

Субпопуляция CD56+CD19+dim клеток (рис. 1) выявлена в 21 образце крови 18 человек.

 

Рисунок 1. Субпопуляция CD56+CD19+dim клеток в периферической крови (пациент Д., 45 лет)

Figure 1. Subpopulation of CD56+CD19+dim cells in peripheral blood (patient D., 45 years old)

Примечание. Субпопуляция CD56+CD19+dim клеток выделена черной рамкой и стрелкой.

Note. Subpopulation of CD56+CD19+dim cells is highlighted in black frame and an arrow.

 

Частота встречаемости субпопуляции CD56+CD19+dim среди всех обследованных лиц составила 8%. Эти клетки выявлены только в образцах крови пациентов, имевших ЦМВ-инфекцию в анамнезе и положительные результаты определения высокоавидных специфических IgG к ЦМВ в сыворотке крови.

Всего высокоавидные IgG к ЦМВ были выявлены у 187 человек, в этой группе частота встречаемости субпопуляции CD56+CD19+dim составила 9,6%. У троих пациентов были выявлены специфические IgM к цитомегаловирусу: у 2-х имела место первичная ЦМВ-инфекция, у 1-го — реактивация хронической инфекции.

Наличие в крови субпопуляции NK-лимфоцитов с коэкспрессией CD19 связано с активной репликацией ВЭБ

Результаты определения вирусных ДНК в биологических жидкостях пациентов, имевших высокоавидные IgG к ЦМВ, позволили выделить четыре подгруппы: 1 — лица без лабораторных признаков активной репликации герпесвирусов, 2 — репликация только ЦМВ, 3 — репликация только ВЭБ, 4 — репликация обоих вирусов. Оценка частоты встречаемости субпопуляции CD56+CD19+dim лимфоцитов в крови обследованных лиц в зависимости от выявления IgG к ЦМВ и наличия ДНК герпесвирусов в биологических жидкостях представлена на рис. 2.

 

Рисунок 2. Частота выявления субпопуляции CD56+CD19+dim лимфоцитов в крови пациентов в зависимости от наличия вирусных ДНК в биологических жидкостях

Figure 2. Frequency of detection of the CD56+CD19+dim lymphocyte subpopulation in the blood of patients depending on the presence of viral DNA in biological fluids

 

Как видно из рис. 2, субпопуляция CD56+CD19+dim клеток не была выявлена в крови как пациентов без ЦМВ-инфекции в анамнезе, так и у лиц, имевших высокоавидные IgG к ЦМВ, но без активной репликации ВЭБ на момент обследования. Таким образом, было сделано предположение о необходимости выполнения двух условий для появления в крови CD19+ NK-лимфоцитов. Первое — встреча с цитомегаловирусной инфекцией, приводящей к формированию пула адаптивных NK-клеток. Второе — наличие активной репликации ВЭБ.

Активная сочетанная репликация герпесвирусов увеличивает вероятность появления CD19+ NK

У всех пациентов, в крови которых была определена субпопуляция CD56+CD19+dim клеток, выявлена активная репликация вирусов герпеса в биологических жидкостях, в 12 случаях — обоих вирусов, в 6 — только ВЭБ (табл. 1). Необходимо отметить, что высокое содержание копий ДНК ВЭБ в биологических жидкостях пациентов было связано с клинической картиной активации хронической ВЭБ-инфекции, потребовавшей назначения врачом-инфекционистом специфической терапии. В табл. 1 результаты обследования пациентов 4 и 11 представлены в динамике, у пациента 11 при последнем визите клетки CD56+CD19+dim в крови не определены.

 

Таблица 1. Содержание ДНК вирусов ВЭБ и ЦМВ в биологической жидкости пациентов, имеющих в крови субпопуляцию CD56+CD19+dim клеток (21 образец 18 пациентов)

Table 1. The content of EBV and CMV virus DNA in the biological fluid of patients with a subpopulation of CD56+CD19+dim cells in the blood (21 samples of 18 patients)

№	Доля CD56+CD19+dim от лимфоцитов, % Proportion CD56+CD19+dim from lymphocytes, %	ЦМВ, копий ДНК/мл CMV, DNA/ml	ВЭБ, копий ДНК/мл EBV, DNA/ml
1	0,3	0	1,6 × 103
2	0,2	1,3 × 103	2,3 × 103
3	0,3	0	1,7 × 107
4	1,2	0,4 × 103	2,5 × 103
	1,2	0,4 × 103	1,5 × 103
	0,5	0	1,8 × 103
5	0,4	1,2 × 103	1,8 × 103
6	8,8	0	1,0 × 105
7	0,2	8,0 × 104	1,5 × 103
8	0,2	1,3 × 103	1,8 × 103
9	0,3	9,3 × 103	1,4 × 103
10	0,7	1,5 × 103	3,8 × 104
11	0,3	0,4 × 103	1,6 × 103
	0,2	0	6,2 × 105
	0,0	0	6,9 × 105
12	0,2	0,5 × 103	6,1 × 103
13	0,2	2,2 × 104	8,1 × 104
14	0,6	0	9,9 × 103
15	0,2	6,0 × 103	6,5 × 105
16	0,2	6,2 × 103	2,9 × 105
17	5,9	0	1,0 × 103
18	0,4	0	1,6 × 103

