Геномный анализ вирулентности и антибиотикорезистентности штаммов Klebsiella pneumoniae

Полный текст

Введение

В настоящее время одним из наиболее распространенных оппортунистических внутрибольничных патогенов является Klebsiella pneumoniae, которая вызывает около трети инфекций, обусловленных грамотрицательными бактериями [27]. Среди штаммов K. pneumoniae выделяют два патотипа: классический (classical K. pneumoniae — cKp) и гипервирулентный (hypervirulent K. pneumoniae — hvKp). Большинство клебсиеллезных инфекций вызывают классические штаммы, которые являются оппортунистическими патогенами с низким уровнем вирулентности [3].

Наиболее распространенными инфекциями, связанными с K. pneumoniae, являются респираторные воспалительные процессы, инфекции мочевыводящих путей и хирургических ран, ассоциированные с оказанием медицинской помощи [10]. Факторами риска классических K. pneumoniae-инфекций считаются критический возраст (младенческий или пожилой), врожденные или приобретенные формы иммунодефицита, алкоголизм, сахарный диабет, хронические сердечные, почечные, легочные и неопластические заболевания [40].

Гипервирулентные штаммы K. pneumoniae способны вызывать внебольничные инфекции, даже у здоровых людей. Впервые обнаруженные в Азии, изоляты hvKp описаны как ведущая причина гнойных абсцессов печени [28]. Гипервирулентная K. pneumoniae, выделеннная из гнойных абсцессов печени способна метастазировать в отдаленные участки, приводя к менингиту, некротизирующему фасцииту и эндофтальмиту [38].

В качестве биомаркеров для дифференциации клинических изолятов hvKp от cKp могут быть использованы генетические детерминанты вирулентности, входящие в состав мобильных генетических элементов, в том числе плазмид. Детерминанты вирулентности hvKp включают: системы сидерофоров для приобретения железа, высокое содержание капсульных полисахаридов (гипермукоидность), принадлежность к капсульным типам K1 или K2 и токсин колибактин (табл. 1) [5].

 

Таблица 1. Исследуемые гены биомаркеров для идентификации hvKp

Table 1. Biomarker genes for hvKp identification

Ген Gene	Функция Function	Размер ампликона, п.н. Amplicon size, bp	Ссылка Reference
peg-344	Предполагаемый транспортер метаболитов Putative metabolite transporter	411	36
iroB	Синтез сальмохелина Salmochelin synthesis	585	36
iucA	Синтез аэробактина Aerobactin synthesis	556	44
rmpA	Регулятор мукоидного фенотипа (prmpA — плазмидная локализация) Regulator of mucoid phenotype (prmpA — plasmid localization)	332	29
	crmpA — хромосомная локализация crmpA — chromosomal localization	588	29
rmpA2	Регулятор мукоидного фенотипа (prmpA2 — плазмидная локализация) Regulator of mucoid phenotype (prmpA2 — plasmid localization)	455	29
uni-rmpA	Праймер, нацеленный на гомологичную область всех зарегистрированных вариантов генов rmpA (prmpA, prmpA2 и сrmpA) Primer targeting the homologous region of all reported rmpA gene variants (prmpA, prmpA2 and crmpA)	250	29
terB	Резистентность к теллуриту Resistance to tellurite	288	36
peg-589	Предполагаемая карбоксимуконолактон-декарбоксилаза Putative carboxymuconolactone decarboxylase	236	36
entB	Синтез энтеробактина Enterobactin synthesis	400	12
irp2	Синтез иерсиниабактина Yersiniabactin synthesis	230	36
iutA	Синтез аэробактина Aerobactin synthesis	920	12

 

Гипервирулентность K. pneumoniae можно определить как способность бактерий вызывать инвазивные инфекции после появления первичного очага инфекции у здоровых взрослых [8]. Инфекции, вызванные гипервирулентными штаммами K. pneumoniae, зачастую соотносятся с клинической картиной заболевания, поскольку пока не существует универсального маркера гипервирулентности [31]. Гипермукоидный фенотип часто определяют при помощи «стринг-теста»[35].

Понятия «гипермукоидный» и «гипервирулентный» часто используются в литературе как синонимы; однако не все штаммы K. pneumoniae с гипервирулентным фенотипом имеют гипермукоидные бактерии, и не все гипермукоидные изоляты приводят к инвазивному синдрому [8].

