Вариативность изменений про- и противовоспалительных цитокинов на фоне дефицита IFNα и IFNγ у пациентов с постковидным синдромом, ассоциированным с активацией хронических герпесвирусных инфекций

Полный текст

Введение

Многогранный характер постковидного синдрома (ПКС) обусловливает ряд сложных иммунопатофизиологических механизмов, таких как: иммунная дисрегуляция, синдром системного воспалительного ответа, повреждение сосудов микроциркуляторного русла, аутоиммунные процессы, вегетативная и нервная дисфункции, прямое цитотоксическое действие вируса на клетки и его длительная персистенция [10].

При COVID-19 задействовано большое количество одновременно действующих факторов, которые индуцируются неадекватным уровнем про- и противовоспалительных цитокинов и в конечном итоге определяют исход COVID-19. При этом иммунная система может перейти как в стадию длительной активации врожденного и адаптивного иммунитета, так и в стадию иммуносупрессии. Эти дисрегуляторные процессы поддерживают синдром стойкого мультисистемного воспаления, часто наблюдаемого после перенесенного тяжелого инфекционного процесса, и являются одной из предполагаемых причин стойкого постковидного синдрома (ПКС) [11]. Появление симптомов нейроиммуновоспаления предположительно состоит в том, что SARS-CoV-2 избирательно заражает нейроны и, перейдя в латентное состояние с низкой репликативной активностью, может поддерживать состояние, характерное для ПКС. Пациенты с ПКС часто подвержены коинфекциям, например, герпес-вирусным, которые могут часто реактивироваться, в том числе при стрессовой ситуации, и дополнительно негативно влиять на иммунную систему [9].

При ПКС включается множество иммунопатофизиологических механизмов, ведущих к мультисистемному поражению органов и тканей: синдром хронической усталости (СХУ), когнитивные расстройства (КР), миалгический энцефаломиелит (МЭ). На фоне гиперактивации иммунной системы развиваются иммунотромбозы и коагулопатии с участием нейтрофилов, формирующих NET, и активированных тромбоцитов [8, 12].

Характерной особенностью ПКС является его затяжной, волнообразный и часто рецидивирующий характер, что существенно ухудшает физическую активность и качество жизни пациентов. Астения различной степени тяжести, характеризующаяся постоянным ощущением усталости, не проходящей после отдыха, повышенная утомляемость даже при незначительных нагрузках и снижение работоспособности являются наиболее частыми жалобами пациентов с ПКС. КР проявляются затруднениями с запоминанием и освоением новой информации, снижением концентрации внимания, ухудшением умственной работоспособности, ощущением «тумана в голове» [2].

Разнообразные проявления ПКС непредсказуемы и опасны, поэтому крайне важно оценить у таких пациентов развитие симптоматики, часто сопровождающей течение тяжелых вирусных инфекций с развитием СХУ и КР [5].

При ПКС дисрегуляторные нарушения в противовирусной иммунной защите могут проявляться истощением и функциональной неполноценностью клеток врожденного и адаптивного иммунитета с последующим прогрессированием нарушений молекулярных механизмов, связанных с продукцией интерферона (IFN). При этом, у пациентов в остром периоде COVID-19 и на этапе выздоровления наблюдаются блокада продукции IFNα и IFNγ, повышение уровня нейтрофил-ассоциированных цитокинов, изменение содержания и фенотипа субпопуляций НГ, нарушение их функций [3]. Многочисленные исследования показали, что SARS-CoV-2 индуцирует реактивацию герпесвирусов — вируса Эпштейна–Барр (ВЭБ), цитомегаловируса (ЦМВ), вируса герпеса человека 6 типа (ВЧГ6) [14]. Коинфекция SARS-CoV-2 и герпесвирусов может утяжелять течение каждого из вызываемых данными вирусами заболеваний [13]. Кроме того, у пациентов с хроническими активными герпесвирусными инфекция ми с локальными и системными проявлениями присутствуют различные дисрегуляторные нарушения в противовирусной иммунной защите и системе IFN, усугубляющие состояние иммунокомпрометированности у пациентов с ПКС [4].

Диагностика ПКС основывается на характерных симптомах и данных анамнеза, а также проведении дифференциальной диагностики для исключения других возможных причин данного состояния. Лечение ПКС направлено на облегчение симптомов и улучшение качества жизни пациентов, оно может включать в себя медикаментозную терапию, иммунотерапию и когнитивную реабилитацию. Важно отметить, что ПКС может иметь значительное влияние на повседневную жизнь пациентов, снижая их социальную активность, трудоспособность и общее благополучие.

