Идентификация и определение резистентности к антимикотическим факторам клинических изолятов дрожжей, выделенных при заболевании дыхательных путей

Полный текст

Введение

Дрожжеподобные грибы широко распространены во внешней среде, на листьях и плодах растений, в почве, воде, в организме человека и животных, являются эндосимбионтами насекомых, считаются условно-патогенными, но при определенных условиях способны вызывать как поверхностные, так и инвазийные инфекционные процессы [16]. Кандидамикоз (кандидоз) — известное заболевание кожи и слизистых оболочек полости рта, урогенитального тракта, имеет локальный характер, но при ослаблении иммунитета, способен переходить в генерализованную форму, вызывать опасные для жизни инфекции кровотока, инвазивный кандидоз внутренних органов [14]. Грибы рода Candida являются сапротрофами, входят в состав постоянно живущих в микробиоме здоровых людей микроорганизмов [21], к патогенезу имеет отношение 21 вид, среди которых доминирующим является оппортунистический гриб C. albicans, определяемый в 90% случаев поверхностного и инвазивного кандидомикоза [11]. Реже среди возбудителей инфекционных процессов встречаются виды этого рода C. tropicalis, C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis, C. dubliniensis [11]. Развитие инфекционных процессов, вызванных Candida utilis, до недавнего времени были крайне редки: в литературе встречались единичные публикации, где была показана патогенность этого вида. C. utilis, преимущественно, встречалась в крови у детей в возрасте 0–3 месяцев, длительно находящихся в отделении интенсивной терапии, обнаружена также у людей с ослабленным иммунитетом [4, 29].

Развитию кандидозной инфекции способствуют несколько факторов и видов активности, которые усиливают патогенный потенциал грибка. Среди них наличие молекул адгезии, формирование биопленки [13], способность проникновения кандид в тканевые структуры благодаря морфологической трансформации клеток в гифальную форму [18]. Гифы в тканях распространяются быстрее, чем дрожжевая форма, что облегчает миграцию кандид через поврежденные ткани и является признаком начала образования биопленки с последующим накоплением внеклеточного матрикса [2]. Наличие биопленки уменьшает восприимчивость кандид к антимикотическим препаратам, защищает от факторов иммунитета. Возможность горизонтального переноса генов в биопленке обеспечивает более успешную адаптацию к условиям среды, способствует развитию полирезистентности кандид к антимикотическим препаратам, что затрудняет лекарственную терапию [15, 17, 27]. Перспективным направлением для комплексного лечения при хронических инфекционных заболеваниях, включая кандидоз, может стать применение непатогенных бактерий-антагонистов рода Bacillus или других микроорганизмов, используемых в качестве пробиотиков [20, 28].

Анализ видового состава и свойств патогенных дрожжеподобных грибов, исследование действия антимикотических препаратов на биопленки, сформированные грибами рода Candida, определение механизмов возникновения резистентности к антимикотическим препаратам, поиск новых эффективных антигрибковых препаратов является актуальной задачей современной медицины [8].

Целью настоящей работы является идентификация и определение резистентности к антимикотическим препаратам клинических изолятов дрожжеподобных грибов, ставших причиной тяжелых хронических, генерализованных заболеваний бронхолегочной системы.

Материалы и методы

Дрожжеподобные грибы, использованные в работе: изолят дрожжей Y-1370, выделенный из клинического материала пациента (57 лет) с генерализованной инфекцией и летальным исходом; изолят дрожжей Y-1395, выделенный из мокроты пациентки (78 лет) с диагнозом «Хронический бронхит»; контрольный коллекционный штамм Candida albicans Y-583.

Штаммы бактерий антагонистов: Bacillus subtilis B-652; Bacillus licheniformis В-847, Bacillus subtilis B-1376.

Все перечисленные микроорганизмы хранятся в составе коллекции бактерий, бактериофагов и грибов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.