Первые штаммы hvKp обнаруживали преимущественно в Азии; они лишь изредка были устойчивы к антимикробным препаратам (АМП). Однако последние публикации указывают, что штаммы hvKp становятся более распространенными и чаще обладают множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) [14]. Появление изолятов K. pneumoniae с комбинированной гипервирулентностью и устойчивостью к резервным АМП, таким как карбапенемы, представляет серьезную опасность. При распространении устойчивости к АМП среди штаммов hvKp могут развиваться инфекции, трудно поддающиеся лечению, даже у здоровых взрослых. В случае если штаммы hvKp распространятся в медицинских учреждениях и будут вызывать инфекции у лиц с ослабленным иммунитетом, можно ожидать еще более высокую заболеваемость и смертность [14].

Поскольку обнаружение генов гипервирулентности не является частью процедур диагностической микробиологии, штаммы hvKp могут остаться незамеченными [14]. В то же время фенотипические тесты, такие как стринг-тест на гипермукоидность, имеют низкую чувствительность [29]. Клиническая диагностика и обнаружение hvKp являются сложной задачей и требуют молекулярного тестирования для надежной идентификации подобных штаммов [14].

Цель работы — выявление наиболее значимых комбинаций генетических маркеров вирулентности и антибиотикорезистентности для характеристики клинических изолятов K. pneumoniae.

Материалы и методы

Бактериальные изоляты. В работе исследовали 85 клинических штаммов K. pneumoniae, выделенных из проб биоматериала от госпитализированных пациентов ряда клиник Санкт-Петербурга. Все изоляты были выделены из различных видов клинического материала: крови, мочи, мокроты, желчи, отделяемого из брюшной полости, содержимого абсцесса. Идентификацию изолятов до вида проводили методом времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-ассоциированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-ToF MS) с использованием спектрометра Microflex LRF и программным обеспечением «Biotyper RTC» (Bruker Daltonik, Германия). Значения Score ≥ 2,0 использовали в качестве критерия надежной видовой идентификации.

Гипермукоидный фенотип исследуемых штаммов определяли при постановке «стринг-теста» [35] с использованием суточной культуры возбудителя.

Оценка чувствительности штаммов K. pneumoniae к антимикробным препаратам. В работе оценивали чувствительность штаммов к 9-ти наиболее актуальным для этих микроорганизмов антимикробным препаратам (АМП): аминогликозидам (амикацин), карбапенемам (меропенем), ингибиторозащищенным пенициллинам (ампициллин/сульбактам, амоксициллин/клавуланат), сульфаниламидам (ко-тримоксазол), хинолонам (ципрофлоксацин), цефалоспоринам (цефотаксим, цефепим). Резистентность к перечисленным АМП оценивали диско-диффузионным методом на агаре Мюллера–Хинтон (Himedia, Индия) с помощью дисков ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера в соответствии с рекомендациями EUCAST раздела «Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters» (версия 13.0) [15] и российскими клиническими рекомендациями «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам», версия 2018-03.

Определение чувствительности к колистину проводили методом серийных микроразведений согласно ГОСТ Р ИСО 20776-1-2010 в бульоне Мюллера–Хинтон (Himedia, Индия), приготовленного в соответствии с инструкцией производителя, в 96-ти луночных полистироловых планшетах (Медполимер, РФ). Для приготовления рабочего раствора колистина использовали субстанцию сульфата колистина (CAS Number 1264-72-8) в форме порошка (Sigma Aldrich, Германия). Колистин растворяли в стерильной дистиллированной воде до концентрации 12,8 мг/мл. Внесение раствора антибиотика в лунки планшетов осуществляли методом последовательных серийных двукратных разведений, при этом две последние лунки оставляли пустыми для положительного и отрицательного контролей. Результаты определения чувствительности интерпретировали в соответствии с рекомендациями EUCAST (версия 13.0) [15].