 

Выявлена средняя сила связи между наличием в биологической жидкости ДНК каждого из вирусов и присутствием субпопуляции CD56+CD19+dim лимфоцитов в периферической крови (значения χ2 при факторе риска «наличие ДНК ВЭБ» — 14,1, p < 0,001; при факторе риска «наличие ДНК ЦМВ» — 22,5, p < 0,001). Определена относительно сильная сила связи между выявлением в биологической жидкости ДНК обоих вирусов и присутствием субпопуляции CD56+CD19+dim лимфоцитов в периферической крови (значение χ2 37,6, p < 0,001).

Относительное количество NK-лимфоцитов с коэкспрессией CD19 в крови снижается при отсутствии репликативной активности ЦМВ

Ранее мы описывали результаты многолетних наблюдений за пациенткой, в крови которой субпопуляция CD56+CD19+dim была определена при втором и последующих обследованиях, совершавшихся в среднем с полугодовыми интервалами [3]. Субпопуляция сохранялась на протяжении шести лет, изменяясь от 0,3% лимфоцитов при втором визите до 0,9% во время третьего, далее снижаясь до 0,2% к концу наблюдений. Отсутствие анамнестических данных и результатов дополнительных лабораторных исследований не позволило связать появление в периферии субпопуляции CD19+ NK-клеток с наличием заболевания. В ходе текущего исследования на протяжении нескольких лет наблюдали двух пациентов с субпопуляцией CD56+CD19+dim в крови (пациенты 4 и 11 в табл. 1). При первом обследовании в слюне обоих лиц была определена ДНК ЦМВ и ВЭБ и максимальное количество CD56+CD19+dim NK-лимфоцитов в периферической крови. При повторных наблюдениях сохранялась персистенция ВЭБ при отсутствии ЦМВ. Вместе с этим в крови снижалось относительное количество CD19+ NK-клеток (рис. 3).

 

Рисунок 3. Динамика изменения относительного количества CD56+CD19+dim NK-лимфоцитов в крови при различном содержании вирусных ДНК в слюне пациентов 4 (А) и 11 (Б)

Figure 3. Dynamics of changes in the relative number of CD56+CD19+dim NK lymphocytes in the blood with different levels of viral DNA in the saliva of patients 4 (A) and 11 (B)

 

Максимальное относительное количество CD56+CD19+dim лимфоцитов в образцах крови обоих пациентов наблюдали при активной репликации обоих вирусов. В случае отсутствия в слюне ДНК цитомегаловируса при сохранении репликации ВЭБ доля CD19+ NK-лимфоцитов снижалась у обоих пациентов, в последнем случае при исходно малом объеме субпопуляции до значений ниже чувствительности исследования при наборе 5000 событий в лимфоцитарном регионе (рис. 3Б).

Среди лиц с активной репликацией ЦМВ и ВЭБ субпопуляция NK-лимфоцитов с коэкспрессией CD19 не отмечается у пациентов со скомпрометированным гуморальным иммунным ответом

Нами было показано, что высокая вероятность появления в периферической крови субпопуляции CD56+CD19+dim лимфоцитов и ее максимальная численность связана с активной репликацией обоих вирусов. Тем не менее в нашем исследовании далеко не у всех лиц с клиническими и лабораторными признаками сочетанной герпетической инфекции была определена интересующая нас субпопуляция клеток — среди 37 человек с сочетанной репликацией вирусов субпопуляция CD19+ NK-лимфоцитов в крови отмечалась только у 12 пациентов (32%). Следовательно, наряду с текущей или относительно недавней ЦМВ-инфекцией активная репликация вируса Эпштейна–Барр является необходимым, но не достаточным условием появления/сохранения в периферической крови этой субпопуляции NK-клеток.