Для культивирования дрожжей использовали кукурузный агар (г/л): кукурузная мука — 40, пептон — 50, глюкоза — 20, агар — 15, водопроводная вода до 1 л, рН 6,5, и среду Сабуро; для бактерий применяли среду ГРМ (среды производства ФБУН ГНЦ ПМБ, Россия). Инкубирование высевов проводили при 37°С в течение 24–48 ч. Выросшие отдельные колонии микроорганизмов использовали для дальнейшего их изучения.

Морфологию выделенных микроорганизмов исследовали при наблюдении живых и фиксированных, окрашенных препаратов клеток с применением микроскопа Axioskop 40 (Carl Zeiss, Германия). Физиологические и биохимические признаки изолятов дрожжей выполняли стандартными методами, способность к утилизации углеводов учитывали, высевая культуры на среды Гисса [10, 22].

Чувствительность к антибиотическим препаратам определяли диско-диффузионным методом с применением дисков производства НИЦФ (Россия), используя антимикотические препараты с концентрацией (мкг/диск): кетоконазол (20); итраконазол (10); флуконазол (40); клотримазол (10), нистатин (80 ЕД); амфотерицин В (40).

Определение чувствительности выделенных клинических изолятов к секретируемым метаболитам штаммов бацилл B. subtilis и B. licheniformis выполняли методом отсроченного антагонизма [19].

Для определения чувствительности изолятов дрожжей Y-1370 и Y-1395 к антисептикам на агаризованную питательную среду Сабуро в чашку Петри вносили 100 мкл суточной исследуемой культуры с концентрацией клеток 10⁹ КОЕ/мл. В асептических условиях в засеянной среде делали лунки и вносили в каждую по 50 мкл препаратов: «Октенисепт» (Oсtenisept, Германия), «Хлоргексидин биглюканат» 0,05% (Петрофарм, Россия); настойка календулы (ООО «Гиппократ», Россия); настойка эвкалипта (ООО «Косметик Ленд», Россия); 10% масляные экстракты розмарина, сандала, лаванды (Китай). В качестве контроля в лунки вносили по 50 мкл 70% этилового спирта и физиологического раствора. Инкубировали высевы в течение 24–48 ч, при температуре 37°С. Чувствительность микроорганизма к препарату определяли по наличию и размеру зоны угнетения роста вокруг лунки с антисептиком (использованы средние данные по трем повторам опыта).

Таксономическую принадлежность изолятов определяли по суммарным результатам фенотипического и геномного анализа. Для идентификации исследуемых дрожжей молекулярно-генетическими методами использовали ITS (последовательность межгенного рибосомального спейсера). ДНК дрожжей выделяли из суспензий микроорганизмов с использованием набора «ДНК-технология» (ДНК-Tехнология, Россия) по методике производителя. Реакцию амплификации ITS-фрагмента дрожжевой ДНК вели с использованием олигонуклеотидов ITS1 и ITS4 для первого раунда ПЦР (полученный фрагмент ~600 н.п.), ITS3 и ITS4 для второго раунда ПЦР (~300 н.п.) [3]. В качестве матрицы использовали выделенную геномную ДНК, реакцию вели с использованием SP-Taq-ДНК-полимеразы (СибЭнзим, Россия). Полученные ПЦР-фрагменты очищали элюцией из GTG-агарозы (Lonza, Израиль). Реакцию секвенирования полученных ПЦР-фрагментов проводили с использованием тех же олигонуклеотидов и реактива BigDye v.3.1 (Applied Biosystems, CША) в стандартных условиях. Электрофоретическое разделение продуктов реакции секвенирования вели с использованием прибора «ABI Sequencing Analyzer 3500». Полученные последовательности анализировали с использованием программного обеспечения ABI Sequence Scanner и FinchTV 4.1. Сравнение последовательностей с имеющимися в базе данных NCBI GenBank database (ncbi.nlm.nih.gov) референсными последовательностями рибосомальных спейсеров дрожжей проводили с использованием алгоритма BLASTN. Филогенетический анализ для наиболее близких к исследуемым последовательностей проводили в программе MEGA 7.0.21.