Секвенирование генома. Геномную бактериальную ДНК экстрагировали из клеточных колоний с использованием набора diaGene для выделения геномной ДНК из бактериальных клеток (Диаэм, Россия) и QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Хильден, Германия) в соответствии с инструкциями производителей. Для секвенирования геномов 75 изолятов K. pneumoniae брали по 500 нг ДНК бактерий и фрагментировали на приборе Covaris M220. Библиотеки ДНК готовили с помощью набора TruSeq DNA Nano (Illumina, США), с расчетом на средний размер вставки 550 п.н., по протоколу производителя. Секвенирование готовых библиотек осуществляли на приборе MiSeq с использованием набора MiSeq Reagent Kit v3. Чтение проводили с двух сторон по 300 п.н.

Прочтения подготовили к сборке с помощью Trim Galore (version 0.6.7), качество прочтений проверяли программой FastQC (version 0.11.9). Сборку геномов de novo производили в программе SPAdes (version 3.15.5) [33]. Качество сборки анализировали с помощью QUAST (version 5.2.0) [17].

Определение MLST-типов (multi-locus sequence typing) штаммов, выявление локусов вирулентности, ассоциированных c транспозоном ICEKp (ybt, clb, iro, rmpA), плазмидных локусов вирулентности (iro, iuc, rmpA, rmpA2) и генетических детерминант устойчивости к АМП (мутации, приобретенные гены и собственные β-лактамазы) осуществляли с помощью ПО Kleborate [22], Предсказание К и О серотипов проводили с помощью программы Kaptive [21, 43]

Мультилокусное сиквенс-типирование (MLST- типирование). MLST-типирование изолятов проводили по схеме Diancourt и соавт. [13]. Семь генов домашнего хозяйства (gapA, mdh, gpi, rpoB, inf, phoE и tonB) сравнивали с последовательностями, доступными в базе данных MLST K. pneumoniae (https://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella).

Результаты

Характеристика гипермукоидных свойств бактериальных штаммов. Среди 85 клинических изолятов K. pneumoniae на основании «стринг-теста» выявлено 28 (32,9%) изолятов с гипермукоидным фенотипом и 57 (67,1%) изолятов с классическим фенотипом.

Оценка чувствительности штаммов K. pneumoniae к антимикробным препаратам. Среди 85 изолятов K. pneumoniae 10,6% оказались панрезистентными (pandrug-resistant — PDR), то есть устойчивыми ко всем исследуемым АМП, в том числе к колистину. Указанные штаммы принадлежали к следующим сиквенс-типам: ST395, ST512, ST307, ST11 и ST23. Широкая лекарственная устойчивость (extensively drug-resistant — XDR), то есть отсутствие чувствительности по крайней мере к одному агенту из всех категорий АМП, наблюдалась у 41,2% штаммов. Эти штаммы принадлежали к следующим сиквенс-типам: ST13, S15, ST23, ST39, ST86, ST147, ST307, ST395, ST512. Множественная устойчивость (MDR), то есть устойчивость микроорганизма к АМП из трех различных групп, встречалась у 32,9% штаммов. Такие штаммы принадлежали к следующим сиквенс-типам: ST13, ST20, ST23, ST39, ST307, ST395, ST512, ST556, ST874 и др.

Детерминанты устойчивости к антимикробным препаратам на основании секвенирования генома. По результатам полногеномного секвенирования 75 изолятов K. pneumoniae у 81,3% были обнаружены гены резистентности к аминогликозидам, у 68,4% — к фторхинолонам, у 43,4% — к макролидам. Гены резистентности к фениколам были обнаружены у 72,4% штаммов, а к сульфаниламидам у 65,8% изолятов. Ген резистентности к рифампицину (arr-2) был характерен для 11,8% изолятов, к тетрациклину (tetA) — 35,5%, а гены устойчивости к триметоприму — 71,1% изолятов.

С помощью программы Kleborate исследовали частоту встречаемости генов карбапенемаз и β-лактамаз расширенного спектра (БЛРС) у штаммов K. pneumoniae (табл. 2).