Для поиска возможной причины наличия или отсутствия в периферической крови пациентов субпопуляции CD56+CD19+dim лимфоцитов были проанализированы анамнестические данные (возраст, длительность течения герпетических инфекций, сопутствующая патология) и концентрация в сыворотке крови общих иммуноглобулинов классов A, M, G как характеристика интегрального гуморального иммунного ответа. В медицинской информационной системе необходимые сведения имелись у 24 человек. В группу 1 вошли лица, в крови которых была определена целевая популяция клеток (n = 12), в группу 2 — без таковой (n = 12). Пациенты первой группы были моложе лиц второй группы (28,2±11,6 лет vs 47,1±18,9 лет, p < 0,05). Статистическое сравнение длительности инфекционных заболеваний между группами не проводили ввиду ее приблизительной оценки. Тем не менее сложилось впечатление о более длительном среднем стаже заболевания ВЭБ у лиц группы 1 (4,5 года против 2,3 лет) при сопоставимом среднем стаже заболевания ЦМВ (около 3,3 лет в обеих группах).

В сыворотках всех пациентов группы 1 были определены специфические высокоавидные IgG антитела к ЦМВ. Среди пациентов группы 2 у двоих имела место первичная ЦМВ-инфекция (выявлены специфические IgM и низкоавидные IgG), специфические высокоавидные IgG антитела к ЦМВ определены у 10 пациентов.

Анамнестические данные и результаты определения общих иммуноглобулинов классов A, M и G в сыворотке пациентов групп 1 и 2 представлены в таблицах 2 и 3 соответственно.

 

Таблица 2. Анамнестические данные и концентрация общих иммуноглобулинов пациентов группы 1

Table 2. Anamnestic data and concentration of total immunoglobulins of patients in group 1

№	Пол Sex	Возраст, лет Age, years	Анамнестические данные согласно медицинской документации Anamnestic data from medical records	IgA, г/л IgA, g/l	IgM, г/л IgM, g/l	IgG, г/л IgG, g/l
1	М M	31	Нисходящая частичная атрофия зрительного нерва обоих глаз Наследственная оптическая нейропатия Лебера Descending partial atrophy of the optic nerve of both eyes Leber’s optic neuropathy	1,2	1,3	6,1*
2	Ж F	28	Синдром Гийена-Барре Поллиноз Риноконъюнктивит Guillain–Barré syndrome Hay fever Rhinoconjunctivitis	1,6	1,7	12,89
3	Ж F	33	Энцефалопатия сосудистого генеза Нейросенсорная тугоухость легкая форма Vascular encephalopathy Sensorineural hearing loss mild form	2,1	1,4	9,4
4	М M	3	Нарушения, вовлекающие иммунные механизмы, неуточненные Disorders involving immune mechanisms, unspecified	0,8	1,2	8,29
5	М M	45	Хронический билиарнозависимый панкреатит в фазе обострения Хронический эрозивный антральный гастрит, обострение Exacerbation of chronic pancreatitis Exacerbation of chronic erosive gastritis	2,1	0,7	7,7*
6	Ж F	29	Хронический пангастрит НP- с эрозиями антрального отдела, обострение Хронический дуоденит обострение Exacerbation of chronic erosive antral gastritis HP- Exacerbation of chronic duodenitis	1,9	1,2	11,7
7	М M	2,5	Вторичные нарушения параметров иммунитета на фоне вирусной инфекции Secondary immune disorders due to viral infection	0,7	0,6*	9,5
8	Ж F	27	Апластическая анемия, тяжелая форма Пароксизмальная ночная гемоглобинурия Severe aplastic anemia Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria	2,0	0,92	14,12
9	М M	10	Воспалительный процесс вирусной этиологии, вялотекущий Поллиноз Бытовая сенсибилизация Viral infection Hay fever Sensitization to household allergens	1,4	1,0	15,8
10	М M	40	Нарушения, вовлекающие иммунные механизмы, неуточненные Disorders involving immune mechanisms, unspecified	1,6	0,8	11,52
11	Ж F	32	Нарушения, вовлекающие иммунные механизмы, неуточненные Disorders involving immune mechanisms, unspecified	1,2	1,1	9,9
12	Ж F	58	Кандидозный эзофагит Candidal esophagitis	1,5	2,7**	10,5

Примечание. * — результат ниже возрастной нормы; ** — результат выше возрастной нормы.

Note. * — the result is below the age norm; ** — the result is above the age norm.

