Variability of changes in proand antiinflammatory cytokines due to IFNα and IFNγ deficiency in patients with post-covid syndrome associated with activation of chronic herpes viral infections

Full Text

Введение

Многогранный характер постковидного синдрома (ПКС) обусловливает ряд сложных иммунопатофизиологических механизмов, таких как: иммунная дисрегуляция, синдром системного воспалительного ответа, повреждение сосудов микроциркуляторного русла, аутоиммунные процессы, вегетативная и нервная дисфункции, прямое цитотоксическое действие вируса на клетки и его длительная персистенция [10].

При COVID-19 задействовано большое количество одновременно действующих факторов, которые индуцируются неадекватным уровнем про- и противовоспалительных цитокинов и в конечном итоге определяют исход COVID-19. При этом иммунная система может перейти как в стадию длительной активации врожденного и адаптивного иммунитета, так и в стадию иммуносупрессии. Эти дисрегуляторные процессы поддерживают синдром стойкого мультисистемного воспаления, часто наблюдаемого после перенесенного тяжелого инфекционного процесса, и являются одной из предполагаемых причин стойкого постковидного синдрома (ПКС) [11]. Появление симптомов нейроиммуновоспаления предположительно состоит в том, что SARS-CoV-2 избирательно заражает нейроны и, перейдя в латентное состояние с низкой репликативной активностью, может поддерживать состояние, характерное для ПКС. Пациенты с ПКС часто подвержены коинфекциям, например, герпес-вирусным, которые могут часто реактивироваться, в том числе при стрессовой ситуации, и дополнительно негативно влиять на иммунную систему [9].

При ПКС включается множество иммунопатофизиологических механизмов, ведущих к мультисистемному поражению органов и тканей: синдром хронической усталости (СХУ), когнитивные расстройства (КР), миалгический энцефаломиелит (МЭ). На фоне гиперактивации иммунной системы развиваются иммунотромбозы и коагулопатии с участием нейтрофилов, формирующих NET, и активированных тромбоцитов [8, 12].

Характерной особенностью ПКС является его затяжной, волнообразный и часто рецидивирующий характер, что существенно ухудшает физическую активность и качество жизни пациентов. Астения различной степени тяжести, характеризующаяся постоянным ощущением усталости, не проходящей после отдыха, повышенная утомляемость даже при незначительных нагрузках и снижение работоспособности являются наиболее частыми жалобами пациентов с ПКС. КР проявляются затруднениями с запоминанием и освоением новой информации, снижением концентрации внимания, ухудшением умственной работоспособности, ощущением «тумана в голове» [2].

Разнообразные проявления ПКС непредсказуемы и опасны, поэтому крайне важно оценить у таких пациентов развитие симптоматики, часто сопровождающей течение тяжелых вирусных инфекций с развитием СХУ и КР [5].

При ПКС дисрегуляторные нарушения в противовирусной иммунной защите могут проявляться истощением и функциональной неполноценностью клеток врожденного и адаптивного иммунитета с последующим прогрессированием нарушений молекулярных механизмов, связанных с продукцией интерферона (IFN). При этом, у пациентов в остром периоде COVID-19 и на этапе выздоровления наблюдаются блокада продукции IFNα и IFNγ, повышение уровня нейтрофил-ассоциированных цитокинов, изменение содержания и фенотипа субпопуляций НГ, нарушение их функций [3]. Многочисленные исследования показали, что SARS-CoV-2 индуцирует реактивацию герпесвирусов — вируса Эпштейна–Барр (ВЭБ), цитомегаловируса (ЦМВ), вируса герпеса человека 6 типа (ВЧГ6) [14]. Коинфекция SARS-CoV-2 и герпесвирусов может утяжелять течение каждого из вызываемых данными вирусами заболеваний [13]. Кроме того, у пациентов с хроническими активными герпесвирусными инфекция ми с локальными и системными проявлениями присутствуют различные дисрегуляторные нарушения в противовирусной иммунной защите и системе IFN, усугубляющие состояние иммунокомпрометированности у пациентов с ПКС [4].

Диагностика ПКС основывается на характерных симптомах и данных анамнеза, а также проведении дифференциальной диагностики для исключения других возможных причин данного состояния. Лечение ПКС направлено на облегчение симптомов и улучшение качества жизни пациентов, оно может включать в себя медикаментозную терапию, иммунотерапию и когнитивную реабилитацию. Важно отметить, что ПКС может иметь значительное влияние на повседневную жизнь пациентов, снижая их социальную активность, трудоспособность и общее благополучие.