 

Таблица 2. Частота встречаемости генов карбапенемаз и БЛРС у штаммов K. pneumoniae

Table 2. Prevalence of carbapenemase and ESBL genes in K. pneumoniae strains

Ген Gene	Частота встречаемости, % Prevalence, %
Приобретенные β-лактамазы Acquired β-lactamases
OXA-1	17,3
OXA-1, TEM-1D	17,3
TEM-1D	13,3
OXA-9, TEM-1D	2,6
БЛРС ESBL
CTX-M-15	54,7
CTX-M-3	1,3
CTX-M-55	1,3
ADC-11*, CTX-M-15, PER-1**	1,3
Карбапенемазы Carbapenemase
NDM-1	17,3
NDM-1, OXA-48	6,7
NDM-5	4,0
NDM-5, OXA-48	1,3
OXA-48	18,7
OXA-66	1,3
OXA-232	1,3
KPC-3	5,3
KPC-3, NDM-1	4,0
KPC-2, OXA-48	1,3

Примечание. *ADC — Acinetobacter Derived Cephalosporinase, относятся к ферментам класса С, **pER — Pseudomonas Extended Resistant.

Note. *ADC — Acinetobacter Derived Cephalosporinase, belongs to class C enzymes, **PER — Pseudomonas Extended Resistant.

 

На основании программы Kleborate оценивали индекс устойчивости (resistance score) исследованных штаммов к антимикробным препаратам:

0 — отсутствие БЛРС, отсутствие карбапенемаз (независимо от резистентности к колистину);

1 — наличие БЛРС, отсутствие карбапенемаз (независимо от резистентности к колистину);

2 — наличие карбапенемаз, отсутствие устойчивости к колистину (независимо от БЛРС или мутаций OmpK);

3 — наличие карбапенемаз и резистентности к колистину (независимо от БЛРС или мутаций OmpK).

Среди исследованных 75 штаммов K. pneumoniae индексом резистентности 3 обладали 5,3% штаммов, индексом 2 — 57,3%, индексом 1 — 18,7%, а индексом 0 — 18,7%.

Определение капсульных типов (К-типов). Гипервирулентные штаммы K. pneumoniae наиболее часто принадлежат к капсульным типам К1 и К2, которые обеспечивают вирулентные свойства клебсиелл в комбинации с другими детерминантами [1].

На основании данных полногеномного секвенирования были определены капсульные типы. Среди 75 исследованных изолятов 8% и 25,3% штаммов принадлежали к типу К1 и К2 соответственно. Были обнаружены другие капсульные типы hvKp: К20 — 2,6%, К57 — 9,2%, К64 — 2,6%. Остальные штаммы принадлежали к капсульным типам, характерным для классических клебсиелл (К3, К14, К15, К19, К23, К24, К39, К45, К62). В ходе исследования были обнаружены типы KL102, KL107, KL112, для которых соответствующие серологические типы капсул еще предстоит определить.

MLST-типирование. Гипервирулентные штаммы наиболее часто имеют следующие сиквенс-типы: ST23, ST57 (ассоциированы с капсульным типом К1), ST86, ST375 и ST380 (ассоциированы с капсульным типом К2) [37].

По результатам MLST-типирования идентифицировано 18 различных ST-типов для 74 исследованных изолятов, для одного изолята ST-тип определить не удалось (NA). Наиболее распространенные типы — ST395 (24,3%), ST23 (17,6%) и ST512 (9,5%). Также были обнаружены следующие типы: ST11 (1,4%), ST86 (6,8%, включая ST86–1LV, в котором один локус не соответствовал типу ST86), ST65 (1,4%), ST307 (6,8%).

Все штаммы K. pneumoniae капсульного типа K1 (n = 6) принадлежали к сиквенс-типу ST23. Для типа К2 12 изолятов принадлежали к ST395, 4 изолята — к ST86 (включая ST86–1LV), и по 1 штамму — к ST11, ST65 и ST380. Два штамма K20 принадлежали к ST147, семь изолятов K57 — к ST23 и два штамма K64 K. pneumoniae принадлежали к ST395 (табл. 3).

 

Таблица 3. Характеристика штаммов K. pneumoniae на основании принадлежности к сиквенс-типу и фенотипу гипермукоидности

Table 3. Characteristics of K. pneumoniae strains based on belonging to the sequence type and hypermucoid phenotype

