Физико-химические и антигенные свойства извлекаемых мочевиной поверхностных структур Yersinia pseudotuberculosis O:1b

Обложка


Цитировать

Полный текст

Аннотация

К важным методам диагностики псевдотуберкулеза относятся иммуносерологические исследования, в частности, направленные на выявление антигенов возбудителя. Практический интерес представляют основные иммунодоминантные и видоспецифические антигены, расположенные в поверхностных структурах бактериальной клетки. В связи с этим целью работы явилось выделение и характеристика биологически активных поверхностных структур псевдотуберкулезного микроба. В работе проведен лизис живых клеток Y. pseudotuberculosis 3704 (O:1b) путем обработки их 9 M раствором мочевины с целью извлечения антигенов, локализованных в поверхностных структурах микроорганизма. Полученные субклеточные фракции — наружные мембраны (НМ), мочевинный экстракт (МЭ) и изолированный из него белковолипополисахаридный комплекс (БЛПК) — охарактеризованы по физико-химическим параметрам. Содержание белка в препаратах составило от 42 до 53%. Полипептидный спектр препарата НМ псевдотуберкулезного микроба представлен 14 мажорными полипептидами с молекулярными массами от 13,9 до 131,5 kDa, спектр МЭ — 16 полипептидами с молекулярными массами от 13,5 до 101,6 kDa, спектр препарата БЛПК — 9 полипептидами с молекулярными массами от 20,7 до 66,6 kDa. В изолированных субклеточных фракциях (НМ и МЭ) с помощью теста радиальной энзимодиффузии и субстратного электрофореза выявлены протеолитически активные белки и полипептиды. В препарате НМ таковыми явились 4 полипептида с молекулярными массами от 28,0 до 118,0 kDa, в препарате МЭ — 7 полипептидов с молекулярными массами от 29,2 до 97,7 kDa. Полученные субклеточные фракции способны проявлять иммуногенную активность при введении экспериментальным животным и антигенную активность при взаимодействии со специфическими антителами в реакции иммунодиффузии в геле (РИД) и антителами, меченными наночастицами коллоидного серебра в дот-иммуноанализе (ДИА). Препараты НМ и БЛПК в ДИА с иммуноглобулинами, выделенными из экспериментальных антисывороток и меченные наночастицами коллоидного серебра, обнаруживались в концентрации ≥ 0,12 мкг/мл (по сухому весу), клетки штамма Y. pseudotuberculosis 3704 — в концентрации ≥ 3,9 × 106 м.к./мл, что аналогично результатам ДИА с иммуноглобулинами, выделенными из коммерческой псевдотуберкулезной антисыворотки (Санкт-Петербург) и меченными наночастицами коллоидного серебра. Таким образом, изолированные при использовании мочевины в качестве лизирующего и обеззараживающего агента субклеточные фракции псевдотуберкулезного микроба сохраняют свои антигенные и иммуногенные свойства, ферментативную активность, что указывает на перспективность их использования для совершенствования ранней диагностики псевдотуберкулеза.

Полный текст

Введение

Y. pseudotuberculosis — энтеропатоген, имеет глобальное распространение на всех континентах (кроме Антарктиды) и является причиной псевдотуберкулезной инфекции с фекально-оральным механизмом передачи, преимущественно через пищевые продукты. Популяция возбудителя гетерогенна по О-антигену, в настоящее время известен 21 серологический вариант (О:1а, О:1b, О:1с, О:2а, О:2b, О:2с, О:3, О:4а, О:4b, О:5а, О:5b, О:6, О:7, О:8, О:9, О:10, О:11, О:12, О:13, О:14, О:15), однако наибольшее значение в патологии человека имеет серовариант Y. pseudotuberculosis O:1b. В Сибири и на Дальнем Востоке он доминирует в 90,7% случаях [2].

Псевдотуберкулез характеризуется внезапным проявлением, полиморфизмом клинических форм и, как следствие, трудностью достоверной ранней диагностики [9], что обуславливает необходимость совершенствования клинической и лабораторной диагностики заболевания [8]. Наиболее перспективными для ранней диагностики псевдотуберкулеза являются методы, направленные на выявление специфических антигенов, оптимизация которых остается актуальной до настоящего времени. Поскольку основные иммунодоминантные, включая видоспецифические, антигены локализованы в поверхностных структурах микробной клетки [3], выделение и использование их для конструирования иммунобиологических препаратов может представлять практический интерес, в том числе в изучении роли субклеточных фракций и их отдельных компонентов в иммуно- и патогенезе псевдотуберкулеза. Кроме того, учитывая эффективность вакцинации против чумы аттенуированным штаммом Y. pseudotuberculosis [11], поверхностные структуры и антигены менее патогенного, но родственного чумному псевдотуберкулезного микроба, могут быть использованы для конструирования химических противочумных вакцин.

Актуальным остается и поиск альтернативных методов обеззараживания микробной массы и разрушения бактериальных клеток для получения стерильных субклеточных фракций, сохраняющих антигенную активность и отвечающих требованиям биологической безопасности, поскольку традиционные методы обеззараживания возбудителей особо опасных инфекций (кипячение, воздействие ацетоном, формалином, фенолом, этанолом, метанолом) могут приводить к необратимым изменениям их нативных свойств. Перспективной может оказаться обработка живых клеток концентрированным раствором мочевины, обладающей бактерицидным действием. Так, ранее нами был получен специфически стерильный высокоиммуногенный препарат наружных мембран холерного вибриона Эль Тор за счет одномоментного лизиса и обеззараживания раствором мочевины живых микробных клеток возбудителя холеры [3, 4, 5].