 

Таблица 3. Анамнестические данные и концентрация общих иммуноглобулинов у пациентов группы 2

Table 3. Anamnestic data and concentration of total immunoglobulins in patients of group 2

№	Пол Sex	Возраст, лет Age, years	Анамнестические данные согласно медицинской документации Anamnestic data from medical records	IgA, г/л	IgM, г/л	IgG, г/л
1	Ж F	8	Нарушения, вовлекающие иммунные механизмы, неуточненные Disorders involving immune mechanisms, unspecified	1,4	1,7	15,0
2	Ж F	57	ВИЧ-инфекция, прогрессирование без антиретровирусной терапии HIV infection, progression without antiretroviral therapy	6,6**	0,7	8,7
3	М M	65	Атопическая бронхиальная астма Вторичное иммунодефицитное состояние Atopic bronchial asthma Secondary immunodeficiency	4,0	1,0	13,25
4	Ж F	3	Иммунодефицит с преимущественным дефектом антител неуточненный Antibody immunodeficiency, unspecified	< 0,06*	1,0	5,71*
5	М M	36	ВИЧ-инфекция 4В стадия, прогрессирование без антиретровирусной терапии HIV infection stage 4B, progression without antiretroviral therapy	2,1	1,4	23,2**
6	М M	70	В-клеточная лимфома ЦНС CNS B-cell lymphoma	0,64*	0,35*	12,23
7	М M	81	В-клеточная лимфома из малых лимфоцитов Small B-cell lymphoma	< 0,06*	< 0,25*	5,9*
8	Ж F	55	Нарушения, вовлекающие иммунные механизмы, неуточненные Disorders involving immune mechanisms, unspecified	1,3	1,5	8,1
9	Ж F	58	Первичная ЦМВ-инфекция ВПЧ-инфекция Вторичное иммунодефицитное состояние Primary CMV infection HPV infection Secondary immunodeficiency	0,8*	1,7	8,6
10	М M	39	Нарушения, вовлекающие иммунные механизмы, неуточненные Бронхиальная астма, неаллергическая Disorders involving immune mechanisms, unspecified Nonatopic bronchial asthma	1,44	0,41*	5,6*
11	М M	57	Гипертоническая болезнь II стадии Дисметаболическая кардиомиопатия Stage II hypertension Dysmetabolic cardiomyopathy	1,33	1,87	6,05*
12	Ж F	36	Первичная ЦМВ-инфекция Вторичное иммунодефицитное состояние Аутоиммунный тиреоидит Primary CMV infection Secondary immunodeficiency Autoimmune thyroiditis	0,8*	1,0	8,6

Примечание. * — результат ниже возрастной нормы; ** — результат выше возрастной нормы.

Note. * — the result is below the age norm; ** — the result is above the age norm.

 

У троих пациентов (25%) группы 1 отмечено снижение содержания в сыворотке общих иммуноглобулинов какого-либо класса, из них в двух случаях выявлено снижение IgG.

Снижение концентрации иммуноглобулинов какого-либо класса в сыворотке пациентов группы 2 ниже возрастной нормы отмечено в два раза чаще — в 58% случаев (n = 7) против 25% в группе 1, из них в четырех случаях — снижение IgG. Анализ анамнестических данных пациентов второй группы выявил у значительной части лиц наличие заболеваний, приводящих к нарушению гуморального иммунного ответа. Среди них прогрессирующая ВИЧ-инфекция без антиретровирусной терапии, хронические В-клеточные лимфопролиферативные заболевания, иммунодефицит с преимущественным дефектом продукции антител, вторичное иммунодефицитное состояние. Следовательно, состоятельность гуморального звена иммунитета можно рассматривать как один из факторов, влияющих на возможность появления в периферической крови субпопуляции CD56+CD19+dim лимфоцитов.

Обсуждение

В нашем исследовании показана взаимосвязь появления в периферической крови субпопуляции CD19+ NK-клеток с наличием ЦМВ-инфекции текущей или в анамнезе. У большинства пациентов с CD19+ NK-лимфоцитами в крови репликация ЦМВ в биологических жидкостях имела место на момент обследования, у некоторых отмечалась ранее. Нами выявлено, что помимо ЦМВ-инфекции для присутствия в крови CD56+CD19+dim лимфоцитов необходима активная репликация ВЭБ.

Следует отметить, что у всех пациентов с субпопуляцией CD19+ NK-клеток в крови ВЭБ-инфекция имела продолжительное хроническое течение — длительность заболевания на момент обследования составляла не менее 7 месяцев, в среднем около двух лет. Популяция NK-клеток со слабой экспрессией CD19 в нашем исследовании выявлена только у пациентов с реактивацией хронической ВЭБ-инфекции, достигая частоты встречаемости 32% среди лиц с активной репликацией обоих вирусов. Динамическое наблюдение за некоторыми пациентами показало возможность многолетней персистенции CD19+ NK-лимфоцитов в крови с постепенным снижением численности при отсутствии репликативной активности ЦМВ. Отсутствие CD56+CD19+dim лимфоцитов у лиц с активной сочетанной герпетической инфекцией в ряде случаев было связано с нарушением гуморального иммунного ответа.