Капсульный тип (N) Capsule type (N)	ST-тип ST type	N изолятов (%) | N isolates (%)
		Положительный стринг-тест Positive string test	Отрицательный стринг-тест Negative string test
К1 (6)	ST23	6 (8,1%)	0
K2 (19)	ST395	6 (8,1%)	6 (8,1%)
	ST86	2 (2,7%)	1 (1,35%)
	ST86–1LV	1 (1,35%)	0
	ST11	0	1 (1,35%)
	ST65	1 (1,35%)	0
	ST380	1 (1,35%)	0
K3 (3)	ST13	0	3 (4,1%)
K4 (1)	ST37	0	1 (1,35%)
K14 (1)	ST37	0	1 (1,35%)
K19 (4)	ST15	0	3 (4,1%)
	ST2237	0	1 (1,35%)
K20 (2)	ST147	1 (1,35%)	1 (1,35%)
K23 (4)	ST39	0	4 (5,4%)
K24 (4)	ST15	0	1 (1,35%)
	ST20	1 (1,35%)	0
	ST86	1 (1,35%)	0
	ST359	0	1 (1,35%)
K39 (4)	ST395	0	4 (5,4%)
K45 (2)	ST874	0	2 (2,7%)
K57 (7)	ST23	0	7 (9,45%)
K62 (2)	ST39	0	1 (1,35%)
	ST556	0	1 (1,35%)
K64 (2)	ST395	1 (1,35%)	1 (1,35%)
Другие типы | Other types KL102, KL107 (13)	ST307	0	5 (6,75%)
	ST512	2 (2,7%)	5 (6,75%)
	ST15	0	1 (1,35%)
Всего 74 Total 74		23 (31,05%)	51 (68,95%)

Примечание. K, KL –капсульный тип, N — количество изолятов, ST — сиквенс-тип.

Note. K, KL — capsule type, N — number of isolates, ST — sequence type.

 

Локусы вирулентности. На основании наличия генов, кодирующих иерсиниабактин (ybt), колибактин (clb) и аэробактин (iuc), оценивали индекс вирулентности (virulence score). В соответствии с программой Kleborate [22] индекс вирулентности варьируется от 0 до 5:

0 — отсутствие перечисленных генов;

1 — наличие иерсиниабактина;

2 — наличие иерсиниабактина и колибактина (или только колибактина);

3 — наличие аэробактина (без иерсиниабактина или колибактина);

4 — наличие аэробактина и иерсиниабактина (без колибактина);

5 — наличие всех трех генов вирулентности.

Среди 75 исследованных штаммов индексом вирулентности 5 обладали 10,7% штаммов, индексом 4 — 37,3%, индексом 3 — 25,3% штаммов, индексом 2 — 0%, индексом 1 — 21,3%, индексом 0 — 5,3%.

Обсуждение

Фенотипическая оценка чувствительности 85 клинических изолятов K. pneumoniae в нашем исследовании показала следующие результаты: PDR — 10,6%, XDR — 41,2%, MDR — 32,9%. Среди них резистентностью к колистину обладали 23,5%, к карбапенемам — 64,7% штаммов. В работе по исследованию антибиотикорезистентности изолятов K. pneumoniae, выделенных из крови больных COVID-19 [4], чувствительными к АМП были только 4% изолятов.

Устойчивость к карбапенемам может быть опосредована продукцией карбапенемаз или сочетанием нарушения экспрессии порина на внешней мембране и продукции различных β-лактамаз [20]. Карбапенемазы могут придавать штаммам резистентность практически ко всем известным β-лактамным АМП. В исследовании продукции карбапенемаз нозокомиальными штаммами в Санкт-Петербурге [2] наиболее часто обнаруживали карбапенемазы NDM-1, реже OXA-48 и KPC-2. По результатам проведенной нами работы самыми распространенными генами карбапенемаз были гены OXA-48 (18,7%) и NDM-1 — 17,3% штаммов, а в 6,7% штаммов гены NDM-1 и OXA-48 присутствовали одновременно.

Доля штаммов с генами β-лактамаз CTX-M-15 в нашем исследовании составила 54,7%, OXA-1 — 17,3%, TEM-1D — 13,3%, и в 17,3% случаев в штаммах одновременно присутствовали гены OXA-1 и TEM-1D.

K. pneumoniae обладает всеми известными механизмами устойчивости грамотрицательных бактерий к хинолонам [34], включая модификацию гена-мишени, защиту мишени, активное выведение АМП (эффлюкс) и инактивацию ферментами. В проведенном нами исследовании гены резистентности к хинолонам встречались у 68,4% штаммов. Самыми распространенными генами были qnrS1 (40% штаммов) и qnrB1 (22,7%).