Цель — уточнить уровни сывороточных про- и противовоспалительных цитокинов, интерферонов альфа и гамма у пациентов с постковидным синдромом, ассоциированным с подтвержденной активацией хронических герпесвирусных инфекций.

Материалы и методы

В группу исследования (ГИ) вошли 60 пациентов (28 женщин, 32 мужчин) в возрасте от 18 до 65 лет, испытывающих различные симптомы и проявления ПКС, ассоциированного с ГВИ, спустя 12 и более недель после перенесенной SARSCoV-2 инфекции. Анамнестически установлено, что вирус SARS-CoV-2 в остром периоде COVID-19 был идентифицирован в 100% случаев ПЦР-тестом. Сформирована группа сравнения (ГС), состоящая из 60 условно-здоровых лиц, сопоставимых по полу и возрасту.

У пациентов ГИ был собран подробный анамнез жизни и заболевания, применялись методы физикального обследования, а также проводилось анкетирование по модифицированной шкале-опроснику для оценки тяжести симптомов ПКС в баллах от 0 до 4 [4].

Для выявления реактивации хронических ГВИ (ВЭБ, ВПГ1/2, ВЧГ6, ВЧГ8, ЦМВ) с целью их детекции проводили ПЦР реального времени (ПЦР-РВ) в слюне и соскобе с миндалин набором «АмплиПрайм» с помощью амплификатора детектирующего QuantStudio 5. Для оценки состояния иммунного ответа на реактивацию ГВИ, выявления интерферонового статуса и цитокинового профиля у пациентов с ПКС, ассоциированным с ГВИ, определяли уровень IFN I и II типов, а также нейтрофил-ассоциированных про- (TNFα, IL-18, IL-1β, IL-6, IL-17А, IL-8) и противовоспалительных (IL-4 и IL-10) цитокинов в сыворотке крови наборами «Вектор-Бест» методом твердофазного ИФА с помощью анализатора StatFax 4200 (Awareness Technology, США).

Результаты и обсуждение

В ходе анкетирования было показано, что клинические проявления СХУ и КР различной степени выраженности выявлялись у 100% исследуемых пациентов ГИ. Согласно модифицированной нами 5-балльной шкале (0 баллов — отсутствие симптомов; 1 балл — минимальные симптомы; 2 балла — средняя выраженность симптомов; 3 балла — тяжелая степень; 4 балла — очень тяжелая степень), общее количество баллов в ГИ составило 17,0 (15,25–19,75) баллов, что в 17 раз больше, чем в ГС — 1,0 балл (0,5–2,0) (р < 0,05) (табл. 1).

 

Таблица 1. Выраженность клинических проявлений постковидного синдрома у пациентов, перенесших COVID-19 (в баллах) (Me (Q₁; Q₃))

Table 1. Severity of clinical manifestations of postcovid syndrome in patients who underwent COVID-19 (in points) (Me (Q₁; Q₃))

Симптомы   Symptoms	Группа сравнения (ГС) Comparison Group n = 60	Группа исследования (ГИ) Study Group n = 60
	Me (Q₁; Q₃)	Me (Q₁; Q₃)
Синдром хронической усталости, непереносимость физической нагрузки, снижение работоспособности, повышенная утомляемость Chronic fatigue syndrome, exercise intolerance, decreased performance, increased fatigue	0,5 (0,1; 1,0)	3,0 (2,0; 3,0)*
Снижение процессов запоминания, трудности с концентрацией внимания, ощущение «тумана в голове» Reduced memorization processes, difficulty concentrating, “brain fog”	0,0 (0,0; 0,0)	3,0 (2,0; 3,0)*
Головная боль, головокружение, мигрень Headache, dizziness, migraine	0,5 (0,1; 1,0)	2,0 (2,0; 3,0)*
Артралгии, миалгии Arthralgia, myalgia	0,0 (0,0; 0,0)	2,0 (1,0; 3,0)*
Панические атаки, расстройства настроения, эмоциональная лабильность, психогенная депрессия Panic attacks, mood disorders, emotional lability, psychogenic depression	0,0 (0,0; 0,0)	2,0 (2,0; 2,0)*
Нарушения засыпания и сна Falling asleep and sleep disorders	0,0 (0,0; 0,0)	2,0 (2,0; 2,0)*
Повышенная потливость, субфебрилитет Excessive sweating, subfebrility	0,0 (0,0; 0,0)	1,0 (1,0; 2,0)*
Кашель и одышка Cough and shortness of breath	0,0 (0,0; 0,0)	1,0 (0,0; 1,0)
Клинические проявления герпесвирусных инфекций Clinical manifestations of herpesvirus infections	0,0 (0,0; 0,0)	1,0 (0,0; 2,0)*
Общее количество баллов Total number of points	1,0 (0,5; 2, 0)	17,0 (15,25; 19,75)*

Примечание. * — значимость отличий от показателей группы сравнения, р < 0,05.