Результаты

Изолят Y-1370 выделен при анализе микробной генерализованной инфекции пациента с диагнозом пневмония и летальным исходом. Пять образцов материалов от больного (моча, смывы из ротоглотки, носоглотки) в изобилии содержали эукариотические клетки капсулированных, почкующихся дрожжеподобных грибов на разных стадиях жизненного цикла, с диаметром до 5 мкм (рис. 1А), образующих на агаре Сабуро белые, пастообразной консистенции, куполообразные, непрозрачные колонии со специфическим (дрожжевым) запахом (рис. 1Б). Пять полученных чистых культур оказались идентичными, с положительной окраской по Граму, отрицательной реакцией по уреазе. Выделенные культуры проявили способность к анаэробному росту, ферментации глюкозы, мальтозы и лактозы до кислоты, в результате геномного анализа они идентифицированы как принадлежащие к виду Cyberlindnera jadinii (телеморфа Candida utilis).

 

Рисунок 1. Морфология клеток (А, ×2500) и колоний (Б) штаммов дрожжей Y-1370, Y-1395, Y-583 (типовой штамм Candida albicans)

Figure 1. Cell (A, ×2500) and colony (B) morphology of yeast strains Y-1370, Y-1395, and Y-583 (type strain Candida albicans)

 

Изолят дрожжей Y-1395 выделен при высеве мокроты пациентки с хроническим бронхитом на среду Сабуро в виде множества колоний белого цвета, куполообразных, матовых, непрозрачных, пастообразной консистенции, образованных грамположительными, капсулированными, почкующимися клетками, размером 2–5 мкм, активно утилизирующими глюкозу и сахарозу. От вида Candida albicans данный изолят дрожжей отличала утилизация сахарозы, неспособность к усвоению мальтозы и к росту при 42–45°С. В результате геномной и фенотипической идентификации изолят дрожжей Y-1395 определен как относящийся к виду Candida africana — дрожжеподобным оппортунистическим грибам, также имеющим клиническое значение в развитии кандидозов [25].

Идентификация изолятов дрожжей с использованием последовательностей межгенных рибосомальных спейсеров приведена на рис. 2 и 3. Последовательности ITS-фрагментов приведены на рис. 4 и 5.

 

Рисунок 2. Филогенетический анализ ITS-последовательности штамма Y-1370. Выравнивание последовательностей произведено алгоритмом ClustalW, филогенетическое дерево построено методом наибольшего правдоподобия, количество реплик 1000. Анализируемая последовательность отмечена черным квадратом

Figure 2. Phylogenetic analysis of strain Y-1395 ITS-sequence. The alignment was performed by the ClustalW algorithm, the phylogenetic tree was constructed using the Maximum Likelihood method, with 1000 replicates. The analyzed sequence is depicted as a black box

 

Рисунок 3. Филогенетический анализ ITS-последовательности для штамма Y-1395. Выравнивание последовательностей произведено алгоритмом ClustalW, филогенетическое дерево построено методом наибольшего правдоподобия, количество реплик 1000. Анализируемая последовательность отмечена черным кружком

Figure 3. Phylogenetic analysis of strain Y-1370 ITS-sequence. Alignment was performed by the ClustalW algorithm, phylogenetic tree was constructed using the Maximum Likelihood method, with 1000 replicates. The analyzed sequence is denoted by a black circle

 

Рисунок 4. Нуклеотидная последовательность ITS-фрагмента штамма дрожжей Y-1370

Figure 4. Nucleotide sequence of fungal strain Y-1370ITS fragment

 

Рисунок 5. Нуклеотидная последовательность ITS-фрагмента штамма дрожжей Y-1395

Figure 5. Nucleotide sequence of fungal strain Y-1395 ITS fragment

 