Цель — уточнить уровни сывороточных про- и противовоспалительных цитокинов, интерферонов альфа и гамма у пациентов с постковидным синдромом, ассоциированным с подтвержденной активацией хронических герпесвирусных инфекций.

Материалы и методы

В группу исследования (ГИ) вошли 60 пациентов (28 женщин, 32 мужчин) в возрасте от 18 до 65 лет, испытывающих различные симптомы и проявления ПКС, ассоциированного с ГВИ, спустя 12 и более недель после перенесенной SARSCoV-2 инфекции. Анамнестически установлено, что вирус SARS-CoV-2 в остром периоде COVID-19 был идентифицирован в 100% случаев ПЦР-тестом. Сформирована группа сравнения (ГС), состоящая из 60 условно-здоровых лиц, сопоставимых по полу и возрасту.

У пациентов ГИ был собран подробный анамнез жизни и заболевания, применялись методы физикального обследования, а также проводилось анкетирование по модифицированной шкале-опроснику для оценки тяжести симптомов ПКС в баллах от 0 до 4 [4].

Для выявления реактивации хронических ГВИ (ВЭБ, ВПГ1/2, ВЧГ6, ВЧГ8, ЦМВ) с целью их детекции проводили ПЦР реального времени (ПЦР-РВ) в слюне и соскобе с миндалин набором «АмплиПрайм» с помощью амплификатора детектирующего QuantStudio 5. Для оценки состояния иммунного ответа на реактивацию ГВИ, выявления интерферонового статуса и цитокинового профиля у пациентов с ПКС, ассоциированным с ГВИ, определяли уровень IFN I и II типов, а также нейтрофил-ассоциированных про- (TNFα, IL-18, IL-1β, IL-6, IL-17А, IL-8) и противовоспалительных (IL-4 и IL-10) цитокинов в сыворотке крови наборами «Вектор-Бест» методом твердофазного ИФА с помощью анализатора StatFax 4200 (Awareness Technology, США).

Результаты и обсуждение

В ходе анкетирования было показано, что клинические проявления СХУ и КР различной степени выраженности выявлялись у 100% исследуемых пациентов ГИ. Согласно модифицированной нами 5-балльной шкале (0 баллов — отсутствие симптомов; 1 балл — минимальные симптомы; 2 балла — средняя выраженность симптомов; 3 балла — тяжелая степень; 4 балла — очень тяжелая степень), общее количество баллов в ГИ составило 17,0 (15,25–19,75) баллов, что в 17 раз больше, чем в ГС — 1,0 балл (0,5–2,0) (р < 0,05) (табл. 1).

 

Таблица 1. Выраженность клинических проявлений постковидного синдрома у пациентов, перенесших COVID-19 (в баллах) (Me (Q₁; Q₃))

Table 1. Severity of clinical manifestations of postcovid syndrome in patients who underwent COVID-19 (in points) (Me (Q₁; Q₃))

Симптомы   Symptoms	Группа сравнения (ГС) Comparison Group n = 60	Группа исследования (ГИ) Study Group n = 60
	Me (Q₁; Q₃)	Me (Q₁; Q₃)
Синдром хронической усталости, непереносимость физической нагрузки, снижение работоспособности, повышенная утомляемость Chronic fatigue syndrome, exercise intolerance, decreased performance, increased fatigue	0,5 (0,1; 1,0)	3,0 (2,0; 3,0)*
Снижение процессов запоминания, трудности с концентрацией внимания, ощущение «тумана в голове» Reduced memorization processes, difficulty concentrating, “brain fog”	0,0 (0,0; 0,0)	3,0 (2,0; 3,0)*
Головная боль, головокружение, мигрень Headache, dizziness, migraine	0,5 (0,1; 1,0)	2,0 (2,0; 3,0)*
Артралгии, миалгии Arthralgia, myalgia	0,0 (0,0; 0,0)	2,0 (1,0; 3,0)*
Панические атаки, расстройства настроения, эмоциональная лабильность, психогенная депрессия Panic attacks, mood disorders, emotional lability, psychogenic depression	0,0 (0,0; 0,0)	2,0 (2,0; 2,0)*
Нарушения засыпания и сна Falling asleep and sleep disorders	0,0 (0,0; 0,0)	2,0 (2,0; 2,0)*
Повышенная потливость, субфебрилитет Excessive sweating, subfebrility	0,0 (0,0; 0,0)	1,0 (1,0; 2,0)*
Кашель и одышка Cough and shortness of breath	0,0 (0,0; 0,0)	1,0 (0,0; 1,0)
Клинические проявления герпесвирусных инфекций Clinical manifestations of herpesvirus infections	0,0 (0,0; 0,0)	1,0 (0,0; 2,0)*
Общее количество баллов Total number of points	1,0 (0,5; 2, 0)	17,0 (15,25; 19,75)*

Примечание. * — значимость отличий от показателей группы сравнения, р < 0,05.