Note. * — the significance of differences from the indicators of the comparison group, p < 0,05.

 

Наиболее навязчивыми жалобами у пациентов ГИ являлись: снижение работоспособности, повышенная утомляемость, снижение толерантности к физическим нагрузкам, стойкое ощущение хронической усталости. Также все пациенты предъявляли жалобы разной степени выраженности на нарушение когнитивных функций в виде снижения процессов запоминания, трудностей с концентрацией внимания, ощущение «тумана в голове», артралгии, миалгии.

При комплексном исследовании пациентов, прошедших анкетирование, были отобраны 38 человек, предъявляющих наиболее выраженные жалобы на симптомы ПКС и набравшие наибольшее количество баллов согласно опроснику, среди них 20 пациентов отмечали клинические проявления ВПГ-инфекции орофациальной локализации. Для определения этиологической структуры ГВИ использовали молекулярно-биологические и серологичес кие методы диагностики. С целью детекции ДНК герпесвирусов ВЭБ, ВПГ1/2, ВЧГ6, ВЧГ8, ЦМВ в соскобе с миндалин и слюне использовался метод ПЦР-РВ. Для определения наличия и уровня гуморального иммунного ответа на герпесвирусные инфекции применялся метод ИФА-диагностики: ВЭБ (IgG VCA, IgG EBNA), ВПГ1/2 (IgG HSV 1/2), ВЧГ6 (IgG HHV6), ВЧГ8 (IgG HHV8), ЦМВ (IgG CMV). Сопоставление полученных данных способствовало адекватной полноценной диагностике, подтверждающей реактивацию хронических ГВИ.

Анализ полученных данных позволил выявить варианты микст-герпесвирусной инфекции (микст-ГВИ) с доминированием ВЭБ, при которых частота встречаемости была следующей: ВЭБ + ВЧГ6 — 5%; ВЭБ + ВПГ1/2 — 28,4%; ВЭБ + ВЧГ6 + ВПГ1/2 — 33,3%; ВЭБ + ВЧГ6 + ВЧГ8 + ВПГ1/2 — 33,3%.

Стоит отметить, что у пациентов с микст-герпесвирусной инфекцией, имеющих детекцию 3 и более вирусов герпеса, с доминированием во всех группах ВЭБ, наблюдались наиболее выраженные и стойкие клинические проявления ПКС, среди которых лидирующее место занимали длительные ощущения СХУ и КР, а выраженность симптомов, согласно опроснику, составила 19 (17–21) баллов. Следует подчеркнуть наиболее важную особенность ГВИ — при динамическом наблюдении у большинства пациентов отмечалась активная репликация ВПГ1/2, ВЭБ, ЦМВ, ВЧГ6, ВЧГ8 даже в период отсутствия некоторых клинических проявлений инфекционного процесса.

Оценка интерферонового статуса позволила выявить снижение уровней IFNα и IFNγ, что подтверждает слабую противовирусную защиту у пациентов с ПКС, что сопровождается активацией ГВИ. Уровень IFNα в ГИ оказался значительно ниже (в 12,4 раза) — 1,4 (1,0–3,9) пг/мл по сравнению с ГС — 17,4 (16,2–25,7) пг/мл (р < 0,05), при этом, показатели IFNγ были ниже в 2,5 раза — 2,3 (1,6–3,35) пг/мл, чем в ГС — 5,7 (5,3–13,9) пг/мл (р < 0,05) (табл. 2).