Гипервирулентность штамма часто ассоциирована с гипермукоидностью. Бактериальная слизь является прямым следствием того, что происходит сброс капсульного материала во внеклеточную среду, а значит, гипермукоидность штамма связана с уровнем продукции капсульных полисахаридов [5]. По результатам нашего исследования 32,9% изолятов K. pneumoniae обладали гипермукоидным фенотипом на основании стринг-теста. Данные штаммы вызывали следующие заболевания: флегмону, пневмонию, сепсис, перитонит. В статье Luo с соавт. 29% клинических изолятов, вызывающих первичный абсцесс печени, не проявляли гипермукоидного фенотипа, связанного с hvKp [26]. Данные результаты предполагают, что гипервирулентный фенотип не имеет прямой зависимости от гипермукоидности. Следовательно, гипервирулентность должна определяться не только фенотипом, но также генотипом и клиническими характеристиками инфекции. Другими словами, гипервирулентность выходит за рамки капсульного серотипа и положительного стринг-теста [26]. Однако стринг-тест является сигналом того, что клинический изолят может быть гипервирулентным. Таким образом, отсутствие гипермукоидности не исключает гипервирулентность штамма [8].

У K. pneumoniae существует большое внутривидовое разнообразие структуры геномов, для классификации которых используется многолокусное типирование последовательностей (MLST) [13]. Полученные в результате классификации типы последовательности (ST) являются клинически значимыми [11].

По результатам проведенной нами работы наиболее распространены следующие сиквенс-типы: ST395 (24,3%), ST23 (17,6%) и ST512 (9,5%). Также обнаружены следующие типы: ST11 (1,4%), ST86 (6,8%, включая ST86-1LV, в котором один локус не соответствовал типу ST86), ST65 (1,4%), ST307 (6,8%). Все штаммы, принадлежащие к ST23 K1 (8,1%), обладали положительным стринг-тестом, а все штаммы ST23 K57 (9,45%) обладали отрицательным тестом на гипермукоидность. Штаммы, относящиеся к капсульным типам K3, K4, K14, K19, K23, K39, K45, K57, K62 в 100% случаев демонстрировали отрицательный стринг-тест.

Среди штаммов с ST23 один был устойчив ко всем исследуемым АМП (пан-резистентный), три изолята были устойчивы ко всем АМП, за исключением одного (колистина или ко-тримоксазола), и 6 штаммов проявляли множественную лекарственную устойчивость. PDR штамм ST23 принадлежал к капсульному типу K57 и обладал генами резистентности к аминогликозидам (aac(6’)-Ib; rmtF), фторхинолонам (qnrB1), фениколам (catA1), рифампицину (arr-2), а также генами β-лактамаз OXA-48 и CTX-M-15.

Другой идентификатор hvKp — тип капсулы (K). В результате полногеномного секвенирования нами были определены капсульные типы клинических изолятов K. pneumoniae. Среди 75 исследованных штаммов 8% и 25,3% штаммов принадлежали к типу К1 и К2 соответственно. Были обнаружены другие капсульные типы hvKp: К20 — 2,6%, К57 — 9,2%, К64 — 2,6%. Остальные штаммы принадлежали к капсульным типам, характерным для классических клебсиелл (К3, К14, К15, К19, К23, К24, К39, К45, К62). В ходе исследования были обнаружены типы KL102, KL107, KL112, для которых соответствующие серологические типы капсул еще предстоит определить.

Хорошо охарактеризованные детерминанты вирулентности у K. pneumoniae включают локусы синтеза поликетидов ybt и clb (также известные как pks), кодирующие сидерофоры иерсиниабактин и генотоксин колибактин соответственно. Эти локусы расположены в мобильном генетическом элементе ICEKp, который является наиболее распространенным генетическим элементом, связанным с вирулентностью K. pneumoniae [22]. В исследовании, посвященном генетическому разнообразию мобильного элемента ICEKp [22], локус ybt был обнаружен в 40% геномов K. pneumoniae среди штаммов, связанных с инвазивными инфекциями. Локус clb присутствовал в 14% всех геномов K. pneumoniae (38,4% геномов ybt+).

В проведенном нами исследовании локус ybt был характерен для 69,3% изолятов и был ассоциирован с 7 различными интегративными мобильными элементами ICEKp и одной плазмидой, а локус clb присутствовал в 10,7% штаммов. Самыми распространенными мобильными элементами были ICEKp4 (n = 10) и ICEKp10 (n = 8). Мобильный элемент ICEKp10 также несет локус генотоксина колибактина (clb) и вероятно связан с гипервирулентными штаммами. Таким образом, мобильные генетические элементы, несущие ybt и clb, свободно циркулируют в популяции K. pneumoniae, в том числе среди штаммов с множественной лекарственной устойчивостью. Данные локусы следует рассматривать как мишень для геномного надзора вместе с детерминантами антибиотикорезистентности [22].

Другие важные кластеры генов вирулентности кодируют биосинтез сидерофоров аэробактина (iuc) и сальмохелина (iro), связаны с инвазивными заболеваниями и распространены среди гипервирулентных клонов K. pneumoniae, вызывающих тяжелые внебольничные инфекции, такие как абсцесс печени и пневмония [24]. В ходе работы были определены ассоциированные с плазмидой локусы iuc (73,3%) и iro (14,7%). Линия iuc1 была наиболее распространенным вариантом локуса iuc (n = 54). Данный локус обычно располагается на плазмиде вирулентности KpVP-1 (pLVPK и pK2044-подобные плазмиды) [24]. Другая линия iuc2 связана с плазмидой KpVP-2 (Kp52.145pII-подобный) [24] и была обнаружена в одном штамме (ST380, K2).

Гены rmpA и rmpA2 связаны с гипермукоидным фенотипом, который является признаком вирулентности, часто наблюдаемым у гипервирулентных штаммов K. pneumoniae. Недавняя работа [41] показала, что rmpA служит регулятором транскрипции для генов rmpD и rmpC, и вместе эти гены составляют локус rmpADC. Ген rmpC участвует в усилении экспрессии капсулы, в то время как rmpD связан с гипермукоидностью. По результатам работы ген rmpA был характерен для 49,3% изолятов, а ген rmpA2 — для 58,7%.

Мы обнаружили 44 случая (58,7% штаммов) генотипической конвергенции вирулентности и антибиоткорезистентности, на что указывает одновременное наличие локуса аэробактина (iuc) и генов β-лактамаз или карбапенемаз. Среди них встречались как штаммы, принадлежащие к гипервирулентным сиквенс-типам (ST11, ST23, ST86), которые приобрели генетические детерминанты антибиотикорезистентности, так и множественно-резистентные штаммы с приобретенными плазмидами вирулентности. По литературным данным штаммы K. pneumoniae с множественной лекарственной устойчивостью принадлежат к ST17, ST101, ST258, ST307 [19, 32]. По результатам секвенирования нами были обнаружены клинические изоляты (n = 5), принадлежащие к ST307, с приобретенным интегративным мобильным элементом ICEKp4. Данные штаммы обладали также генами карбапенемаз (NDM-1, OXA-48) и β-лактамаз (CTX-M-15).

Среди конвергентных штаммов с сиквенс-типами hvKp два штамма были устойчивы ко всем исследуемым антибиотикам, шесть штаммов проявляли экстремальную лекарственную устойчивость (5 из них сохраняли чувствительность к колистину и 1 — к ко-тримоксазолу) и шесть штаммов являлись множественно-устойчивыми.

Детерминанты устойчивости к АМП и детерминанты вирулентности обычно мобилизуются на плазмидах, поэтому их конвергенция внутри отдельных штаммов не является неожиданной. Мозаичная природа плазмид K. pneumoniae создает риск конвергенции детерминант резистентности и вирулентности в пределах одной плазмиды. Такие векторы hv-АБР могут распространяться среди клинических штаммов и придавать им способность вызывать серьезные инфекции у здоровых людей с очень ограниченными вариантами лечения [23].

Идентификация hvKp как инфекционного агента имеет большое значение. Если инфекция вызвана hvKp, это может указывать лечащему врачу на необходимость проведения дополнительных исследований (компьютерная томография (КТ) или магнитно-резонансная томография (МРТ)) с целью обнаружения трудно диагностируемых очагов инфекции [30]. Идентификация некоторых скрытых очагов инфекции (эндофтальмита, абсцесса головного мозга, предстательной железы, менингита) важна, поскольку режим дозирования АМП специфичен для каждого очага. Необходимы адекватные концентрации препарата для достижения оптимального результата лечения [25].