Note. * — the significance of differences from the indicators of the comparison group, p < 0,05.

 

Наиболее навязчивыми жалобами у пациентов ГИ являлись: снижение работоспособности, повышенная утомляемость, снижение толерантности к физическим нагрузкам, стойкое ощущение хронической усталости. Также все пациенты предъявляли жалобы разной степени выраженности на нарушение когнитивных функций в виде снижения процессов запоминания, трудностей с концентрацией внимания, ощущение «тумана в голове», артралгии, миалгии.

При комплексном исследовании пациентов, прошедших анкетирование, были отобраны 38 человек, предъявляющих наиболее выраженные жалобы на симптомы ПКС и набравшие наибольшее количество баллов согласно опроснику, среди них 20 пациентов отмечали клинические проявления ВПГ-инфекции орофациальной локализации. Для определения этиологической структуры ГВИ использовали молекулярно-биологические и серологичес кие методы диагностики. С целью детекции ДНК герпесвирусов ВЭБ, ВПГ1/2, ВЧГ6, ВЧГ8, ЦМВ в соскобе с миндалин и слюне использовался метод ПЦР-РВ. Для определения наличия и уровня гуморального иммунного ответа на герпесвирусные инфекции применялся метод ИФА-диагностики: ВЭБ (IgG VCA, IgG EBNA), ВПГ1/2 (IgG HSV 1/2), ВЧГ6 (IgG HHV6), ВЧГ8 (IgG HHV8), ЦМВ (IgG CMV). Сопоставление полученных данных способствовало адекватной полноценной диагностике, подтверждающей реактивацию хронических ГВИ.

Анализ полученных данных позволил выявить варианты микст-герпесвирусной инфекции (микст-ГВИ) с доминированием ВЭБ, при которых частота встречаемости была следующей: ВЭБ + ВЧГ6 — 5%; ВЭБ + ВПГ1/2 — 28,4%; ВЭБ + ВЧГ6 + ВПГ1/2 — 33,3%; ВЭБ + ВЧГ6 + ВЧГ8 + ВПГ1/2 — 33,3%.

Стоит отметить, что у пациентов с микст-герпесвирусной инфекцией, имеющих детекцию 3 и более вирусов герпеса, с доминированием во всех группах ВЭБ, наблюдались наиболее выраженные и стойкие клинические проявления ПКС, среди которых лидирующее место занимали длительные ощущения СХУ и КР, а выраженность симптомов, согласно опроснику, составила 19 (17–21) баллов. Следует подчеркнуть наиболее важную особенность ГВИ — при динамическом наблюдении у большинства пациентов отмечалась активная репликация ВПГ1/2, ВЭБ, ЦМВ, ВЧГ6, ВЧГ8 даже в период отсутствия некоторых клинических проявлений инфекционного процесса.

Оценка интерферонового статуса позволила выявить снижение уровней IFNα и IFNγ, что подтверждает слабую противовирусную защиту у пациентов с ПКС, что сопровождается активацией ГВИ. Уровень IFNα в ГИ оказался значительно ниже (в 12,4 раза) — 1,4 (1,0–3,9) пг/мл по сравнению с ГС — 17,4 (16,2–25,7) пг/мл (р < 0,05), при этом, показатели IFNγ были ниже в 2,5 раза — 2,3 (1,6–3,35) пг/мл, чем в ГС — 5,7 (5,3–13,9) пг/мл (р < 0,05) (табл. 2).