 

Таблица 2. Цитокиновый профиль пациентов с ПКС, ассоциированным с активацией герпесвирусных инфекций (Me (Q₁; Q₃))

Table 2. Cytokine profile in patients with PACS, associated with activation of herpesvirus infections(Me (Q₁; Q₃))

Показатели Parameter Me (Q₁; Q₃)	Группа сравнения (ГС) Comparison Group (n = 60)	Группа исследования (ГИ) Study Group (n = 60)
IL-1β, пг/мл IL-1β, pg/ml	0,1 (0,01; 0,1)	3,95* (1,6; 5,6)
TNFα, пг/мл TNFα, pg/ml	4,43 (2,6; 4,9)	4,15 (2,1; 5,8)
IL-6, пг/мл IL-6, pg/ml	12,3 (1,9; 13,1)	1,7 (1,2; 2,8) n = 56
		307,7* (197,2; 357,1) n = 4
IL-8, пг/мл IL-8, pg/ml	5,3 (3,5; 5,7)	10,7* (6,4; 16,8)
IL-18, пг/мл IL-18, pg/ml	322,51 (185,5; 381,7)	183 (156,8; 232,9)
IL-17А, пг/мл IL-17А, pg/ml	13,6 (7,7; 21,8)	0,03* (0,01; 0,02) n = 56
		460,95* (374,1; 461,0) n = 4
IL-10, пг/мл IL-10, pg/ml	3 (2,5; 3,3)	3,1 (2,0; 4,9), n = 51 15,6* (12,1; 18,2), n = 9
IL-4, пг/мл IL-4, pg/ml	2,7 (2,2; 2,9)	3,4 (1,7; 4,95), n = 42 20,0* (18,2; 23,3), n = 18
IFNα, пг/мл IFNα, pg/ml	17,4 (16,2; 25,7)	1,4* (1,0; 3,9)
IFNγ, пг/мл IFNγ, pg/ml	5,7 (5,3; 13,9)	2,3* (1,6; 3,35)

Примечание. * — значимость отличий от показателей группы сравнения, р < 0,05.

Note. * — the significance of differences from the indicators of the comparison group, p < 0,05.

 

Анализ результатов исследования цитокинового профиля позволил выявить следующие тенденции: концентрация TNFα в исследуемой группе — 4,15 (2,1–5,8) пг/мл не отличалась от значений ГС — 4,43(2,6–4,9) пг/мл (р > 0,05) так же, как и уровень IL-18 у пациентов ГИ не показал статистически значимой разницы — 183 (156,8–232,9) пг/мл по сравнению с показателями ГС 322,51 (185,5–381,7) пг/мл (р > 0,05). В то же время уровень провоспалительного цитокина IL-1β в ГИ оказался повышенным в 39,5 раз до 3,95 (1,6–5,6) пг/мл против 0,1 (0,01–0,1) пг/ мл (р < 0,05) в ГС. Повышение концентрации IL-1β имеет тесную связь с активацией иммунного ответа по Тh1-пути, что может приводить к воспалительным и деструктивным процессам и являться неблагоприятным фактором для развития нейроиммуновоспаления, лежащего в основе КР [6].

Анализ уровня системного провоспалительного цитокина IL-6 выявил неоднозначный характер изменений: у 56 пациентов ГИ концентрация IL-6 регистрировалась на уровне 1,7 (1,2–2,8) пг/ мл и не отличались от данных ГС (р > 0,05), в то же время у 4 пациентов было выявлено значительное повышение уровня IL-6 в 25 раз — 307,7 (197,2–357,1) пг/мл против ГС 12,3 (1,9–13,1) пг/мл (р < 0,05). Стоит отметить, что высокое содержание уровня IL-6 в периферической крови регистрировалось у пациентов, перенесших тяжелую форму COVID-19 с последующим развитием тяжелого течения ПКС и предъявляющих наиболее выраженные и стойкие жалобы согласно шкале-опроснику — 19 (17–21) баллов, что в 19 раз больше, чем в ГС — 1,0 балл (0,5–2,0) (р < 0,05), и было ассоциировано с микст-ГВИ с доминированием ВЭБ, подтвержденными лабораторными исследованиями.

Исследование IL-17А в ГИ выявило также неоднозначные данные: так, у 56 пациентов было отмечено снижение уровня IL-17А до 0,03 (0,01–0,02) пг/мл, и, напротив, у 4 пациентов с микст-ГВИ регистрировалось повышение IL-17А в 34 раза [460,95 (374,1–461,0)] пг/мл по сравнению с ГС [13,6 (7,7–21,8)] пг/мл (р < 0,05).

Уровень концентрации IL-8 в ГИ был повышен в 2 раза — 10,7 (6,4–16,8) пг/мл по сравнению с ГС 5,3 (3,5–5,7) пг/мл (р < 0,05).