Цель работы — выделение и характеристика биологически активных поверхностных структур псевдотуберкулезного микроба с использованием бактерицидного действия мочевины, позволяющего одновременно обеззараживать и лизировать бактериальные клетки возбудителя.

Материалы и методы

Вся работа проводилась в соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III–IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» [9]. Штамм Y. pseudotuberculosis 3704 (О:1b) (Музей живых культур ФКУЗ НИПЧИ Сибири и ДВ, Иркутск, Россия) выращивали при 28°С в течение 48 ч на агаре Хоттингера (рН 7,2), смывали забуференным (рН 7,2) физиологическим раствором (ЗФР) и получали взвесь концентрацией 40 млрд микробных клеток в 1,0 мл. В микробную взвесь добавляли при постоянном перемешивании 9,0 М раствор мочевины до конечной концентрации 4,5 М и оставляли при температуре 20–25°C. Через сутки ставили бактериологический контроль стерильности лизата, который до окончания проведения процедуры хранили в холодильнике при температуре 4°С. Дальнейшую работу проводили после отрицательного бактериологического контроля специфической стерильности. Полученный лизат подвергали последовательному центрифугированию при 10 000g в течение 30 мин при 4°С для удаления не разрушенных микробных клеток и при 40 000g в течение 60 мин при 4°С для осаждения фракции НМ и получения препарата МЭ. Полученный осадок промывали 4,5 M раствором мочевины скоростным центрифугированием (как указано выше). Далее осадок отмывали дистиллированной водой с последующим осаждением скоростным центрифугированием. Конечный осадок ресуспендировали в минимальном объеме дистиллированной воды и лиофильно высушивали. Оставшийся после центрифугирования лизата клеток супернатант — препарат МЭ — диализовали в течение трех суток против проточной и дистиллированной воды, освобождали от нерастворимых веществ центрифугированием и лиофильно высушивали.

Выделение и очистку БЛПК из препарата МЭ проводили методом двухфазного разделения с использованием детергента Тритона Х-114 (Serva, Германия) и отбором водной и детергентной фаз [6].

Содержание белка определяли по методу O.H. Lowry с соавт. [20] с применением бычьего сывороточного альбумина (Sigma-Aldrich, США) в качестве стандарта.

Липополисахарид (ЛПС) из клеток псевдотуберкулезного микроба изолировали водно-фенольной экстракцией по методу O. Westphal с соавт. [19] с получением водной и фенольной фракций ЛПС. Наличие ЛПС в препаратах определяли колориметрическим методом с использованием карбоцианинового красителя «Stains all» (ICN Biomedicals Inc, США) [21] в нашей модификации [7].

Электрофоретический анализ проводили в блоках полиакриламидного геля в присутствии додецилсульфата натрия по методу U.K. Laemmli и M. Favre [14] с последующей окраской на белки Кумасси ярко-синим R-250 (Bio-Rad, США) [12] и на углеводы ионами серебра (Химреактивснаб, Россия) [17]. В качестве маркера молекулярных масс использовали смеси белков (Thermo Scientific, США) с диапазоном молекулярных масс от 14,4 до 116,0 kDa и от 20 до 120 kDa. Молекулярную массу полипептидов в препаратах оценивали с помощью гель-документирующей системы GelDoc™XR+ (Bio-Rad, США), программой ImageLabTM.

Протеазную активность определяли в тесте радиальной энзимодиффузии (РЭД) в 1% агарозе (Helicon, Россия) и в субстратном диск-электрофорезе [18] с использованием в качестве субстрата желатина (Serva, Германия) в концентрации 0,1%.

Животными-продуцентами экспериментальной антисыворотки являлись кролики породы «шиншилла» (лаборатория подопытных животных ФКУЗ НИПЧИ Сибири и ДВ, Иркутск, Россия) весом 2,5–3,0 кг обоего пола, не имеющие клинических отклонений от нормы. Иммуногеном служили препараты НМ и БЛПК. Используемый препарат НМ подвергался предварительной трипсинизации для удаления примеси растворимых белков. Навеску НМ суспендировали в 0,025 M Трис-HCl буфере pH 7,2 в присутствии 0,5 мг/мл трипсина (Serva, Германия), инкубировали при 30°С в течение 30 мин с последующим центрифугированием при 40 000g, отмыванием в дистиллированной воде (1:50), повторным центрифугированием. Полученный осадок лиофилизировали.