Ранее проведенное нами фенотипирование субпопуляции NK-клеток с коэкспрессией CD19 позволило отнести эти клетки к адаптивным NK-лимфоцитом [3], появление которых связано с цитомегаловирусной инфекцией. Фенотип этих клеток чаще всего описывают как NKG2C+/–CD57+brightCD2+brightCD7+dim CD16+dimCD38+dimFcεR1γ– [13]. Первая встреча с цитомегаловирусом происходит, как правило, в детском возрасте, поражая от 60 до 100% взрослого населения планеты. Среди подростков и лиц молодого возраста отмечается вторая волна инфицирования ЦМВ [2]. В России среди подростков 14–16 лет число серопозитивных лиц составляет в среднем 73% [1]. Согласно литературным данным, популяция адаптивных NK-лимфоцитов увеличивается в остром периоде первичной ЦМВ-инфекции, достигает максимальных значений к концу второй недели после инфицирования и постепенно снижается к 20-му дню заболевания [27]. В дальнейшем эти клетки персистируют в течение нескольких лет, изменяя численность в зависимости от активности ЦМВ [20]. Таким образом, максимальное количество адаптивных NK-лимфоцитов отмечается у лиц детского и молодого возраста с постепенным снижением популяции при отсутствии репликации вируса.

Помимо увеличенной продолжительности жизни, адаптивные NK-клетки обладают усиленной способностью к участию в реакциях антителозависимой клеточной цитотоксичности [24, 31]. Функциональные особенности адаптивных NK-лимфоцитов связаны с уникальным фенотипом, в частности, с высокой экспрессией костимуляторной молекулы CD2 и проведением сигнала от CD16 (FcγRIIIa) с помощью CD3ζ. Как молекула адгезии CD2 участвует в стабилизации межклеточных контактов для формирования иммунного синапса, взаимодействуя с CD58 на антигенпрезентирующих клетках, в том числе на В-лимфоцитах [23]. Кроме того, эта молекула служит связующим звеном между CD16 и актиновым цитоскелетом, облегчая перемещение молекул в иммунологическом синапсе NK-клеток [5]. Только для субпопуляции адаптивных NK-лимфоцитов показана возможность тесной взаимосвязи между молекулами CD2 и FcγRIIIa: CD16 стабилизирует экспрессию CD2, обе молекулы совместно локализуются в иммунном синапсе, что позволяет CD2 подключиться к сигнальному пути от CD16. Это приводит к значительно более высоким уровням фосфорилирования всех сигнальных молекул, снижая порог активации адаптивных NK-лимфоцитов для реализации эффективной АЗКЦ. Интересно, что костимулирующий эффект CD2 в реакциях АЗКЦ зависит от концентрации специфических IgG к антигенам клетки-мишени: при низких титрах IgG он значительно выше [18].

Механизмы, позволяющие NK-лимфоцитам контролировать ВЭБ на разных этапах инфекционного процесса, изучались с использованием различных экспериментальных моделей группой исследователей под руководством M. Lopez-Montañés. Было показано, что в зависимости от степени поражения В-лимфоцита вирусом его взаимодействие с NK-клеткой может приводить не только к лизису инфицированного В-лимфоцита, но и к сохранению жизнеспособности неинфицированной В-клетки, опсонизированной вирусной частицей [4, 21]. В последнем случае элиминация вируса осуществлялась путем FcγRIIIa-зависимого трогоцитоза фрагмента мембраны В-клетки с прикрепленной к CD21 частицей ВЭБ в присутствии специфических IgG. Появление на поверхности NK-лимфоцита В-клеточных молекул CD19, CD20 и CD21 в экспериментах in vitro было следствием процесса трогоцитоза. Авторами было высказано предположение о том, что CD16-зависимый трогоцитоз может являться альтернативным механизмом элиминации вирусов. Таким образом, наиболее вероятным объяснением появления экспрессии В-клеточных антигенов на поверхности NK-лимфоцитов периферической крови пациентов с острой ВЭБ-инфекцией является FcγRIIIa-зависимый трогоцитоз фрагмента мембраны В-клетки.

Трогоцитоз — это активный кальций-зависимый рецептор-индуцированный контактно-опосредованный перенос участков мембраны, содержащих как молекулы, играющие роль в межклеточных взаимодействиях, так и соседние молекулы [10, 14]. Возможность трогоцитоза обеспечивается выполнением ряда условий, что предопределяет относительную редкость его детекции. Для его осуществления необходимо формирование иммунного синапса между клеткой-реципиентом и клеткой-донором c высокоаффинной связью в центральной зоне супрамолекулярного активационного кластера, а также с высокой плотностью экспрессии костимуляторных молекул и молекул адгезии в его периферической зоне [22]. Таким образом, для трогоцитоза NK-клеткой фрагмента мембраны В-лимфоцита должно быть обеспечено устойчивое взаимодействие на всех этапах цепи от В-клетки, опсонизированной вирусом, до NK-лимфоцита: CD21 — gp350 ВЭБ — специфические IgG к gp350 — CD16a (FcγRIIIa) (рис. 4).