Анализ уровня противовоспалительных цитокинов IL-4 и IL-10 также выявил изменения их концентрации в сыворотке крови. Так, было отмечено повышение уровня IL-4 у 42 пациентов ГИ в 1,3 раза — 3,4 (1,7–4,95) пг/мл, а у 18 пациентов в 7,5 раз — 20,0 (18,2–23,3) пг/мл против ГС 2,7 (2,2–2,9) пг/мл (р_1,2 < 0,05). В то же время показатели IL-10 у 51 пациента составили 3,1 (2,0–4,9) пг/мл и не отличались от ГС (р₁ > 0,05), а у 9 пациентов были повышены в 5,2 раза — 15,6 (12,1–18,2) пг/мл против ГС 3 (2,5–3,3) пг/мл (р < 0,05). Пациенты с повышенным уровнем IL-4 и IL-10 предъявляли различные жалобы на симптомы ПКС среднего и тяжелого вариантов течения, также у данных пациентов отмечалась активация микст-ГВИ с доминированием ВЭБ.

Заключение

Чрезмерные воспалительные реакции, которые являются следствием воздействия SARS-CoV-2, зависят также от наличия или отсутствия сопутствующих заболеваний и характеризуются повышенным высвобождением провоспалительных цитокинов, таких как IL-1β, IL-6, IL-8, IL-17, на фоне недостаточной продукции IFNα и IFNγ, что приводит к формированию «цитокинового шторма», коагулопатии, тромбоэмболии [7, 15].

Ранее нами были показаны данные о дефекте фагоцитарной и микробицидной функциях НГ, что, по нашему мнению, сопряжено с уменьшением уровня IL-17А в сыворотке крови, выявленном в настоящем исследовании [1]. В то же время сохраняющаяся мультисистемная воспалительная реакция подтверждается повышенным уровнем IL-6 и IL-17A, что обусловливает тяжелое течение ПКС. Детектированная гиперпродукция IL-1β сопровождалась клиническими проявлениями стойкого нейроиммуновоспаления в постковидном периоде.

Выявленный дефицит IFNα и IFNγ обусловливает дисрегуляторные нарушения в противовирусной иммунной защите, что способствует активации ГВИ у пациентов с ПКС и, по-видимому, способствует дефектному функционированию НГ у пациентов с ПКС [1]. Позитивная регуляторная роль рекомбинантного IFNα2b на дефектно функционирующие НГ с уменьшением их агрессивного действия у пациентов с ПКС и реактивацией ГВИ была подтверждена нашими экспериментальными исследованиями в системе in vitro [1].

Таким образом, выявленный нами у пациентов в постковидном периоде дисбаланс цитокинов на фоне дефицита IFNα и IFNγ косвенно свидетельствует о развитии нейроиммуновоспаления не только после перенесенного COVID-19, но и при ПКС, ассоциированным с активацией хронических ГВИ с доминированием ВЭБ, что сопровождается такими ведущими клиническими признаками ПКС, как СХУ и КР, нарушающими качество жизни пациентов.

Об авторах

Маргарита Галимовна Атажахова

ФГБОУ ВО Майкопский государственный технологический университет; ФГБОУ ВО Кубанский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения РФ

Автор, ответственный за переписку.
Email: doctor_atazhachova@mail.ru

старший преподаватель кафедры физиологии и общей патологии; аспирант кафедры клинической иммунологии, аллергологии и лабораторной диагностики ФПК и ППС

Россия, 385009, Республика Адыгея, г. Майкоп, ул. Ветеранов, 61; г. Краснодар

Г. А. Чудилова

ФГБОУ ВО Кубанский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения РФ

Email: doctor_atazhachova@mail.ru

доктор биологических наук, доцент, зав. отелом клинико-экспериментальной иммунологии и молекулярной биологии Центральной научно-исследовательской лаборатории, профессор кафедры клинической иммунологии, аллергологии и лабораторной диагностики ФПК и ППС

Россия, г. Краснодар

Л. В. Ломтатидзе

ФГБОУ ВО Кубанский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения РФ

Email: doctor_atazhachova@mail.ru

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отдела клинико-экспериментальной иммунологии и молекулярной биологии Центральной научно-исследовательской лаборатории, доцент кафедры клинической иммунологии, аллергологии и лабораторной диагностики ФПК и ППС

Россия, г. Краснодар

Е. А. Поезжаев

ФГБОУ ВО Кубанский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения РФ

Email: doctor_atazhachova@mail.ru

студент 6 курса педиатрического факультета

Россия, г. Краснодар

Список литературы

Дополнительные файлы