В зависимости от температурных условий роста кандиды способны менять морфологию клеток. Диапазон температур от 37 до 40°С содействует образованию гифальных форм, характерных для инвазивных процессов. Исследуемые штаммы кандид хорошо росли при температуре 37°С, клетки при росте на кукурузном агаре активно образовывали гифальные проростки и формировали биопленки (рис. 6). Фенотипическая гибкость является важным фактором вирулентности кандид, обеспечивающим вторжение в эпителий, распространение по организму и выживание в различных нишах макроорганизма [21]. Выживанию клеток дрожжей в неблагоприятных условиях способствует развитая капсула, в состоянии биопленки обеспечивающая клеткам защиту от воздействия иммунитета и антимикотических препаратов. Все эти свойства — активный рост при повышенной температуре, способность к образованию капсулы, формировании гифальных проростков и биопленок, характерные и для изучаемых культур, — относятся к признакам патогенности и отличают потенциально патогенные штаммы кандид от сапротрофных штаммов.

 

Рисунок 6. Образование биопленки и гифальных проростков у дрожжеподобных клеток кандид при культивировании на кукурузном агаре; ×2500

Figure 6. Hyphal sprout formation in Candida yeast-like cells cultured on corn agar; ×2500

 

Определение чувствительности к антимикотикам показало, что штамм C. utilis Y-1370 резистентен к кетоконазолу, итраконазолу и флуконазолу, обладает слабо выраженной чувствительностью к клотримазолу и нистатину, несколько в большей степени — к амфотерицину В, что делает эти препараты малоэффективными по отношению к данному патогену. Типовой штамм C. albicans Y-583 по чувствительности к антимикотикам был сходен со штаммом Y-1370, в то время как штамм Y-1395 проявил устойчивость к интраконазолу, к остальным использованным препаратам был чувствителен в разной степени (табл. 1). Кетоконазол, флуконазол и клотримазол были наиболее эффективными относительно штамма Y-1395.

 

Таблица 1. Определение чувствительности штаммов исследуемых грибов к антимикотическим препаратам диско-диффузионным методом

Table 1. Determination of sensitivity of strains of the studied fungi to antimycotic drugs by disk-diffusion method

Штамм Strain	Препараты антимикотиков/зона подавления роста дрожжей (мм) Antimycotic agents/growth suppression zone of fungal strains (mm)
	Кетоконазол Ketoconazol	Итраконазол Itraconazole	Флуконазол Fluconazole	Клотримазол Clotrimazole	Нистатин Nystatin	Амфотерицин В Amphotericin B
Y-1370	R	R	R	I	I	S
Y-1395	S	R	S	S	I	I
Y-583	R	R	R	R	I	I

Примечание. S (Susceptible) — чувствительный; R (Resistant) — резистентный; I (Intermediate) — умеренно резистентный.

Note. S (Susceptible) — sensitive; R (Resistant) — resistant; I (Intermediate) — moderately resistant.

 

Спорообразующие бактерии В. subtilis В-1376, B. licheniformis B-847, B. subtilis B-652 тестированы на наличие антигрибковой активности относительно штаммов дрожжей Y-1370, Y-1395 и типового контрольного штамма C. albicans Y-583. Показано, что клинические изоляты Y-1370, Y-1395 проявили высокую чувствительность к секретируемым метаболитам всех трех бацилл (табл. 2), зоны угнетения роста достигали 35 мм.