 

Рисунок 4. Взаимодействие В-лимфоцита и NK-клетки при ВЭБ-инфекции. Рисунок создан с помощью программного обеспечения BioRender (https://biorender.com)

Figure 4. Interaction of B-lymphocyte and NK-cell during EBV infection. Image created using software BioRender (https://biorender.com)

 

Это условие может быть обеспечено присутствием в крови высокоаффинных IgG к поверхностному гликопротеину gp350 вируса Эпштейна–Барр, высоким сродством FcγRIIIa на NK-клетках к Fc-домену специфических IgG и повышенной экспрессией адгезионной молекулы CD2, что показано для адаптивных NK-лимфоцитов.

 

Таблица 4. Возможный исход взаимодействия NK- и В-клеток при инфекции вирусом Эпштейна–Барр

Table 4. Possible outcome of the interaction of NK and B cells during Epstein–Barr virus infection

	В-клетка B cell
	Инфицированная Infected				Неинфицированная Intact
	Литическая фаза Lytic phase	Латентная фаза Latent phase
		Нет опсонизации вирусной частицей No opsonization by viral particle	Есть опсонизация вирусной частицей There is opsonization by a viral particle		Есть опсонизация вирусной частицей There is opsonization by a viral particle		Нет опсонизации вирусной частицей No opsonization by viral particle
Экспрессия на мембране В-клетки gp350 Expression of gp350 on B cell membrane	+	–	+		+		–
Экспрессия на мембране В-клетки стресс-индуцированных молекул Expression of stress-induced molecules on the B cell membrane	+	–	–		–		–
IgG к белкам gp350 IgG to gp350 proteins	+/–	+/–	Низкий титр Low titer	Высокий титр High titer	Низкий титр Low titer	Высокий титр High titer	+/–
Взаимодействие NK- и В-клеток Interaction between NK and B cells	Стабилизация контакта CD2/CD58 Stabilization of the CD2/CD58 bond	Нет No	Стабилизация контакта CD2/CD58 Stabilization of the CD2/CD58 bond				Нет No
	Активация NKG2D; синтез IFNγ, перфоринов, гранзимов; усиление сигнала с участием CD16, NKp46, 2B4 NKG2D activation; synthesis of IFNγ, perforins, granzymes; signal amplification involving CD16, NKp46, 2B4		Выраженное взаимодействие CD2/CD16 Significant interaction CD2/CD16	Слабое взаимодействие CD2/CD16 Weak interaction CD2/CD16	Выраженное взаимодействие CD2/CD16 Significant interaction CD2/CD16	Слабое взаимодействие CD2/CD16 Weak interaction CD2/CD16

 

	В-клетка B cell
	Инфицированная Infected				Неинфицированная Intact
	Литическая фаза Lytic phase	Латентная фаза Latent phase
Результат Result	Лизис инфицированной В-клетки различными механизмами Lysis of infected B cells by various mechanisms	Сохранение инфицированной В-клетки Persistence of infected B- cell	Лизис инфицированной В-клетки АЗКЦ Lysis of infected B-cell by ADCC	Сохранение инфицированной В-клетки Трогоцитоз вирусной частицы Persistence of infected B-cell Trogocytosis of a viral particle	Лизис интактной В-клетки АЗКЦ Lysis of intact B- cell by ADCC	Сохранение интактной В-клетки Трогоцитоз вирусной частицы Preservation of intact B-cell Trogocytosis of viral particle	Сохранение интактной В-клетки Preservation of intact B-cell

 

Гликопротеин gp350 вируса Эпштейна–Барр, опосредующий проникновение вирусной частицы в В-лимфоцит через связывание с CD21, является основной мишенью для нейтрализующих антител [29]. Результаты исследований последних лет свидетельствуют о том, что специфические высокоаффинные нейтрализующие IgG антитела к поверхностным антигенам вирусов являются, как правило, афукозилированными, обладая сродством к FcγRIIIa, в десятки раз превышающим сродство фукозилированных IgG [8, 16]. Высокое сродство анти-gp350 IgG к CD16 — один из факторов, обеспечивающих формирование устойчивой связи между клеткой-эффектором и мишенью, что способствует как эффективной АЗКЦ, так и трогоцитозу даже при связывании с низкоаффинным рецептором к иммуноглобулину G, каким является FcγRIIIa.

Титры нейтрализующих IgG к gp350 увеличиваются в течение нескольких месяцев после первичного заражения и достигают пиковых значений в среднем к 2,5 годам [6]. По-видимому, длительность хронической ВЭБ-инфекции немаловажна для возможности трогоцитоза, поскольку определяет концентрацию высокоаффинных нейтрализующих IgG к gp350. При низких титрах IgG костимулирующий эффект CD2 для проведения сигнала от CD16 значительно выше [18] и способствует развитию АЗКЦ и гибели В-клетки, что обеспечивает контроль активной вирусной инфекции при незначительном содержании антител. Вероятно, при высоких концентрациях IgG к gp350 выраженная экспрессия молекул CD2 на адаптивных NK-клетках необходима только для формирования устойчивого межклеточного контакта, требующегося для осуществления АЗКЦ и/или трогоцитоза. При этом практически нет усиления сигнала от CD16 с участием CD2, что затрудняет развитие АЗКЦ, но не мешает трогоцитозу. Результаты исследования Alari-Pahissa E. и соавт. (2021) подтверждают предположение о минимальном вовлечении CD2 в межклеточное взаимодействие при FcγRIIIa-зависимом трогоцитозе В-лимфоцитов [4].

Распознавание NK-клеткой В-лимфоцита и итог межклеточного взаимодействия при ВЭБ-инфекции зависит от спектра молекул на поверхности клетки-эффектора и клетки-мишени, а также наличия и концентрации антител к белкам ВЭБ. В случае первичной ВЭБ-инфекции связывание gp350 вирусной частицы с CD21 на В-лимфоците приводит к его инфицированию. При активной репликации ВЭБ в литической фазе жизненного цикла вируса в В-клетке индуцируется синтез вирусных белков и стресс-индуцированных молекул ULBP1, которые являются лигандами для активирующего рецептора NK-клеток NKG2D, с дальнейшей реализацией программы гибели инфицированной клетки-мишени с помощью различных механизмов — естественной цитотоксичности, синтеза цитокинов, антителозависимой клеточной цитотоксичности [30]. В случае хронической ВЭБ-инфекции наличие нейтрализующих антител сдерживает инфекционный процесс, позволяя адаптивным NK-лимфоцитам распознавать gp350+ В-клетки, опсонизированные вирусными частицами, но в остальном сохраняющие нормальную экспрессию поверхностных молекул. Итог такого взаимодействия зависит от концентрации высокоаффинных IgG к gp350: при высоком содержании более вероятен трогоцитоз фрагмента мембраны В-лимфоцита вместе с вирусной частицей с сохранением жизнеспособности В-клетки, при низком содержании — лизис В-клетки через развитие реакций АЗКЦ. Поскольку сведения о различии в результатах взаимодействия NK-клетки и В-лимфоцита в зависимости от наличия нейтрализующих антител и степени вовлечения В-клетки были получены в экспериментальных условиях в серии работ M. Lopez-Montañés, то остается открытым вопрос: касается ли это только интактных gp350+ В-лимфоцитов или также и инфицированных В-клеток с ВЭБ в латентной фазе. Во втором случае сохранение жизнеспособности инфицированной В-клетки будет способствовать персистенции вируса. Отсутствие экспрессии вирусных, а также стресс-индуцированных белков на мембране В-лимфоцита препятствует его распознаванию NK-клеткой, как это отмечается для инфицированных В-лимфоцитов в латентной фазе ВЭБ, или интактных В-клеток (табл. 4).

Следовательно, можно предположить, что на ранних сроках ВЭБ-инфекции или при недостаточном синтезе специфических IgG в результате нарушения гуморального иммунного ответа более вероятно участие адаптивных NK-клеток в противовирусном иммунитете с развитием АЗКЦ и лизисом интактных В-лимфоцитов, опсонизированных gp350+ вирусными частицами. Возможно, одной из причин отсутствия субпопуляции CD19+ NK-клеток как маркера трогоцитоза в крови пациентов с сочетанной герпетической инфекцией из второй группы является низкий титр нейтрализующих IgG к gp350 или их отсутствие. Это может быть связано как с нарушениями в гуморальном звене иммунитета, обусловленными сопутствующими заболеваниями пациентов, так и с небольшой длительностью хронической ВЭБ-инфекции. При высоком титре IgG к gp350 возможен процесс трогоцитоза, направленный на элиминацию ВЭБ с сохранением жизнеспособности В-лимфоцитов, что показано у пациентов группы 1, у которых в периферической крови была определена популяция адаптивных NK-клеток с коэкспрессией CD19. При этом в случае сохранения жизнеспособности В-лимфоцита с ВЭБ в латентной фазе, опсонизированного gp350+ вирусной частицей, трогоцитоз способствует персистенции вируса.

Особый интерес к изучению механизмов трогоцитоза появился в связи с широким использованием биологической терапии для лечения пациентов с онкологическими и аутоиммунными заболеваниями. Известно, что трогоцитоз значительно снижает эффективность ритуксимаба, даратумумаба и других терапевтических моноклональных антител [22, 28], способствуя сохранению опухолевого клона. Замечено, что процессы трогоцитоза протекают тем активнее, чем выше концентрация используемых препаратов. И, напротив, изменение дозирования терапевтических МКАТ с длительным введением низких концентраций приводит к снижению трогоцитоза и эффективной элиминации опухолевых клеток [28]. Таким образом, преимущественный исход взаимодействия иммунных клеток-эффекторов и опухолевых клеток-мишеней зависит от соотношения количества антигена (например, CD20) к антителу (например, ритуксимаб). Вероятно, при противовирусном ответе имеют место сходные механизмы, когда при высокой концентрации специфических антител преобладают процессы трогоцитоза, тогда как низкая концентрация приводит к развитию АЗКЦ.

Одной из немаловажных функциональных особенностей адаптивных NK-лимфоцитов является индуцибельная экспрессии трансактиватора основного комплекса гистосовместимости (CIITA) и последующая HLA-DR-опосредованная презентации антигенов Т-лимфоцитам [12]. Повышение экспрессии HLA-DR отмечается при взаимодействии молекул CD2 и CD58 [25], а также при связывании CD16 с вирусными частицами, опсонизированными специфическими IgG [10]. Адаптивные NK способны осуществлять процессинг и презентацию вирусных белков некоторым популяциям Т-хелперов с цитотоксическим потенциалом [9]. В нашем предыдущем исследовании была отмечена вариабельная экспрессия HLA-DR на CD19+NK-лимфоцитах [3], причем увеличение экспрессии HLA-DR совпадало с ростом субпопуляции и клиническими обострениями ВЭБ-инфекции (данные не представлены). Не исключено, что CD16-опосредованный трогоцитоз опсонизированных частиц ВЭБ с поверхности В-клеток также может способствовать презентации вирусных антигенов специфическим Т-клеткам памяти и последующей эффективной элиминации вируса.

Некоторым ограничением нашего исследования явилось отсутствие данных о содержании специфических антител к gp350 вируса Эпштейна–Барр. Для рассмотрения возможных исходов взаимодействия NK-клетки и В-лимфоцита при этой инфекции в представленную нами схему включены данные о влиянии титра антител на возможность АЗКЦ и трогоцитоза из открытых литературных источников.

Заключение

В результате проведенного исследования выявлен ряд факторов, способствующих появлению в периферической крови субпопуляции CD56+CD19+dim NK-лимфоцитов, а именно относительно недавно перенесенная ЦМВ-инфекция, стимулирующая дифференцировку адаптивных NK-клеток; наличие хронической ВЭБ-инфекции со стажем заболевания, обеспечивающим высокий титр нейтрализующих антител к gp350 ВЭБ; наличие активной репликации ВЭБ на момент исследования; сохранный гуморальный иммунный ответ. Особенно высокое относительное количество CD56+CD19+dim NK-лимфоцитов наблюдалось при активной сочетанной герпетической инфекции (ВЭБ+ЦМВ).

Субпопуляция CD56+CD19+dim не была определена у лиц без ЦМВ-инфекции в анамнезе, при отсутствии активной репликации ВЭБ и у пациентов с заболеваниями, приводящими к нарушению гуморального иммунного ответа.

Появление в периферической крови CD56+CD19+dim NK-клеток является следствием участия адаптивных NK-лимфоцитов в противовирусном ответе и маркером трогоцитоза мембран В-лимфоцитов, связавших частицы ВЭБ.

Возможность присутствия в периферической крови субпопуляции NK-лимфоцитов с коэкспрессией CD19 необходимо учитывать при проведении исследований по фенотипированию В-лимфоцитов, поскольку ее наличие может приводить к некорректному подсчету В-клеток при использовании CD19 в качестве единственного линейного В-лимфоцитарного маркера или отсутствии в пробе антител к CD56 и некоторым другим NK-клеточным антигенам.

Об авторах

Анастасия Андреевна Калашникова

ФГБУ Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. А.М. Никифорова МЧС России

Автор, ответственный за переписку.
Email: petkova_nas@mail.ru

к.б.н., старший научный сотрудник научно-исследовательского отдела лабораторной диагностики научно-исследовательского центра

Россия, Санкт-Петербург

Наталия Владимировна Бычкова

ФГБУ НМИЦ акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова Минздрава России

Email: bnv19692007@yandex.ru

д.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории клинической иммунологии

Россия, Москва

Ирина Анисимовна Ракитянская

СПбГБУЗ Городская поликлиника № 112

Email: tat-akyla@inbox.ru

д.м.н., профессор, клинический иммунолог, консультант отделения аллергологии-иммунологии и клинической трансфузиологии

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы