Immuno-serological diagnostic tools particularly identifying pathogen antigens are the most important methods of pseudotuberculosis studies. The main immunodominant and species-specific antigens located in the surface structures of the bacterial cell are of practical interest. Thereby the aim of the work was to isolate and characterize biologically active surface structures of the pseudotuberculosis microbe. Here, the living cells of Y. pseudotuberculosis 3704 (O:1b) were lysed by using 9 M urea solution to extract antigens localized in the microbial surface structures. The subcellular fractions obtained such as outer membranes (OM), urea extract (UE) and isolated protein-lipopolysaccharide complex (PLPSC) are characterized by physical and chemical parameters. The protein content in the preparations ranged from 42% to 53%. The polypeptide band of the OM preparation, UE polypeptide and PLPSC for pseudotuberculosis microbe was presented by 14, 16 and 9 major polypeptides with molecular weight ranging from 13.9 kDa to 131.5 kDa, 13.5 kDa to 101.6 kDa, and 20.7 kDa to 66.6 kDa, respectively. Proteolytically active proteins and polypeptides were detected in isolated subcellular fractions (OM and UE) by using the radial enzyme diffusion test and substrate-gel electrophoresis found to be presented by 4 and 7 polypeptides with molecular weight ranging from 28.0 kDa to 118.0 kDa and 29.2 kDa to 97.7 kDa in the OM and UE preparation, respectively. The subcellular fractions obtained are capable to exhibit immunogenic activity after inoculation to experimental animals and antigenic activity while interacting with specific antibodies in the radial immunodiffusion (RID) assay and antibodies labeled with colloidal silver nanoparticles in dot immunoassay (DIA). OM and PLPSC preparations in DIA with immunoglobulins isolated from experimental antisera and labeled with colloidal silver nanoparticles were detected at a concentration of ≥ 0.12 μg/ml (dry weight), cells of strain Y. pseudotuberculosis 3704 at a concentration of ≥ 3, 9 × 106 m.c./ml, which is similar to the results of DIA with immunoglobulins isolated from commercial pseudotuberculosis antiserum (St. Petersburg) and labeled with nanoparticles of colloidal silver. Thus, the subcellular fractions of pseudotuberculosis microbe isolated by using urea as a lysing and decontaminating agent retain their antigenic and immunogenic properties and enzymatic activity suggesting about their potential benefits for use to improve early diagnostics of pseudotuberculosis.
К важным методам диагностики псевдотуберкулеза относятся иммуносерологические исследования, в частности, направленные на выявление антигенов возбудителя. Практический интерес представляют основные иммунодоминантные и видоспецифические антигены, расположенные в поверхностных структурах бактериальной клетки. В связи с этим целью работы явилось выделение и характеристика биологически активных поверхностных структур псевдотуберкулезного микроба. В работе проведен лизис живых клеток Y. pseudotuberculosis 3704 (O:1b) путем обработки их 9 M раствором мочевины с целью извлечения антигенов, локализованных в поверхностных структурах микроорганизма. Полученные субклеточные фракции — наружные мембраны (НМ), мочевинный экстракт (МЭ) и изолированный из него белковолипополисахаридный комплекс (БЛПК) — охарактеризованы по физико-химическим параметрам. Содержание белка в препаратах составило от 42 до 53%. Полипептидный спектр препарата НМ псевдотуберкулезного микроба представлен 14 мажорными полипептидами с молекулярными массами от 13,9 до 131,5 kDa, спектр МЭ — 16 полипептидами с молекулярными массами от 13,5 до 101,6 kDa, спектр препарата БЛПК — 9 полипептидами с молекулярными массами от 20,7 до 66,6 kDa. В изолированных субклеточных фракциях (НМ и МЭ) с помощью теста радиальной энзимодиффузии и субстратного электрофореза выявлены протеолитически активные белки и полипептиды. В препарате НМ таковыми явились 4 полипептида с молекулярными массами от 28,0 до 118,0 kDa, в препарате МЭ — 7 полипептидов с молекулярными массами от 29,2 до 97,7 kDa. Полученные субклеточные фракции способны проявлять иммуногенную активность при введении экспериментальным животным и антигенную активность при взаимодействии со специфическими антителами в реакции иммунодиффузии в геле (РИД) и антителами, меченными наночастицами коллоидного серебра в дот-иммуноанализе (ДИА). Препараты НМ и БЛПК в ДИА с иммуноглобулинами, выделенными из экспериментальных антисывороток и меченные наночастицами коллоидного серебра, обнаруживались в концентрации ≥ 0,12 мкг/мл (по сухому весу), клетки штамма Y. pseudotuberculosis 3704 — в концентрации ≥ 3,9 × 106 м.к./мл, что аналогично результатам ДИА с иммуноглобулинами, выделенными из коммерческой псевдотуберкулезной антисыворотки (Санкт-Петербург) и меченными наночастицами коллоидного серебра. Таким образом, изолированные при использовании мочевины в качестве лизирующего и обеззараживающего агента субклеточные фракции псевдотуберкулезного микроба сохраняют свои антигенные и иммуногенные свойства, ферментативную активность, что указывает на перспективность их использования для совершенствования ранней диагностики псевдотуберкулеза.