Гипермукоидный фенотип hvKp может вызывать затруднения при лечении абсцессов. Повышенная вязкость изолятов может препятствовать чрескожному дренированию и увеличивать вероятность закупорки катетера [32, 39]. Инфекция hvKp может быть связана с рецидивами [9, 16, 18, 42]. Когда hvKp идентифицируется как инфекционный агент, может потребоваться более длительный курс лечения, чтобы максимизировать показатели излечения и свести к минимуму рецидивы.

Таким образом, идентификация гипервирулентности может представлять ценную информацию для клинического ведения пациентов с hvKp-инфекциями.

Выводы

1. В результате геномного анализа вирулентности и антибиотикорезистентности клинических изолятов pneumoniae установлено, что 54,7% штаммов имели гены β-лактамаз CTX-M-15, а 68,4% — гены резистентности к хинолонам.
2. Фенотипическая оценка чувствительности к антибиотикам показала, что резистентностью к карбапенемам обладали 64,7% штаммов, а гипермукоидным фенотип характерен для 32,9% изолятов pneumoniae.
3. У 58,7% штаммов обнаружена генотипическая конвергенция вирулентности и антибиотикорезистентности, на что указывает одновременное наличие локуса аэробактина (iuc) и генов β-лактамаз или карбапенемаз.

Заключение

Таким образом, идентификация гипервирулентности может представлять ценную информацию для клинического ведения пациентов с hvKp-инфекциями. Поэтому очевидна необходимость разработки комплексного диагностического теста для одновременного скрининга множественно-устойчивых гипервирулентных штаммов K. pneumoniae.

Об авторах

А. А. Самойлова

ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера

Автор, ответственный за переписку.
Email: samoilova@pasteurorg.ru

младший научный сотрудник лаборатории биопрепаратов

Россия, Санкт-Петербург

Л. А. Краева

ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера; ФГБВОУ ВО Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова МО РФ

Email: samoilova@pasteurorg.ru

д.м.н., зав. лабораторией медицинской бактериологии; профессор кафедры микробиологии

Россия, Санкт-Петербург; Санкт-Петербург

Н. В. Михайлов

ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера; ФГБУ Национальный медицинский исследовательский центр имени В.А. Алмазова

Email: samoilova@pasteurorg.ru

к.м.н., старший научный сотрудник лаборатории биопрепаратов; доцент кафедры микробиологии и вирусологии института медицинского образования

Россия, Санкт-Петербург; Санкт-Петербург

А. Т. Саитова

ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера

Email: samoilova@pasteurorg.ru

лаборант-исследователь группы метагеномных исследований

Россия, Санкт-Петербург

Д. Е. Полев

ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера

Email: samoilova@pasteurorg.ru

к.б.н., старший научный сотрудник, руководитель группы метагеномных исследований

Россия, Санкт-Петербург

М. А. Вашукова

Клиническая инфекционная больница им. С.П. Боткина

Email: samoilova@pasteurorg.ru

к.м.н., зам. главного врача по развитию медицинской помощи

Россия, Санкт-Петербург

С. А. Гордеева

Клиническая инфекционная больница им. С.П. Боткина

Email: samoilova@pasteurorg.ru

врач-бактериолог высшей категории, зав. централизованной бактериологической лабораторией

Россия, Санкт-Петербург

Е. В. Смирнова

ФБУЗ Центр гигиены и эпидемиологии в городе Санкт-Петербурге

Email: samoilova@pasteurorg.ru

врач-бактериолог высшей категории, зав. бактериологической лабораторией

Россия, Санкт-Петербург

Л. И. Белятич

Городская больница № 14

Email: samoilova@pasteurorg.ru

врач-бактериолог высшей категории, зав. бактериологической лабораторией

Россия, Санкт-Петербург

А. С. Долгова

ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера

Email: samoilova@pasteurorg.ru

к.б.н., зав. лабораторией молекулярной генетики патогенных микроорганизмов

Россия, Санкт-Петербург

А. В. Шабалина

ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера

Email: samoilova@pasteurorg.ru

младший научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики патогенных микроорганизмов

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы