Плазмабластный ответ при острой SARS-CoV-2-инфекции

Полный текст

Введение

Плазмабласты представляют собой популяцию коротко живущих B-клеток, которые появляются в циркуляции вскоре после вакцинации и в процессе острой инфекции. Плазмабласты образуются из покоящихся В-лимфоцитов, от которых они отличаются способностью секретировать антитела, что делает их похожими на плазматические клетки. От последних они отличаются поверхностной экспрессией BCR рецептора. В отличие от наивных и коммитированных B-клеток, а также плазматических клеток, плазмабласты способны пролиферировать. Плазмабласты представляют собой терминально дифференцированные клетки, которые могут образовываться в различных точках и ветвях B-клеточного ответа [9]. В частности, плазмабласты могут генерироваться как при фолликулярном, так и экстрафолликулярном пути активации [10]. Плазмабластный ответ является показателем успешности вакцинации, а также помогает в прогнозировании уровня антител после выздоровления или вакцинации [2]. Однако определение и классификация плазмабластов сталкивается с большими экспериментальными и теоретическими трудностями [8]. При острой инфекция SARS-CoV-2 зачастую наблюдается образование большого количества плазмабластов [2], таким образом COVID-19 может являться удобным объектом для изучения плазмабластного ответа.

Материалы и методы

В исследование были включены пациенты (n = 28), получавшие стационарное лечение в ФНКЦ ФМБА России. Всем пациентам был поставлен диагноз COVID-19 на основании данных ПЦР-анализа. На момент обследования все пациенты находились в реанимационном отделении и характеризовались тяжелой формой COVID-19. Клиническое исследование выполнено в соответствии с Хельсинской декларацией Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека». Все пациенты подписали добровольное информированное согласие на участие в исследовании. Протокол исследования был рассмотрен и одобрен Этическим комитетом ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России (протокол № 12-1, 29 декабря 2020 г.). Пациенты были в возрасте от 19 до 65 лет (медиана — 45 лет), из них 15 мужчин (53,6%) и 13 женщин (46,4%). В группу сравнения были включены соотносимые по возрасту здоровые доноры (n = 12). Забор крови для исследования проводили однократно на 10–18-е сутки с момента госпитализации.

Для окрашивания лимфоцитов использовали антитела CD19-FITC, CD27-PECy5.5, CD38-PECy7, CD138-APC, анти-IgG-FITC, анти-IgM-FITC, а также белок RBD-PE. Флуоресценцию клеток регистрировали с помощью проточного цитометра CytoFLEX S (Beckman Coulter, США). Клетки сортировали на проточном сортировщике SH800S (Sony Biotechnology, США). ELISpot проводили как описано ранее [1].

Экспериментальные данные обрабатывали с использованием программы GraphPad Prism. Значимость различий между выборками оценивали с помощью критерия Манна–Уитни и критерия Уилкоксона.

Различия сравниваемых параметров считали статистически значимыми при p < 0,05. Экспериментальные данные на графиках представляли в виде медианы (столбы) и межквартильного размаха (25-й и 75-й процентили; усы).

Результаты и обсуждение

Одним из самых ранних проявлений B-клеточного ответа является появление циркулирующих тотальных и антигенспецифических плазмабластов [4]. Мы определяли плазмабласты как CD19⁺ клетки с высокой экспрессией антигенов CD27 и CD38. У здоровых доноров регистрировалось небольшое количество плазмабластов (медиана 1,42%, межквартильный размах от 0,58 до 1,97%). Этот уровень плазмабластов может объяснятся фоновой активацией В-лимфоцитов неопределенным кругом антигенов. У пациентов с COVID-19 наблюдалось примерно четырехкратное повышение уровня плазмабластов (медиана 4,03; межквартильный размах от 2,91 до 6,99%; p < 0,0001) (рис. 1А). Еще более выраженное превышение над отрицательным контролем наблюдалось для RBD-специфичных плазмабластов (медиана 8,03; межквартильный размах от 3,81 до 17,38%) (рис. 1Б).

 

Рисунок 1. Показатели плазмабластного ответа у пациентов страдающих COVID-19

Figure 1. Indicators of plasmablast response in patients with COVID-19 

Примечание.  А — Доля общих плазмабластов (CD27⁺CD38⁺) в популяции CD19+ клеток (справа).
Для сравнения приведены данные из группы здоровых доноров (слева). Б — доля RBD-специфических В-клеток в популяциях плазмабластов (слева) и В-клеток памяти (справа). Пунктирной линией обозначен  базовый уровень у здоровых доноров. В — доля клеток, экспрессирующих поверхностный IgM (слева) или IgG (справа), в популяции плазмабластов. Г — доля CD138+ клеток в популяциях плазмабластов (слева) и В-клеток памяти (справа). Цифрами указаны медианы% позитивных клеток. *** — p < 0,001, **** — p < 0, 0001.
Note. A — Proportion of total plasmablasts (CD27⁺CD38⁺) in the population of CD19+ cells. For comparison, data from a group of healthy donors are presented. B — proportion of RBD-specific B cells in the populations of plasmablasts (left) and memory B cells (right). The dotted line indicates the baseline level in healthy donors. C — proportion of cells expressing surface IgM (left) or IgG (right) in the plasmablast population. D — proportion of CD138+ cells in the populations of plasmablasts (left) and memory B cells (right). The numbers indicate the median% of positive cells. *** — p < 0.001, **** — p < 0.0001.

 

Рисунок 2.  Репрезентативный ELISpot, показывающий клетки, секретирующие антитела IgM (слева) или IgG (справа), в популяциях CD138⁺ (верхний ряд) и CD138^– (нижний ряд) плазмабластов.

Figure 2. Representative ELISpot showing cells secreting IgM (left) or IgG antibodies (right) in the CD138⁺ (top row) and CD138^– (bottom row) plasmablast populations.
Примечание. Цифры, указанные над лунками, указывают количество положительных клеток, общее количество клеток в лунке и процент положительных клеток.
Note. The numbers above the wells indicate the number of positive cells, the total number of cells in the well, and the percentage of positive cells.

 

При этом доля RBD-специфичных лимфоцитов среди B-клеток памяти находилась на уровне 0,48% (межквартильный размах от 0,15 до 0,97%), что немного превышало базовый уровень у здоровых доноров (0,2%). Это свидетельствует том, что к моменту забора крови (10–18 дни) антигенспецифические B-клетки памяти еще не сформировались и плазмабласты представляли единственный тип B-клеток, которые обеспечивали гуморальный иммунитет у пациентов в острой фазе SARS-CoV-2-инфекции. По своему составу плазмабласты в основном являлись IgM⁺ клетками (медиана 35,55; межквартильный размах от 13,68 до 45,08%). Доля плазмабластов с поверхностным IgG была значительно ниже (медиана 5,37; межквартильный размах от 3,33 до 13,28%; p < 0,0001). Такое распределение между изотипами B-клеточных рецепторов BCR соответствует первичному характеру иммунного ответа при COVID-19. Обращает на себя внимание, что сумма долей IgM⁺ и IgG⁺ клеток равнялось примерно 40%. Ограничением нашего исследования являлось то, что мы не учитывали долю IgA⁺ клеток, однако даже с учетом этих клеток суммарная доля Ig⁺ клеток будет заметно ниже 100%. Мы предполагаем, что в популяции плазмабластов присутствуют как более ранние (sIg⁺), так и более поздние (sIg⁻) клетки. Для того чтобы оценить долю более поздних плазмабластов мы определили количество CD138⁺ клеток. Действительно довольно значительная часть плазмабластов (медиана 27,40; межквартильный размах от 19,78 до 53,13%; рис. 1Г) несла этот маркер поздней стадии созревания плазмабластов, который более характерен для плазматических клеток.

 

При этом следует отметить, что у 4-х пациентов доля CD138⁺ клеток была выше 40%. Среди B-клеток памяти доля CD138⁺ клеток не превышала 5%, что соответствовало порогу детекции этого параметра. Таким образом вполне вероятно, что среди циркулирующих плазмабластов заметную долю составляют поздние плазмабласты, которые характеризуются отсутствием поверхностного BCR, но которые несут антиген CD138. В нескольких случаях популяция CD27⁺CD38⁺ была разделена по экспрессии антигена CD138. На рис. 2А представлены репрезентативные ELISpot данные, которые показывают клетки, секретирующие антитела IgM (слева) или IgG (справа) в популяциях CD138⁺ и CD138⁻ плазмабластов. Судя по полученным данным, заметная доля как среди ранних, так и более поздних плазмабластов являлись антителосекретирующими клетками.

Плазмабласты являются популяцией В-лим фоцитов, которая сочетает в себе функциональные активности, характерные для оппозитных популяций В-лимфоцитов. В силу этого обстоятельства классификация плазмабластов и их позиционирование в общей схеме B-клеточного ответа сталкивается со значительными трудностями. Распространенным мнением является то, что плазмабласты представляют собой терминально дифференцированные клетки и, что они не превращаются ни в B-клетки памяти, ни плазматические клетки [6]. Однако в некоторых случаях, например, при инфекции малярийного плазмодия, было показано, что плазмабласты могут образовываться из B-клеток памяти [7] или быть предшественниками плазматических клеток [5].

В настоящей работе показано, что при SARS-CoV-2-инфекции, протекающей в тяжелой форме, развивается выраженный плазмабластный ответ. Циркулирующие плазмабласты характеризуются экспрессией поверхностных IgM и IgG и секрецией соответствующих антител. Среди плазмабластов можно выделить как ранние, так и более поздние популяции.

Плазмабласты, B-клетки герминативных центров, B-клетки памяти и плазматические клетки представляют собой различные ветви и стадии B-клеточного иммунитета. Определение того, как эти популяции взаимодействуют между собой, имеет первостепенное значение для разработки методов лечения COVID-19 и для создания перспективных вакцин против SARS-CoV-2-инфекции.

Об авторах

Мария Георгиевна Бязрова

ФГБУН ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА; ФГАОУ ВО Российский университет дружбы народов имени Патриса Лумумбы

Автор, ответственный за переписку.
Email: mbyazrova@list.ru

научный сотрудник лаборатории иммунохимии

Россия, 115522, Москва, Каширское ш., 24; Москва, улица Миклухо-Маклая, 6

М. М. Сухова

ФГБУН ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА; ФГБОУ ВО Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: mbyazrova@list.ru

младший научный сотрудник лаборатории иммунохимии

Россия, 115522, Москва, Каширское ш., 24; 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1

А. А. Михайлов

ФГБУН ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА; ФГБОУ ВО Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: mbyazrova@list.ru

лаборант лаборатории иммунохимии, студент кафедры иммунология

Россия, 115522, Москва, Каширское ш., 24; 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1

А. Ф. Романова

ФГБОУ ВО Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: mbyazrova@list.ru

младший научный сотрудник лаборатории иммунохимии

Россия, 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1

Г. М. Юсубалиева

Федеральный научно-клинический центр специализированных видов медицинской помощи и медицинских технологий ФМБА

Email: mbyazrova@list.ru

кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории клеточных технологий

Россия, Москва

А. В. Филатов

ФГБУН ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА; ФГБОУ ВО Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: mbyazrova@list.ru
Россия, 115522, Москва, Каширское ш., 24; 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1

Список литературы

Дополнительные файлы