При иммунизации животных применялось две схемы. Кроликов-продуцентов разделили на четыре группы. Животным первой и третьей групп перед иммунизацией препаратом НМ и препаратом БЛПК, соответственно, вводили полный адъювант Фрейнда (ПАФ) по 0,5 мл в подушечки задних лап. Через 5–7 дней кроликам проводили инъекцию НМ по 1,0 мг сухого вещества (по белку 0,55 мг) и БЛПК по 1,0 мг сухого вещества (по белку 0,45 мг) в каждый подколенный лимфатический узел в 0,4 мл ЗФР с 1,2 мл ПАФ. Через 3–5 дней иммунизировали в передние лапы в той же дозе, но без добавления ПАФ. Через 15 дней осуществляли второй цикл иммунизации, который предусматривал трехкратное внутривенное введение комплекса антиген–антитело (АГ–АТ). С этой целью у животных обеих групп забирали кровь для получения 3,0 мл сыворотки: по 1,0 мл разливали в стерильные пробирки и растворяли в каждой по 1,0 мг сухого антигенного препарата. Полученный комплекс АГ–АТ вводили внутривенно каждому кролику, от которого была получена сыворотка, с интервалом между инъекциями в 5 дней. Одновременно каждому животному делали внутримышечно инъекцию антигена в вышеуказанных дозах в объеме 0,5 мл ЗФР. Животным второй и четвертой групп инъекции препаратов НМ и БЛПК осуществляли подкожно двукратно в дозе из расчета по 1,0 мг иммуногена в 1,0 мл ЗФР с 1,0 мл ПАФ в четыре точки спины вдоль позвоночника с интервалом в 3 дня. Через 7 дней после последнего введения антигенов у всех животных проводили забор крови, определяли активность и специфичность сыворотки с помощью иммуносерологических методов, используя в качестве антигенов выделенные препараты НМ, БЛПК, штамм Y. pseudotuberculosis 3704 и тест-штаммы гетерологичных микроорганизмов (Y. enterocolitica 628, Salmonella enterica typhi 21, Shigella flexneri 1964) (музей живых культур ФКУЗ НИПЧИ Сибири и ДВ, Иркутск, Россия).

Наличие антигенов в препаратах определяли в РИД в 1% агарозном геле с последующей окраской белков Кумасси ярко-синим [15] и в ДИА, используя специфические антитела экспериментальных кроличьих антисывороток, меченные наночастицами коллоидного серебра [1], а также аналогичный конъюгат на основе антител из коммерческой диагностической антисыворотки для постановки РНГА производства ФГУП СПб НИИВС, Россия (в качестве контроля). Выделение антител (IgG) из антисывороток осуществляли комбинированным методом с использованием каприловой кислоты и сульфата аммония [13]. ДИА ставили традиционным способом, предполагающим адсорбцию исследуемого препарата на нитроцеллюлозной мембране с величиной пор 0,3 мкм (Synpor, Чехия) с последующей его детекцией антителами, меченными коллоидным серебром [1].

Результаты и обсуждение

Физико-химические свойства полученных субклеточных фракций. Из бактериальной массы клеток Y. pseudotuberculosis 3704 в результате обработки их 9 M раствором мочевины получены субклеточные фракции (НМ и МЭ) псевдотуберкулезного микроба. Путем обработки МЭ детергентом Тритон Х-114 (Serva, Германия) получен препарат БЛПК.

Содержание белка в препаратах НМ, МЭ и БЛПК составило в среднем 53, 50 и 42% соответственно.

При проведении электрофоретического анализа в препаратах НМ и МЭ псевдотуберкулезного микроба определен полипептидный состав (рис. 1).

 

Рисунок 1. Электрофоретическое разделение в 12% полиакриламидном геле препаратов, полученных мочевинной экстракцией из Y. pseudotuberculosis 3704. Примечание. 1 — маркер молекулярных масс, 2 — препарат наружных мембран, 3 — препарат мочевинного экстракта. Окраска Кумасси ярко-синим R-250. / Figure 1. Electrophoretic separation of preparations obtained by urea extraction from Y. pseudotuberculosis 3704 in 12% polyacrylamide gel. Note. 1 — molecular weight marker, 2 — outer membrane preparation, 3 — urea extract preparation. Stained with Coomassie brilliant blue R-250.

 

В полипептидном спектре препарата НМ установлено наличие 14 мажорных полипептидов с молекулярными массами от 13,9 до 131,5 kDa. В препарате МЭ выявлено 16 мажорных полипептидов с молекулярными массами от 13,5 до 101,6 kDa. Полипептиды с массами 24,4, 29,7, 39,8, 43,3 kDa оказались представленными в обоих препаратах, вероятно, в результате того, что при воздействии хаотропного агента на клеточную стенку происходит частичный выход мембранных компонентов в мочевинный экстракт, в том числе белков и ЛПС.

При окраске на углеводы ионами серебра препарата БЛПК Y. pseudotuberculosis 3704 выявлено 9 полос с молекулярными массами от 20,7 до 66,6 kDa (рис. 2). Кроме того, обнаружен быстро мигрирующий компонент с молекулярной массой ниже 20 kDa.

 

Рисунок 2. Электрофоретическое разделение в 12% полиакриламидном геле препарата белковолипополисахаридного комплекса, полученного из мочевинного экстракта Y. pseudotuberculosis 3704. Примечание. 1 — маркер молекулярных масс, 2 — препарат белковолипополисахаридного комплекса. Окраска ионами серебра. / Figure 2. Electrophoretic separation of a protein-lipopolysaccharide complex preparation obtained from urea extract Y. pseudotuberculosis 3704 in 12% polyacrylamide gel. Note. 1 — molecular weight marker, 2 — protein-lipopolysaccharide complex preparation. Stained with silver ions

 

Метахроматическая активность. Выявлено, что при горячей водно-фенольной экстракции клеток псевдотуберкулезного микроба липополисахаридный антиген распределяется как в водную, так и в фенольную фазы, а также обнаруживается в препаратах НМ, МЭ и БЛПК, что подтверждается метахроматическим эффектом: при взаимодействии исследуемых фракций с карбоцианиновым красителем «Stains all» происходит сдвиг максимума поглощения красителя в коротковолновую область в препарате НМ (λmax 574 нм → λmax 472 нм), МЭ, фенольной фракции ЛПС (λmax 574 нм → λmax 466 нм) и водной фракции ЛПС и БЛПК (λmax 574 нм → λmax 467 нм), что характерно для ЛПС грамотрицательных бактерий.

Ферментативная активность. При обработке возбудителя псевдотуберкулеза раствором мочевины в препаратах субклеточных фракций определяется протеолитическая активность (рис. 3), что свидетельствует о минимальном денатурирующем воздействии мочевины на нативные свойства получаемых фракций микробной клетки.

 

Рисунок 3. Тест радиальной энзимодиффузии полученных препаратов из Y. pseudotuberculosis 3704 в 1% агарозном геле с использованием в качестве субстрата желатина. Примечание. 1, 2, 3, 4 — препарат наружных мембран в концентрации 8, 6, 4, 2 мг/мл, соответственно; 5, 6, 7, 8 — препарат мочевинного экстракта в концентрации 2, 4, 6, 8 мг/мл соответственно; (K+) — положительный контроль (трипсин), (K–) — отрицательный контроль (контроль растворителя). / Figure 3. Radial enzyme diffusion test of preparations obtained from Y. pseudotuberculosis 3704 in 1% agarose gel using gelatin as a substrate. Note. 1, 2, 3, 4 — outer membrane preparation at concentration of 8 mg/ml, 6 mg/ml, 4 mg/ml, 2 mg/ml, respectively; 5, 6, 7, 8 — preparation of urea extract at concentration of 2 mg/ml, 4 mg/ml, 6 mg/ml, 8 mg/ml, respectively; (K+) — positive control (trypsin solution), (K–) — negative control (solvent control).

 

Препарат МЭ в РЭД тесте уступает по активности препарату НМ благодаря активности мембраносвязанных протеаз последних, обладающих повышенной стабильностью за счет своего микроокружения, по сравнению с растворимыми формами протеаз в МЭ (рис. 3; 5–8).

Субстратным электрофорезом в препаратах НМ и МЭ выявлены протеолитически активные полипептиды и обнаружено их различие в спектре субклеточных фракций (рис. 4).

 

Рисунок 4. Субстратный электрофорез препаратов субклеточных фракций из Y. pseudotuberculosis 3704 в 12% полиакриламидном геле с использованием в качестве субстрата раствора желатина. Примечание. 1 — положительный контроль (трипсин), 2 — препарат наружных мембран, 3 — препарат мочевинного экстракта. Слева указано положение маркера молекулярных масс. Окраска Кумасси ярко-синим R-250. / Figure 4. Substrate-gel electrophoresis of subcellular fraction preparations from Y. pseudotuberculosis 3704 in 12% polyacrylamide gel using a gelatin solution as a substrate. Note. 1 — positive control (trypsin solution), 2 — outer membrane preparation, 3 — preparation of urea extract. The position of the molecular weight marker is indicated on the left. Stained with Coomassie brilliant blue R-250.

 

В препарате НМ протеазной активностью обладают полипептиды с молекулярными массами 28,0, 48,4, 61,5 kDa и в области 72,5–118,0 kDa, тогда как в препарате МЭ данной активностью обладают полипептиды с молекулярными массами 29,2, 36,0, 74,7, 79,0, 82,8, 89,4, 97,7 kDa.

Иммуногенная и антигенная активности. Анализ исследуемых препаратов в РИД выявил в регистрируемых количествах только один компонент, идентифицированный как ЛПС, играющий основную роль в индукции специфического гуморального иммунитета у макроорганизмов. При взаимодействии с цельной коммерческой поливалентной антисывороткой в РИД наблюдается полное слияние преципитата между препаратами ЛПС водно-фенольной экстракции и препаратами НМ и МЭ, что указывает на их антигенную идентичность (рис. 5).

 

Рисунок 5. Реакция иммунодиффузии антигенных препаратов, полученных из Y. pseudotuberculosis 3704 в 1% агарозном геле с коммерческой псевдотуберкулезной антисывороткой. Примечание. 1 — липополисахарид из водной фракции, 2 — препарат мочевинного экстракта, 3 — липополисахарид из фенольной фракции, 4 — препарат наружных мембран, 5 — коммерческая поливалентная псевдотуберкулезная антисыворотка (СПб). Окраска Кумасси ярко-синим R-250. / Figure 5. Immunodiffusion reaction of antigenic preparations obtained from Y. pseudotuberculosis 3704 in 1% agarose gel with commercial pseudotuberculosis antiserum. Note. 1 — lipopolysaccharide from the aqueous fraction, 2 — preparation of urea extract, 3 — lipopolysaccharide from the phenolic fraction, 4 — outer membrane preparation, 5 — commercial polyvalent pseudotuberculosis antiserum (St. Petersburg). Stained with Coomassie brilliant blue R-250.

 

Сыворотки, полученные путем иммунизации животных-продуцентов препаратами НМ и БЛПК, по специфической активности не отличались между собой.

Полученные экспериментальные антисыворотки в разведении 1:10 в РИД не реагировали с гетерологичными тест-штаммами (1 × 109 м.к./мл) и проявляли серологическую активность только в отношении гомологичного штамма Y. pseudotuberculosis 3704 (рис. 6), а также с изолированными из него препаратами НМ и БЛПК (1 мг/мл).

 

Рисунок 6. Реакция иммунодиффузии антигенных препаратов Y. pseudotuberculosis 3704 и микробных взвесей в 1% агарозном геле с экспериментальной кроличьей антисывороткой, полученной против препарата белковолипополисахаридного комплекса. Примечание. 1 — препарат наружных мембран, 2 — препарат белковолипополисахаридного комплекса, 3 — микробная взвесь Y. pseudotuberculosis 3704, 4 — микробная взвесь Y. enterocolitica 628, 5 — микробная взвесь S. typhi 21, 6 — микробная взвесь S. flexneri 1964, 7 — экспериментальная псевдотуберкулезная кроличья антисыворотка. / Figure 6. Immunodiffusion reaction of antigenic preparations of Y. pseudotuberculosis 3704 and microbial suspensions in 1% agarose gel with experimental rabbit antiserum obtained against the preparation of a protein-lipopolysaccharide complex. Note. 1 — outer membrane preparation, 2 — protein-lipopolysaccharide complex preparation, 3 — microbial suspension of Y. pseudotuberculosis 3704, 4 — microbial suspension of Y. enterocolitica 628, 5 — microbial suspension of S. typhi 21, 6 — microbial suspension S. flexneri 1964, 7 — experimental Y. pseudotuberculosis rabbit antiserum.

 

Препараты НМ и БЛПК в ДИА при использовании антител, изолированных из полученных экспериментальных антисывороток, меченных наночастицами коллоидного серебра, обнаруживались в концентрации ≥ 0,12 мкг/мл (по сухому весу) в объеме исследуемого образца, наносимого на мембрану — 1,5 мкл, штамм Y. pseudotuberculosis 3704 — в концентрации ≥ 3,9 × 106 м.к./мл (рис. 7) в объеме исследуемого образца, наносимого на мембрану — 1,5 мкл.

 

Рисунок 7. Дот-иммуноанализ препаратов и микробной взвеси Y. pseudotuberculosis 3704 с изолированными из экспериментальной антисыворотки антителами, полученными против препарата белковолипополисахаридного комплекса и меченными наночастицами коллоидного серебра. Примечание. 1 — микробная взвесь Y. pseudotuberculosis 3704, 2 — препарат наружных мембран, 3 — препарат белковолипополисахаридного комплекса. / Figure 7. Dot immunoassay of preparations and microbial suspension of Y. pseudotuberculosis 3704 by using antibodies isolated from experimental antiserum against the preparation of protein-lipopolysaccharide complex and labeled with colloidal silver nanoparticles. Note. 1 — microbial suspension of Y. pseudotuberculosis 3704, 2 — outer membrane preparation, 3 — protein-lipopolysaccharide complex preparation.

 

Аналогичные результаты зарегистрированы при исследовании указанных антигенных комплексов в ДИА с антителами из коммерческой диагностической антисыворотки, меченными наночастицами коллоидного серебра. Тест-штаммы гетерологичных микроорганизмов в ДИА перекрестно реагировали в высоких концентрациях с антителами экспериментальных антисывороток (≥ 7,8 × 106 м.к./мл.).

В ДИА с антителами из коммерческой антисыворотки гетерологичные тест-штаммы не выявлялись ввиду того, что в технологическую схему ее получения входит этап адсорбции антител антигенами близкородственных в антигенном отношении микроорганизмов, что минимизирует неспецифическое взаимодействие антигенов с антителами.

Заключение

Как известно, антигенную специфичность псевдотуберкулезного микроба определяет соматический О-антиген, который содержится в поверхностных структурах бактериальной клетки. При этом, говоря об антигенном спектре псевдотуберкулезного микроба, нельзя не отметить наличие структурного сходства отдельных поверхностных компонентов микробной клетки возбудителя с аналогичными макромолекулами некоторых других представителей семейств Yersiniaceae и Enterobacteriaceae. Применение мочевины в качестве лизирующего агента для выделения поверхностных структур бактериальной клетки позволяет сохранить антигенные, иммуногенные свойства и специфичность выделяемых антигенов.

Использованная техника гипериммунизации животных-продуцентов субклеточными фракциями Y. pseudotuberculosis для получения высокоактивных псевдотуберкулезных антисывороток в совокупности с более высокой чувствительностью ДИА по сравнению с РИД объясняют наличие перекрестного реагирования с гетерологичными микроорганизмами в ДИА. В связи этим, для эффективного использования в диагностических целях полученных псевдотуберкулезных антисывороток и минимизации риска получения ложноположительных результатов, необходимо дальнейшее продолжение работы по оптимизации способа получения высокоспецифичных АТ. Одним из направлений повышения специфичности экспериментальных псевдотуберкулезных антисывороток является их адсорбция близкородственными в антигенном отношении гетерологичными микроорганизмами.

Таким образом, методика обеззараживания путем лизиса микробных клеток концентрированным раствором мочевины позволяет получить стерильные субклеточные фракции псевдотуберкулезного микроба, сохраняющие свои иммуногенные и антигенные свойства, а также ферментативную активность, и представляет практический интерес в плане конструирования иммунобиологических препаратов для совершенствования ранней диагностики псевдотуберкулеза.