 

Таблица 2. Цитокиновый профиль пациентов с ПКС, ассоциированным с активацией герпесвирусных инфекций (Me (Q₁; Q₃))

Table 2. Cytokine profile in patients with PACS, associated with activation of herpesvirus infections(Me (Q₁; Q₃))

Показатели Parameter Me (Q₁; Q₃)	Группа сравнения (ГС) Comparison Group (n = 60)	Группа исследования (ГИ) Study Group (n = 60)
IL-1β, пг/мл IL-1β, pg/ml	0,1 (0,01; 0,1)	3,95* (1,6; 5,6)
TNFα, пг/мл TNFα, pg/ml	4,43 (2,6; 4,9)	4,15 (2,1; 5,8)
IL-6, пг/мл IL-6, pg/ml	12,3 (1,9; 13,1)	1,7 (1,2; 2,8) n = 56
		307,7* (197,2; 357,1) n = 4
IL-8, пг/мл IL-8, pg/ml	5,3 (3,5; 5,7)	10,7* (6,4; 16,8)
IL-18, пг/мл IL-18, pg/ml	322,51 (185,5; 381,7)	183 (156,8; 232,9)
IL-17А, пг/мл IL-17А, pg/ml	13,6 (7,7; 21,8)	0,03* (0,01; 0,02) n = 56
		460,95* (374,1; 461,0) n = 4
IL-10, пг/мл IL-10, pg/ml	3 (2,5; 3,3)	3,1 (2,0; 4,9), n = 51 15,6* (12,1; 18,2), n = 9
IL-4, пг/мл IL-4, pg/ml	2,7 (2,2; 2,9)	3,4 (1,7; 4,95), n = 42 20,0* (18,2; 23,3), n = 18
IFNα, пг/мл IFNα, pg/ml	17,4 (16,2; 25,7)	1,4* (1,0; 3,9)
IFNγ, пг/мл IFNγ, pg/ml	5,7 (5,3; 13,9)	2,3* (1,6; 3,35)

Примечание. * — значимость отличий от показателей группы сравнения, р < 0,05.

Note. * — the significance of differences from the indicators of the comparison group, p < 0,05.

 

Анализ результатов исследования цитокинового профиля позволил выявить следующие тенденции: концентрация TNFα в исследуемой группе — 4,15 (2,1–5,8) пг/мл не отличалась от значений ГС — 4,43(2,6–4,9) пг/мл (р > 0,05) так же, как и уровень IL-18 у пациентов ГИ не показал статистически значимой разницы — 183 (156,8–232,9) пг/мл по сравнению с показателями ГС 322,51 (185,5–381,7) пг/мл (р > 0,05). В то же время уровень провоспалительного цитокина IL-1β в ГИ оказался повышенным в 39,5 раз до 3,95 (1,6–5,6) пг/мл против 0,1 (0,01–0,1) пг/ мл (р < 0,05) в ГС. Повышение концентрации IL-1β имеет тесную связь с активацией иммунного ответа по Тh1-пути, что может приводить к воспалительным и деструктивным процессам и являться неблагоприятным фактором для развития нейроиммуновоспаления, лежащего в основе КР [6].

Анализ уровня системного провоспалительного цитокина IL-6 выявил неоднозначный характер изменений: у 56 пациентов ГИ концентрация IL-6 регистрировалась на уровне 1,7 (1,2–2,8) пг/ мл и не отличались от данных ГС (р > 0,05), в то же время у 4 пациентов было выявлено значительное повышение уровня IL-6 в 25 раз — 307,7 (197,2–357,1) пг/мл против ГС 12,3 (1,9–13,1) пг/мл (р < 0,05). Стоит отметить, что высокое содержание уровня IL-6 в периферической крови регистрировалось у пациентов, перенесших тяжелую форму COVID-19 с последующим развитием тяжелого течения ПКС и предъявляющих наиболее выраженные и стойкие жалобы согласно шкале-опроснику — 19 (17–21) баллов, что в 19 раз больше, чем в ГС — 1,0 балл (0,5–2,0) (р < 0,05), и было ассоциировано с микст-ГВИ с доминированием ВЭБ, подтвержденными лабораторными исследованиями.

Исследование IL-17А в ГИ выявило также неоднозначные данные: так, у 56 пациентов было отмечено снижение уровня IL-17А до 0,03 (0,01–0,02) пг/мл, и, напротив, у 4 пациентов с микст-ГВИ регистрировалось повышение IL-17А в 34 раза [460,95 (374,1–461,0)] пг/мл по сравнению с ГС [13,6 (7,7–21,8)] пг/мл (р < 0,05).

Уровень концентрации IL-8 в ГИ был повышен в 2 раза — 10,7 (6,4–16,8) пг/мл по сравнению с ГС 5,3 (3,5–5,7) пг/мл (р < 0,05).

Анализ уровня противовоспалительных цитокинов IL-4 и IL-10 также выявил изменения их концентрации в сыворотке крови. Так, было отмечено повышение уровня IL-4 у 42 пациентов ГИ в 1,3 раза — 3,4 (1,7–4,95) пг/мл, а у 18 пациентов в 7,5 раз — 20,0 (18,2–23,3) пг/мл против ГС 2,7 (2,2–2,9) пг/мл (р_1,2 < 0,05). В то же время показатели IL-10 у 51 пациента составили 3,1 (2,0–4,9) пг/мл и не отличались от ГС (р₁ > 0,05), а у 9 пациентов были повышены в 5,2 раза — 15,6 (12,1–18,2) пг/мл против ГС 3 (2,5–3,3) пг/мл (р < 0,05). Пациенты с повышенным уровнем IL-4 и IL-10 предъявляли различные жалобы на симптомы ПКС среднего и тяжелого вариантов течения, также у данных пациентов отмечалась активация микст-ГВИ с доминированием ВЭБ.

Заключение

Чрезмерные воспалительные реакции, которые являются следствием воздействия SARS-CoV-2, зависят также от наличия или отсутствия сопутствующих заболеваний и характеризуются повышенным высвобождением провоспалительных цитокинов, таких как IL-1β, IL-6, IL-8, IL-17, на фоне недостаточной продукции IFNα и IFNγ, что приводит к формированию «цитокинового шторма», коагулопатии, тромбоэмболии [7, 15].

Ранее нами были показаны данные о дефекте фагоцитарной и микробицидной функциях НГ, что, по нашему мнению, сопряжено с уменьшением уровня IL-17А в сыворотке крови, выявленном в настоящем исследовании [1]. В то же время сохраняющаяся мультисистемная воспалительная реакция подтверждается повышенным уровнем IL-6 и IL-17A, что обусловливает тяжелое течение ПКС. Детектированная гиперпродукция IL-1β сопровождалась клиническими проявлениями стойкого нейроиммуновоспаления в постковидном периоде.

Выявленный дефицит IFNα и IFNγ обусловливает дисрегуляторные нарушения в противовирусной иммунной защите, что способствует активации ГВИ у пациентов с ПКС и, по-видимому, способствует дефектному функционированию НГ у пациентов с ПКС [1]. Позитивная регуляторная роль рекомбинантного IFNα2b на дефектно функционирующие НГ с уменьшением их агрессивного действия у пациентов с ПКС и реактивацией ГВИ была подтверждена нашими экспериментальными исследованиями в системе in vitro [1].

Таким образом, выявленный нами у пациентов в постковидном периоде дисбаланс цитокинов на фоне дефицита IFNα и IFNγ косвенно свидетельствует о развитии нейроиммуновоспаления не только после перенесенного COVID-19, но и при ПКС, ассоциированным с активацией хронических ГВИ с доминированием ВЭБ, что сопровождается такими ведущими клиническими признаками ПКС, как СХУ и КР, нарушающими качество жизни пациентов.

About the authors

Margarita G. Atazhakhova

Maikop State Technological University; Kuban State Medical University

Author for correspondence.
Email: doctor_atazhachova@mail.ru

Senior Lecturer, Department of Physiology and General Pathology, Postgraduate Student, Department of Clinical Immunology, Allergology and Laboratory Diagnostics of FAT and PRS

Russian Federation, 385009, Republic of Adygea, Maikop, Veteranov str., 61; Krasnodar

G. A. Chudilova

Kuban State Medical University

Email: doctor_atazhachova@mail.ru

DSc (Biology), Associate Professor, Head of the Department of Clinical and Experimental Immunology and Molecular Biology of the Central Research Laboratory, Professor of the Department of Clinical Immunology, Allergology and Laboratory Diagnostics of FAT and PRS

Russian Federation, Krasnodar

L. V. Lomtatidze

Kuban State Medical University

Email: doctor_atazhachova@mail.ru

PhD (Biology), Senior Research Associate of the Department of Department of Clinical and Experimental Immunology and Molecular Biology of the Central Research Laboratory, Associate Professor of the Department of Clinical Immunology, Allergology and Laboratory Diagnostics of FAT and PRS

Russian Federation, Krasnodar

E. A. Poezzhaev

Kuban State Medical University

Email: doctor_atazhachova@mail.ru

6th year Student of Pediatric Faculty

Russian Federation, Krasnodar

References

Supplementary files