 

Таблица 2. Ингибирующее влияние на клетки штаммов дрожжей Y-1370, Y-1395, Y-583 секретируемых метаболитов штаммов спорообразующих бактерий

Table 2. Inhibitory effect of secreted metabolites from spore-forming bacterial strains on yeast Y-1370, Y-1395, and Y-583 strains

Штамм Strain	Штаммы антагонисты/зона подавления роста (мм) Antagonist strains/growth suppression zone (mm)
	В. subtilis В-1376	B. licheniformis В-847	Bacillus subtilis B-652
Y-1370	35±1,0	35±1,0	35±1,0
Y-1395	20±1,0	35±1,0	35±1,0
Y-583	30±1,0	15±0,7	20±1,0

 

Реакция на действие антисептиков, включая растительные экстракты, у всех трех штаммов Y-1370, Y-1395 и Y-583 была схожей: показана высокая чувствительность к препаратам «Октенисепт» и «Хлоргексидин», а также к масляным экстрактам розмарина, сандала и контрольному раствору 70% этанола (рис. 7). При использовании настойки календулы и масляного экстракта лаванды получен отрицательный результат, зоны угнетения роста культур вокруг лунок с этими препаратами отсутствовали, как и в контрольном варианте с применением физиологического раствора.

 

Рисунок 7. Определение чувствительности штаммов исследуемых грибов к антисептикам

Figure 7. Determination of antiseptics fungal strain sensitivity

Примечание. 1 — «Октенисепт»; 2 — «Хлоргексидин биглюканат» 0,05%; 3 — настойка календулы; 4 — настойка эвкалипта; 5 — масляный экстракт розмарина, 6 — масляный экстракт сандала, 7 — масляный экстракт лаванды; 8 — 70% этанол; 9 — физиологический раствор.

Note. 1 — “Octenisept”; 2 — “Chlorhexidine biglucanate” 0,05%; 3 — calendula tincture; 4 — eucalyptus tincture; 5 — rosemary oil extract, 6 — sandalwood oil extract, 7 — lavender oil extract; 8 — 70% ethanol; 9 — physiological solution.

 

Обсуждение

Наблюдаемое в настоящее время все большее распространение дрожжевых грибов рода Candida связывают с нерациональным использованием антимикотиков, неблагоприятным влиянием среды на иммунную систему, длительной госпитализацией, несъемными катетерами и другими отягощающими факторами. У пациентов со СПИД, после химиотерапии онкологического заболевания или трансплантации органов также существует высокая вероятность развития генерализованного кандидамикоза вплоть до септицемии [21]. При инфекционных заболеваниях дыхательной системы для грибов рода Candida показана высокая частота встречаемости, как правило, в ассоциации с другими микроорганизмами [24]. Чаще всего сопутствующими микроорганизмами в ассоциации с кандидами были стрептококки, как мы и наблюдали при выделении из клинического материала изолята Y-1395, где в первичном высеве кроме дрожжей обнаружены неспороносные бактерии и гемолитические кокки.

Отмечается расширение видового состава штаммов кандид, ответственных за инфекционные процессы. Сравнительно недавно обнаруженный патоген Candida auris [7] все чаще становится причиной клинических инфекций, с риском развития генерализованных процессов и вероятностью летального исхода до 50%. Он отличается резистентностью ко многим антифунгальным препаратам [1]. За последние два десятилетия целый ряд видов рода Candida превратились из редких патогенов в наиболее важные и частые условно-патогенные микроорганизмы, вызывающие кандидемию и инвазивный кандидоз у госпитализированных пациентов. Ранее не считавшиеся патогенными грибы вида C. utilis (Cyberlindnera jadinii) все чаще являются возбудителями инвазивных процессов [12]. Факторами риска в таких случаях являлись ослабление иммунитета, длительная госпитализация, воздействие антибиотиков. Участились случаи грибковой инфекции C. utilis кровотока, связанные с длительным полностью имплантированным венозным катетером [9, 23]. В публикации 2021 г. Sreelekshmi T.S. с соавт. [4] вид C. utilis был объявлен новым грибковым патогеном в крови, выделен у детей в возрасте 0–3 месяцев, заболевание тяжело поддавалось лечению из-за резистентности возбудителей к антимикробным препаратам. В настоящем исследовании штамм дрожжей C. utilis выделен из мочи, носоглотки и зева пациента с генерализованной дрожжевой инфекцией с диагнозом пневмония. Штамм проявил резистентность к применяемым в настоящей работе антимикотикам, для его ингибирования необходим более эффективный подбор противогрибковых препаратов. Следует отметить, что полученные данные по резистентности исследуемых штаммов Candida к антимикотикам отличаются от приведенных сведений [6], рекомендуемых в качестве отличительных признаков для идентификации ряда видов этого рода. Вид Candida africana, к которому можно отнести изолят Y-1395, ранее был предложен в качестве нового, реже встречающегося и менее патогенного вида, однако дальнейшие филогенетические анализы подтвердили его статус как необычного варианта C. albicans [6], обнаруживаемого при вагинальных инфекциях [25]. Фенотипически изолят Y-1395 отличался от C. albicans замедленным образованием гиф, утилизацией сахарозы, отсутствием роста на среде с мальтозой и при повышении температуры культивирования до 42–45°С, что соответствует признакам C. africana [6, 25].

Как выяснено, исследуемые штаммы дрожжей чувствительны к препарату «Октенисепт», предназначенному для обработки слизистых, пораженных грибками, и к антисептику «Хлоргексидин биглюканат» 0,05%, применяемому для обработки наружных покровов. Использованные настойки календулы и эвкалипта в соответствии с информацией на этикетке были приготовлены с применением 70% этанола, срок их годности не истек. Однако в отличие от 70% контрольного раствора этанола обе они не оказывали антигрибкового действия на исследуемые штаммы дрожжей, что может быть связано с особенностями технологии производства и хранения этих экстрактов. Эфирные масла хвойных и травянистых растений являются источниками антимикробных веществ широкого спектра действия и способны эффективно подавлять возбудителей микозов [5, 26]. В настоящей работе проявили эффективность против штаммов кандид C. utilis В-1370 и C. africana В-1395 масляные экстракты розмарина и сандала, к экстракту лаванды оба штамма были устойчивы.

Заключение

По результатам фенотипического и генетического анализа установлена таксономическая принадлежность дрожжеподобных грибов, выделенных из клинического материала пациентов с бронхолегочными заболеваниями, как относящихся к видам C. utilis, штамм Y-1370, и C. africana, штамм Y-1395. При определении резистентности штаммов к 6-ти широко применяемым на практике антимикотикам установлена чувствительность к пяти из них штамма C. africana Y-1395 и резистентность штамма C. utilis Y-1370. Подтверждены ранее имеющиеся сравнительно немногочисленные сведения о необходимости контролировать грибы вида C. utilis как патогены, способные вызвать тяжелые инфекционные заболевания до возможности летального исхода.

На примере клинических штаммов дрожжей Y-1370, Y-1395 и типового штамма C. albicans Y-583 показано, что исследованные антисептики, растительные и бактериальные препараты могут быть эффективно использованы в качестве дополнительных средств для терапии и профилактики кандидозов разного происхождения.

Благодарности

Авторы выражают благодарность Буряк Г.А. и Емельяновой Е.К. за редакционные правки и техническую помощь в подготовке материалов статьи.

Об авторах

Ирина Сергеевна Андреева

ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора

Автор, ответственный за переписку.
Email: andreeva_is@vector.nsc.ru

к.б.н., доцент, ведущий научный сотрудник отдела биофизики и экологических исследований

Россия, п. Кольцово, Новосибирская область

В. В. Морозова

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: andreeva_is@vector.nsc.ru

к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии

Россия, Новосибирск

А. С. Кабанов

Koltsovo, Novosibirsk Region

Email: andreeva_is@vector.nsc.ru

к.б.н., старший научный сотрудник отдела «Коллекция микроорганизмов»

Россия, п. Кольцово, Новосибирская область

Список литературы

Дополнительные файлы