×

Об авторах

Анна Витальевна Крюкова

ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора

Автор, ответственный за переписку.
Email: adm@chumin.irkutsk.ru
ORCID iD: 0000-0002-4850-0886

младший научный сотрудник биохимического отдела

Россия, 664007, Иркутск, ул. Трилиссера, 78

Е. Ю. Марков

ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора

Email: adm@chumin.irkutsk.ru

д.б.н., старший научный сотрудник, зав. биохимическим отделом

Россия, 664007, Иркутск, ул. Трилиссера, 78

В. Б. Николаев

ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора

Email: adm@chumin.irkutsk.ru

к.м.н., старший научный сотрудник биохимического отдела

Россия, 664007, Иркутск, ул. Трилиссера, 78

Ю. О. Попова

Федеральное казенное учреждение здравоохранения Иркутский ордена трудового Красного знамени научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Email: adm@chumin.irkutsk.ru

лаборант биохимического отдела

Россия

В. Т. Климов

ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора

Email: adm@chumin.irkutsk.ru

к.м.н., старший научный сотрудник эпидемиологического отдела

Россия, 664007, Иркутск, ул. Трилиссера, 78

С. В. Игумнова

ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора

Email: adm@chumin.irkutsk.ru

врач эпидемиологического отдела

Россия, 664007, Иркутск, ул. Трилиссера, 78

Н. М. Андреевская

ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора

Email: adm@chumin.irkutsk.ru

к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории диагностических сывороток

Россия, 664007, Иркутск, ул. Трилиссера, 78

А. В. Уланская

ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора

Email: adm@chumin.irkutsk.ru

ветеринарный врач лаборатории диагностических сывороток

Россия, 664007, Иркутск, ул. Трилиссера, 78

Т. Ю. Загоскина

ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора

Email: adm@chumin.irkutsk.ru

д.м.н., с.н.с, зав. отделом подготовки и усовершенствования специалистов

Россия, 664007, Иркутск, ул. Трилиссера, 78

М. В. Чеснокова

ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора

Email: adm@chumin.irkutsk.ru

д.м.н., профессор, зав. отделом научного и учебно-методического обеспечения

Россия, 664007, Иркутск, ул. Трилиссера, 78

Список литературы

  1. Загоскина Т.Ю., Чеснокова М.В., Климов В.Т., Попова Ю.О., Марков Е.Ю., Старикова О.А. Конструирование тест-системы с наночастицами коллоидного серебра для обнаружения возбудителей псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза в дот-иммуноанализе // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2017. № 1. С. 55–61. [Zagoskina T.Yu., Chesnokova M.V., Klimov V.T., Popova Yu.O., Markov E.Yu., Starikova O.A. Construction of a test-system with nanoparticles of colloid silver for detection of pseudotuberculosis and intestinal yersiniosis for causative agents in dot-immunoassay. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii = Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology, 2017, no. 1, pp. 55–61. (In Russ.)] doi: 10.36233/0372-9311-2017-1-55-61
  2. Каримова Т.В., Климов В.Т., Чеснокова М.В. Молекулярно-биологическая характеристика Yersinia pseudotuberculosis и Yersinia enterocolitica, выделенных в Сибири и на Дальнем Востоке // Acta Biomedica Scientifica. 2016. Т. 1, № 3 (1). С. 60–64. [Karimova T.V., Klimov V.T., Chesnokova M.V. Biomolecular characteristics of Yersinia pseudotuberculosis and Yersinia enterocolitica isolated in Siberia and in the Far East. Acta Biomedica Scientifica = Acta Biomedica Scientifica. 2016, vol. 1, no. 3 (1), pp. 60–64. (In Russ.)] doi: 10.12737/21612
  3. Корнева А.В., Николаев В.Б., Половинкина В.С., Марков Е.Ю., Козлов С.Н., Мазепа А.В., Дубровина В.И., Загоскина Т.Ю., Урбанович Л.Я., Иванова Т.А., Балахонов С.В. Получение, характеристика и вакцинный потенциал поверхностных структур бактериальных возбудителей особо опасных инфекций // Дальневосточный журнал инфекционной патологии. 2019. № 37. С. 91–92. [Korneva A.V., Nikolaev V.B., Polovinkina V.S., Markov E.Yu., Kozlov S.N., Mazepa A.V., Dubrovina V.I., Zagoskina T.Yu., Urbanovich L.Ya., Ivanova T.A., Balakhonov S.V. Purification, characteristics and vaccine potential of the surface structures of bacterial agents of especially dangerous infections. Dal’nevostochnyy zhurnal infektsionnoy patologii = The Far Eastern Journal of Infectious Pathology. 2019, no. 37, pp. 91–92. (In Russ.)]
  4. Марков Е.Ю., Урбанович Л.Я., Голубинский Е.П., Каретникова Э.С., Иванова Т.А., Николаев В.Б., Завезенов Н.П., Субычева Е.Н. Получение высокоиммуногенного препарата наружных мембран Vibrio cholerae eltor // Журнал инфекционной патологии (Иркутск). 1998. Т. 5, № 4. С. 42–48. [Markov E.Yu., Urbanovich L.Ya., Golubinsky E.P., Karetnikova E.S., Ivanova T.A., Nikolaev V.B., Zavezenov N.P., Subycheva E. N. Obtaining highly immunogenic preparation of the outer membranes of Vibrio cholerae eltor. Zhurnal infektsionnoy patologii = Journal of Infectious Pathology (Irkutsk), 1998, vol. 5, no. 4, pp. 42–48. (In Russ.)]
  5. Марков Е.Ю., Урбанович Л.Я., Голубинский Е.П., Чернов А.Б., Каретникова Э.С., Иванова Т.А., Пакулев Н.А. Наружные мембраны холерного вибриона как потенциальный компонент химической вакцины // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1995. № 2. Приложение. С. 86–89. [Markov E.Yu., Urbanovich L.Ya., Golubinsky E.P., Chernov A.B., Karetnikova E. S., Ivanova T.A., Pakulev N. A. Outer membranes of the Vibrio cholerae as a potential component of a chemical vaccine. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii = Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology, 1995. no. 2, suppl., pp. 86–89. (In Russ.)]
  6. Патент № 2051969 C1 Российская Федерация, МПК6 С 12 Р 19/04. Способ получения бактериальных липополисахаридов; заявлено 1992.07.31: опубликовано 1996.01.10 / Марков Е.Ю., Николаев В.Б. / Патентообладатель: Иркут. н-и. противочум. ин-т Сибири и ДВ. 3 с. [Patent No. 2051969 C1 Russian Federation, Int. Cl.6 С l2 Р 19/04. Method of bacterial lipopolysaccharide preparing; application 1992.07.31: date of publication 10.01.1996 / Markov E.Ju., Nikolaev V.B. Proprietors: Irkutskij nauchno-issledovatel’skij protivochumnyj institut Sibiri i Dal’nego Vostoka. 3 p.]
  7. Патент № 2114436 C1 Российская Федерация, МПК6 G01N 33/52. Способ определения бактериальных липополисахаридов; заявлено 1996.05.06: опубликовано 1998.06.27 / Чернов А.Б., Марков Е.Ю. / Патентообладатель: Иркут. н.-и. противочум. ин-т Сибири и ДВ. 5 с. [Patent No. 2051969 C1 Russian Federation, Int. Cl.6 G01N 33/52. Method of assay of bacterial lipopolysaccharides; application 1996.05.06: date of publication 1998.06.27 / Chernov A.B., Markov E.Ju. Proprietors: Irkutskij nauchno-issledovatel’skij protivochumnyj institut Sibiri i Dal’nego Vostoka. 5 p.]
  8. Помогаева А.П., Уразова О.И., Ковширина Ю.В., Перевозчикова Т.В., Бармина С.Э. Клинико-иммунологические особенности псевдотуберкулеза у детей // Бюллетень сибирской медицины. 2006. № 4. С. 103–111. [Pomogayeva A.P., Ourazova O.I., Kovshirina Yu.V., Perevozchikova T.V., Barmina S.E. Clinical and immunological peculiarities of pseudotuberculosis at children. Byulleten’ sibirskoy meditsiny = Bulletin of Siberian Medicine, 2006, no. 4, pp. 103–111. (In Russ.)]
  9. Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III–IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней»; утв. постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 28 января 2008 г. № 4. [Sanitary and epidemiological rules SR 1.3.2322-08 “Safety of work with microorganisms of the III–IV pathogenicity (danger) groups and pathogens of parasitological diseases”; approved by the decision of the Chief State Sanitary Doctor of the Russian Federation approved on January 28, 2008. no. 4. (In Russ.)]
  10. Тимченко Н.Ф., Попов А.Ф. Псевдотуберкулез — прошлое и настоящее // Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение. 2014. № 4 (9). С. 51–56. [Timchenko N.F., Popov A.F. Pseudotuberculosis — past and present. Infektsionnyye bolezni: novosti, mneniya, obucheniye = Infection Diseases: News, Opinions, Training. 2014, no. 4 (9), pp. 51–56. (In Russ.)]
  11. Derbise A., Guillas C., Gerke C., Carniel E., Pizarro-Cerda J., Demeure C.E. Subcutaneous vaccination with a live attenuated Yersinia pseudotuberculosis plague vaccine. Vaccine, 2020, vol. 38, no. 8, p. 1888–1892. doi: 10.1016/j.vaccine.2020.01.014
  12. Dong W., Wang F., Zhang J., Zhou Y., Zhang L., Wang T. A simple, time-saving dye staining of proteins in sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel using Coomassie blue. Protein Gel Detection and Imaging, 2018, pp. 31–35. doi: 10.1007/978-1-4939-8745-0_5
  13. Fishman J.B., Berg E.A. Antibody purification and storage. Cold Spring Harbor Protocols, 2019, vol. 2019, no. 5, pp. 331–344. doi: 10.1101/pdb.top099101
  14. Gallagher S.R. One-dimensional SDS gel electrophoresis of proteins. Curr. Protoc. Cell Biol., 2007, vol. 37, no. 1, pp. 6.1.1–6.1.38. doi: 10.1002/0471143030.cb0601s37
  15. Hornbeck P. Double-immunodiffusion assay for detecting specific antibodies (Ouchterlony). Curr. Protoc. Immunol., 2017, vol. 116, pp. 2.3.1–2.3.4. doi: 10.1002/cpim.18
  16. Hu Y.F., Zhao D., Yu X.L., Hu Y.L., Li R.C., Ge M., Xu T.Q., Liu X.B., Liao H.Y. Identification of bacterial surface antigens by screening peptide phage libraries using whole bacteria cell-purified antisera. Front. Microbiol., 2017, vol. 8: 82. doi: 10.3389/fmicb.2017.00082
  17. Li H., Benghezal M. Crude preparation of lipopolysaccharide from Helicobacter pylori for silver staining and Western blot. Bio Protoc., 2017, vol. 7, no. 20: e2585. doi: 10.1094/MPMI-08-13-0248-R
  18. Tajhya R.B., Patel R.S., Beeton C. Detection of matrix metalloproteinases by zymography. Methods Mol. Biol., 2017, vol. 1579, pp. 231–244. doi: 10.1007/978-1-4939-6863-3_12
  19. Wang X., Zhang C., Shi F., Hu X. Purification and characterization of lipopolysaccharides. Subcell. Biochem., 2010, vol. 53, pp. 27–51. doi: 10.1007/978-90-481-9078-2_2
  20. Waterborg J.H. The lowry method for protein quantitation. In: Walker J.M. (ed.) The Protein Protocols Handbook. Springer Protocols Handbooks. Third Edition. Totowa, NJ: Humana Press, 2009, pp. 7–10. doi: 10.1007/978-1-59745-198-7_2
  21. Zubova S.V., Prokhorenko I.R. Use of colorimetric method for evaluation of LPS of different structure. Bull. Exp. Biol. Med., 2006, vol. 141, no. 6, pp. 765–767. doi: 10.1007/s10517-006-0274-1

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рисунок 1. Электрофоретическое разделение в 12% полиакриламидном геле препаратов, полученных мочевинной экстракцией из Y. pseudotuberculosis 3704. Примечание. 1 — маркер молекулярных масс, 2 — препарат наружных мембран, 3 — препарат мочевинного экстракта. Окраска Кумасси ярко-синим R-250.

Скачать (172KB)
Метаданные
3. Рисунок 2. Электрофоретическое разделение в 12% полиакриламидном геле препарата белковолипополисахаридного комплекса, полученного из мочевинного экстракта Y. pseudotuberculosis 3704. Примечание. 1 — маркер молекулярных масс, 2 — препарат белковолипополисахаридного комплекса. Окраска ионами серебра.

Скачать (30KB)
Метаданные
4. Рисунок 3. Тест радиальной энзимодиффузии полученных препаратов из Y. pseudotuberculosis 3704 в 1% агарозном геле с использованием в качестве субстрата желатина. Примечание. 1, 2, 3, 4 — препарат наружных мембран в концентрации 8, 6, 4, 2 мг/мл, соответственно; 5, 6, 7, 8 — препарат мочевинного экстракта в концентрации 2, 4, 6, 8 мг/мл соответственно; (K+) — положительный контроль (трипсин), (K–) — отрицательный контроль (контроль растворителя).

Скачать (25KB)
Метаданные
5. Рисунок 4. Субстратный электрофорез препаратов субклеточных фракций из Y. pseudotuberculosis 3704 в 12% полиакриламидном геле с использованием в качестве субстрата раствора желатина. Примечание. 1 — положительный контроль (трипсин), 2 — препарат наружных мембран, 3 — препарат мочевинного экстракта. Слева указано положение маркера молекулярных масс. Окраска Кумасси ярко-синим R-250.

Скачать (51KB)
Метаданные
6. Рисунок 5. Реакция иммунодиффузии антигенных препаратов, полученных из Y. pseudotuberculosis 3704 в 1% агарозном геле с коммерческой псевдотуберкулезной антисывороткой. Примечание. 1 — липополисахарид из водной фракции, 2 — препарат мочевинного экстракта, 3 — липополисахарид из фенольной фракции, 4 — препарат наружных мембран, 5 — коммерческая поливалентная псевдотуберкулезная антисыворотка (СПб). Окраска Кумасси ярко-синим R-250.

Скачать (38KB)
Метаданные
7. Рисунок 6. Реакция иммунодиффузии антигенных препаратов Y. pseudotuberculosis 3704 и микробных взвесей в 1% агарозном геле с экспериментальной кроличьей антисывороткой, полученной против препарата белковолипополисахаридного комплекса. Примечание. 1 — препарат наружных мембран, 2 — препарат белковолипополисахаридного комплекса, 3 — микробная взвесь Y. pseudotuberculosis 3704, 4 — микробная взвесь Y. enterocolitica 628, 5 — микробная взвесь S. typhi 21, 6 — микробная взвесь S. flexneri 1964, 7 — экспериментальная псевдотуберкулезная кроличья антисыворотка.

Скачать (36KB)
Метаданные
8. Рисунок 7. Дот-иммуноанализ препаратов и микробной взвеси Y. pseudotuberculosis 3704 с изолированными из экспериментальной антисыворотки антителами, полученными против препарата белковолипополисахаридного комплекса и меченными наночастицами коллоидного серебра. Примечание. 1 — микробная взвесь Y. pseudotuberculosis 3704, 2 — препарат наружных мембран, 3 — препарат белковолипополисахаридного комплекса.

Скачать (71KB)
Метаданные

© Крюкова А.В., Марков Е.Ю., Николаев В.Б., Попова Ю.О., Климов В.Т., Игумнова С.В., Андреевская Н.М., Уланская А.В., Загоскина Т.Ю., Чеснокова М.В., 2022

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 64788 от 02.02.2016.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах