Study of the adjuvant properties of beta-glucans from  Saccharomyces Cerevisiae  yeast

Ekaterina A. Volosnikova; Волосникова Екатерина Александровна; D. N. Shcherbakov; Щербаков Д. Н.; N. V. Volkova; Волкова Н. В.; T. I. Esina; Есина Т. И.; A. V. Zaikovskaya; Зайковская А. В.; G. G. Shimina; Шимина Г. Г.; E. D. Danilenko; Даниленко Е. Д.

doi:10.15789/2220-7619-SOT-16685

Изучение адъювантных свойств бета-глюканов из дрожжей Saccharomyces Cerevisiae

Авторы: Волосникова Е.А.¹, Щербаков Д.Н.¹, Волкова Н.В.¹, Есина Т.И.¹, Зайковская А.В.¹, Шимина Г.Г.¹, Даниленко Е.Д.¹
Учреждения:
1. ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора
Выпуск: Том 14, № 3 (2024)
Страницы: 569-574
Раздел: КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
Дата подачи: 26.07.2024
Дата принятия к публикации: 26.07.2024
Дата публикации: 28.07.2024
URL: https://iimmun.ru/iimm/article/view/17738
DOI: https://doi.org/10.15789/2220-7619-SOT-16685
ID: 17738

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Для увеличения эффективности и иммуногенности вакцин, особенно субъединичных, необходимо использование адъювантов. Полисахариды в силу своей безопасности и биосовместимости являются желательными кандидатами для создания вакцинных адъювантов. Наша работа посвящена разработке способа получения препарата бета-глюканов из клеточной стенки дрожжей Saccharomyces cerevisiae и изучению их адъювантных свойств. Высокой чистоты полученного препарата и отсутствия токсичности удалось достичь, используя при очистке ферментные комплексы целлюлазы и протеазы в сочетании с обработкой ультразвуком с частотой 22 кГц. Разработанная схема позволяет получать препарат бета-глюканов с выходом до 2 г из 100 г биомассы влажных клеток Saccharomyces cerevisiae. Для изучения адъювантных свойств бета-глюканов использовали 50 самцов мышей линии BALB/c массой 16–18 г. Иммунизацию проводили двукратно с интервалом 14 суток, внутримышечно по 200 мкл на животное. В качестве антигена для иммунизации использовали рекомбинантный белок RBD (рецептор-связывающий домен поверхностного S-белка коронавируса SARS-CoV-2, вариант (Wuhan-Hu-1) и B.1.617.2 (Delta)) в дозе 50 мкг на животное. Группе положительного контроля вводили антиген с гидроокисью алюминия. В качестве отрицательного контроля использовали мышей, которым вводили физиологический раствор. Титры специфичных антител в сыворотках крови определяли методом иммуноферментного анализа с использованием в качестве антигена рекомбинантного RBD поверхностного белка SARS-CoV-2 (вариант (Wuhan-Hu-1) и B.1.617.2 (Delta)) и рекомбинантного спайкового белка (вариант Wuhan-Hu-1), B.1.617.2 (Delta) и B.1.1.529 (Omicron)). Титр вируснейтрализующих антител определяли при помощи реакции вируснейтрализации с использованием штаммов вируса SARS-CoV-2: Wuhan–hCoV-19/Australia/VIC01/2020 (WuhanHu-1), Delta–hCoV-19/Russia/PSK-2804/2021 (Delta (B.1.617.2)) и Omicron 1–hCoV-19/Russia/Moscow171619–031221/2021 (Omicron (B.1.1.529)). В ходе работы показано, что бета-глюканы обладают способностью усиливать выработку специфических и вируснейтрализующих антител у мышей, иммунизированных RBD. Титры специфических и вируснейтрализующих антител сравнимы с их уровнем в группе, иммунизированной RBD с Al(OH)₃. В эксперименте на белых аутбредных мышах ICR показано, что препарат относится к практически нетоксичным веществам. Таким образом, можно заключить, что использование бета-глюканов в качестве адъювантов может стать альтернативой адъювантам на основе солей алюминия, при этом бета-глюканы являются биосовместимыми, биодеградируемыми и нетоксичными веществами, а производство их не отличается трудоемкостью.

Ключевые слова

адьювант, бета-глюканы, белок S, иммунный ответ, мыши, иммунизация

Полный текст

Введение

Субъединичные вакцины занимают важное место в системе современной вакцинопрофилактики. Обязательным компонентом таких вакцин, обеспечивающим повышение их иммуногенности, являются адъюванты. Классическими адъювантами, которые по-прежнему широко используются при разработке новых вакцин, являются адъюванты на основе солей алюминия. В то же время необходимость индукции, помимо гуморального, клеточного звена иммунитета, снижения побочных эффектов вакцин, заставляют искать другие варианты адъювантных систем.

Известно, что многие полисахариды, такие как альфа-, бета-глюканы, маннан и хитозан, обладают адъювантными свойствами [7, 6]. Адъюванты на основе полисахаридов совместимы с антигенами, полученными при помощи разных экспрессионных систем, безопасны, характеризуются минимальным риском образования токсических метаболитов, хорошо переносятся, кроме того, относительно легко нарабатываются в производственных масштабах [3].

Бета-глюканы — это группа полисахаридов, присутствующая во многих видах организмов, таких как грибы, дрожжи, овес, ячмень, морские водоросли, и обладающая разнообразной биологической активностью. При использовании бета-глюканов в качестве адъювантов было обнаружено, что в организме они распознаются целым рядом рецепторов, таких как дектин-1, рецептор комплемента 3 (CR3), CD5, лактозилцерамид и др. [8].

Цель данной работы заключалась в разработке способа получения бета-глюканов из клеточных стенок Saccharomyces cerevisiae, изучении их адъювантных и токсических свойств.

Материалы и методы

Получение бета-глюканов. Для получения препарата бета-глюканов использовали биомассу клеток Saccharomyces cerevisiae Y-448. Клетки подвергали механическому разрушению с помощью бус баллотини. Клеточный дебрис растворяли и подвергали ферментативному гидролизу, для чего к растворенному дебрису добавляли 40 г «Протосубтилин Г3Х» и 3 мл «ЦеллоЛюксА» (ООО ПО «Сиббиофарм»), гид ролиз вели 15 часов при 60°С. Смесь охлаждали до температуры 20°С и центрифугировали (12 000g, 20 мин, 20°С). Осадок, содержащий целевой продукт бета-глюканов, отмывали 1%-ным раствором додецилсульфата натрия, деионизованной водой пятикратно и трижды подвергали воздействию ультразвука с частотой 22 кГц/с (5 мин). Далее проводили щелочной гидролиз и полупродукт отмывали деионизованной водой. Готовый продукт суспендировали в 50 мл деионизованной воды, разливали и сушили в термостате при 50°С.

Иммунизация животных. В качестве антигена для иммунизации использовали рекомбинантный белок RBD (рецептор-связывающий домен поверхностного S-белка коронавируса SARS-CoV-2, вариант B.1.617.2 (Delta)), полученный в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора с использованием клеток CHO-K1. Изучение адъювантных свойств проводили на самцах мышей линии BALB/c массой 16–18 г, полученных из питомника ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (р.п. Кольцово Новосибирской области). Условия их содержания и проведения экспериментов были выполнены в соответствии с Федеральным законом «Об ответственном обращении с животными и о внесении изменений в отдельные законодательные акты Российской Федерации» от 27.12.2018 № 498-ФЗ.

Первой группе животных внутримышечно, двукратно с интервалом 14 суток, вводили белок RBD, второй и третьей — RBD с препаратом бета-глюканов в дозе 1 мг или 50 мкг в объеме 0,2 мл на мышь. В качестве положительного контроля использовали мышей, которым по аналогичной схеме внутримышечно вводили белок RBD и гидроокись алюминия Al(OH)₃ в дозе 250 мкг. В качестве отрицательного контроля использовали мышей, которым вводили 200 мкл физиологического раствора. Для определения титров специфических и вируснейтрализующих антител через 10 суток после второй иммунизации из ретроорбитального синуса отбирали образец крови, как описано в [1].

Анализ титров специфических антител. Титры специфических антител в сыворотках крови определяли методом иммуноферментного анализа. В качестве антигена использовали рекомбинантный RBD поверхностного белка SARS-CoV-2 (вариант (Wuhan-Hu-1) и B.1.617.2 (Delta)) и рекомбинантный спайковый белок (вариант (Wuhan-Hu-1), B.1.617.2 (Delta) и B.1.1.529 (Omicron)). Сорбцию антигенов (200 нг/лунку) проводили в буфере 0,1 М NaHCO₃. Для выявления антител использовали конъюгат антимышиных антител с пероксидазой хрена в рабочем разведении 1:2000 (SigmaAldrich, США). Для регистрации уровня оптической плотности после добавления субстрата и остановки реакции использовали мультимодальный ридер Thermo Scientific Varioskan LUX при длине волны 450 нм. Титр определяли по значению максимального разведения, при котором сигнал оптической плотности превышал значение оптической плотности лунок с отрицательным контролем более, чем в три раза.

Анализ титров вируснейтрализующих антител. Титры вируснейтрализующих антител определяли при помощи реакции вируснейтрализации. С этой целью были использованы штаммы вируса SARS-CoV-2 Wuhan–hCoV- 19/Australia/VIC01/2020 (Wuhan-Hu-1), Delta– hCoV-19/Russia/PSK-2804/2021 (Delta (B.1.617.2)) и Omicron 1–hCoV-19/Russia/Moscow171619-031221/ 2021 (Omicron (B.1.1.529)), полученные из Госу дарственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. К сывороткам в разных разведениях добавляли вирус в равной пропорции 1:1 и инкубировали 1 час при 37°С. Затем смесь вируса и сыворотки наносили в дублях на монослой культуры клеток Vero в объеме 100 мкл/лунку. Учет результатов проводили визуально. Любое специфическое поражение культуры клеток в лунке учитывали как цитопатическое действие (ЦПД). Титром считали последнее разведение, при котором регистрировали защиту монослоя культуры клеток в лунках от ЦПД вируса. В качестве положительного контроля использовали 20-кратное разведение образца сыворотки крови реконвалесцента COVID-19 с ранее установленным тит ром 1:80. В качестве отрицательного контроля использовали питательную среду.

Статистический анализ. Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 8.0, при этом p < 0,05 считали показателем статистичес кой значимости. Статистическую значимость различий среди разных групп животных определяли с помощью двустороннего непараметрического U-критерия Манна–Уитни с 95% доверительным интервалом или критерия Краскела–Уоллиса (для более чем двух групп).

Метод определения параметров летальных доз. В эксперименте использовали 21 самца белых аутбредных мышей ICR возрастом 7–8 недель, с массой тела 18–20 г. Исследование проводили экспресс-методом определения средней эффективной дозы и ее ошибки по методу Прозоровского [5]. Препарат вводили мышам однократно внутрибрюшинно в дозах 2,0; 1,58; 1,26; 1,0; 0,79; 0,631; 0,51 мг/кг. В течение первых суток и один раз в день в течение 14 суток после введения проводили подсчет павших, животных взвешивали (весы электронные SCOUTII, OHAUS, США) и проводили клинический осмотр. Клинический осмотр включал оценку следующих параметров: темперамент (вялость, агрессия), состояние шерстного покрова (выпадение, взъерошенность), состояние глаз (конъюнктивит, слезотечение, помутнение), моче испускание (потемнение, осветление), экскреция (диспепсия).

Результаты и обсуждение

Адъювантная активность природных полисахаридов хорошо известна и является предметом продолжающихся исследований. Одним из таких природных полимеров являются бета-глюканы из клеточных стенок дрожжей. В работе для получения препарата бета-глюканов, наряду со стандартным подходом, были использованы ферментные комплексы целлюлазы и протеазы в сочетании с обработкой ультразвуком. Оптимизация процесса позволила получить препарат бета-глюканов высокой степени чистоты с выходом до 2 г из 100 г биомассы влажных клеток Saccharomyces cerevisiae.

Оценка адъювантной активности препарата бета-глюканов на лабораторных мышах, иммунизированных белком RBD, показала, что бета-глюканы обладают способностью усиливать выработку специфических и вируснейтрализующих антител. В группе мышей, которым вводили адъювант в дозе 50 мкг, средний обратный титр специфических антител против гомологичного антигена (RBD, вариант Delta) составлял 178 740. В группе, получившей адъювант в дозе 1 мг, этот показатель был на порядок выше и составил 1 115 370. Полученные значения среднего обратного титра антител животных опытных групп близки к значениям параметра в группе, иммунизированной RBD с Al(OH)₃ (рис., А), при этом для дозы 1 мг они были несколько выше. Сходную картину наблюдали при тестировании сывороток с использованием RBD гетерологичного варианта Wuhan-Hu-1. Картина значительно не изменялась и при тестировании с использованием полноразмерных S-белков SARS-CoV-2, хотя в случае варианта Omicron наблюдалось снижение обратных титров в опытных группах мышей.

Рисунок. Анализ гуморального ответа мышей после двукратной иммунизации RBD в комплексе с бета-глюканами

Figure. Analysis of humoral immune response in mice after a double immunization with RBD in combination with beta-Glucans

Примечание. А — обратный титр специфических антител, в качестве антигенов использованы RBD вариантов Wuhan-Hu-1 и Delta (B.1.617.2) и спайковые S-белки вариантов Wuhan-Hu-1, Delta (B.1.617.2) и Omicron (B.1.1.529). Б — обратный титр вируснейтрализующих антител против штаммов вируса SARS-CoV-2: Wuhan–hCoV-19/Australia/VIC01/2020 (Wuhan-Hu-1), Delta-hCoV-19/Russia/PSK-2804/2021 (Delta (B.1.617.2)) и Omicron 1–hCoV-19/Russia/Moscow171619–031221/2021 (Omicron (B.1.1.529)).

Note. A, reverse titers of the specific antibodies against S proteins of Wuhan (Wuhan-Hu-1), Delta (B.1.617.2) and Omicron (B.1.1.529) virus variants. B, reciprocal titers of the virus-neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 virus strains: Wuhan–hCoV-19/Australia/VIC01/2020 (Wuhan-Hu-1), Delta–hCoV-19/Russia/PSK-2804/2021 (Delta (B.1.617.2)), and Omicron 1–hCoV-19/Russia/Moscow171619–031221/2021 (Omicron (B.1.1.529)).

Анализ вируснейтрализующей активности сывороток показал, что титры нейтрализующих антител в крови мышей, иммунизированных RBD в сочетании с бета-глюканами, в отношении штаммов hCoV-19/Australia/VIC01/2020 (Wuhan) и hCoV-19/Russia/PSK-2804/2021 (Delta) сравнимы, в то время как в отношении hCoV-19/Russia/Moscow171619-031221/2021 (Omicron) существенно ниже (рис., Б). Титры вируснейтрализующих антител в группе мышей, иммунизированной только RBD, были ниже, чем в группах с адъювантом. При этом наблюдалась схожая тенденция повышения значений показателя при увеличении дозы адъюванта с 50 мкг до 1 мг. Как и в случае специфических антител, титры вируснейтрализующих антител были сравнимы с их уровнем в группе, иммунизированной RBD с Al(OH)₃.

Анализ токсичности препарата бета-глюканов показал, что среднесмертельная доза препарата (ЛД₅₀) составила 1,12 (1,0–1,26) г/ кг, максимально переносимая доза (МПД) — 0,79 г/кг, а летальная доза (ЛД₁₀₀) — 1,58 г/кг. В соответствии с классификацией токсичности веществ при введении в брюшную полость животного (по К.К. Сидорову) [2, 4] можно констатировать, что препарат относится к практически нетоксичным веществам.

Заключение

В результате данной работы разработана схема получения препарата бета-глюканов из клеточных стенок дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Исследованы адъювантные свойства полученного препарата и показано, что наибольшая адъювантная активность достигается при использовании дозы бета-глюканов 1 мг/мышь. Обратные титры специфических антител крови мышей, иммунизированных RBD в сочетании с препаратом бета-глюканов, были сравнимы или превышали титры антител в группе животных, иммунизированных RBD с гидроксидом алюминия. Сыворотки крови, полученные от животных, иммунизированных RBD либо RBD в сочетании с бета-глюканами, нейтрализовали как гомологичные, так и гетерологичные штаммы SARS-CoV-2. Исследование токсических свойств препарата бета-глюканов показало, что препарат может быть отнесен к классу практически нетоксичных веществ.

Об авторах

Екатерина Александровна Волосникова

ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора

Автор, ответственный за переписку.
Email: volosnikova_ea@vector.nsc.ru

кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник, зав. лабораторией получения и анализа биосубстанций